אנו מודים ס Burkhart, ג הופמן וסימון Gräßle לקבלת סיוע טכני מעולה והם אסירי תודה למ &#39;Ferg לעזרה בניתוח נתונים. אנו מודים גם ס Rastegar להערות ביקורתיות על כתב היד. אנו מכירים במימון על ידי Studienstiftung des deutschen Volkes (לMW), DFG (DI913/4-1) וBioInterfaces תכנית הלמהולץ בKIT.

1. הכן את העבודה דילול של הספרייה הכימית Predilute התרכובות של ספריית התרופה להיבדק (לדוגמא ה-FDA אישרה תרופות, ENZO מדעי חיים) לE3 (5 mM NaCl, 0.17 מ&quot;מ KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2) עם תחנת טיפול נוזל רובוטית (למשל multiprobe השני, 8 מחטים עם מתאם קצה לרשות, PerkinElmer). ריכוזים מתאימים 40 / מיליליטר מיקרוגרם לדוגמא בDMSO 3%, אבל זה יהיה תלוי בסוג של ספרייה בשימוש. הגדרות multiprobe השניה המקבילות לשלבים המתוארים להלן מפורטות בטבלת 1. הפרוטוקול המתואר בטבלה מאפשר ההכנה של ארבע צלחות aliquot במקביל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 aliquots μl של מניית הספרייה (2 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO) לצלחות עמוקות היטב (למשל פלייט 96, גם חפצים, סיבוב ובכן, 0.8 מיליליטר, ABgene). עמודות 1 ו 12 יש להשאיר ריקות - כל אלה יקבלו את הפקדים בתוך הצלחת החיוביות ושליליים. </li><l<html> i&gt; לוותר 490 μl של E3 עם DMSO 1% לaliquots מוכנים של הספרייה עם multiprobe השני. דילול מתבצע במחטים קבועות בלי עצות לרשותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של DMSO לעמודה 1 ו10 μl של פתרון dexamethasone 5 מ&quot;מ (DMSO) לעמודה 12 כפקדים בתוך הצלחת. הריכוז של DMSO בכל הבארות הוא כעת 3%, ריכוז dexamethasone בבארות ביקורת החיוביות הוא בE3 / 3 DMSO% 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם סדיני איטום דבקים DMSO עמיד. אחסן את הצלחות ב-80 ° C עד שימוש. </li></ol> 2. רבייה של דגי Reporter איסוף עובר מהשרצה טבעית של הזדווגויות בין קבוצת GRE: דג מהונדס לוק. להעלות את העוברים (לא יותר מ 60) ב9 סנטימטר צלחות פטרי המכילות בינוני E3 בתוספת 1 מ&quot;ג / מיליליטר של מתילן הכחול פטריות עד 4 ימים לאחר הפריה (DPF) בחממה ב28 ° C. שנה בינונית E3 באופן קבוע. כותרת &quot;&gt; 3. הכנת בלוציפראז בינונית (E3L) הכן את פתרון מניות וציפרין מימית של 50 מ&quot;מ על ידי הוספת DH 2 O לבקבוקון המכיל אבקת וציפרין. פתרון מניות זה יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. לדלל את מניות וציפרין לתוך מדיום E3 לריכוז סופי של 0.5 מ&quot;מ להשיג בינוני E3L. 4. הפץ זחלים ל96 צלחות גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טיפים פיפטה 1 מיליליטר עם שעם רחב על ידי ניתוק כ 5 מ&quot;מ של הקצה ובקצרה בוער קצוות החדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי בריכה מכמה צלבים על ידי שפיכה אותם בזהירות מצלחות פטרי לתוך כוס. קציר על 50 זחלים בכל פעם על ידי בעדינות לשפוך אותם על גבי מסננת (גודל נקבובית של 0.25 בקוטר מ&quot;מ) ומניח מייד את המסננת לתוך צלחת פטרי קטנה (בקוטר 5.5 סנטימטר) מלאות בינוני E3L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצה פיפטה שעמם רחב, להעביר 225 μl של מדיום המכיל זחל אחד בכל לבארות לבנה96 צלחת היטב (OptiPlate, PerkinElmer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הצלחות עם גיליונות איטום דבק (למשל TopSeal-, PerkinElmer) ודגירה אותם 28 מעלות צלזיוס למשך לילה. preincubation זה מונע הקלטה של שינויים זמניים בפליטת אור מייד לאחר תוספת של וציפרין, תופעה המתרחשת גם בתאים בתרבית 19. </li></ol> 5. טיפול תרופתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת המכילה דילול העבודה של הספרייה מ-80 ° C במקפיא כ -4 שעות לפני השימוש. בעדינות מערבולת הצלחת ומסובב אותו לזמן קצר בצנטריפוגה כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גיליונות איטום דבק מצלחות הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מכשיר pipetting 96 ערוץ מופעל ביד (למשל מפרק, סטיינברנר) פיפטה פתרון התרופה למעלה ולמטה 3 פעמים. אז aliquot 25 μl של דילול העבודה של הספרייה הכימית לתוך הבארות המכילות את הזחלים (עם הדוגמא לעיל, זהתוצאות בריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מיליליטר בE3 עם 0.3% DMSO). הכן 10 (מינימום: 5) צלחות העתק עם זחלים לכל צלחת ספרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הצלחות עם גיליונות האיטום דבקים ולתייג את כל צלחת עם מדבקה ברקוד. </li></ol> 6. הקלטת הארה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצלחות המכילות את הזחלים ליחידות לערום של קורא לדמיין פליטת אור ברגישות הארה משופרת (PerkinElmer). לחלופין, להשתמש במערכת חממת robotized כגון אלה המועסקים במערכות הקרנת תרבית תאים של יונקים בשילוב עם הקורא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא פליטת אור במשך יומיים תוך שימוש בהגדרות קורא מקבילים לאלו המתוארים בטבלה 2 לקורא לדמיין. להתאים את מספר חזרות assay למספר הצלחות בטווח כדי להתאים את זמן הריצה הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיום הריצה, לבדוק את הצלחות לנוכחותם של זחלים מתים כדי להעריך את הרעילות כללית של compounds. </li></ol> 7. ניתוח נתונים כל ניתוח הנתונים מתבצע בR סביבת תכנות הסטטיסטי באמצעות סקריפטים מותאמים אישית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב AUC על מנת לזהות תרכובות הפעלת GC איתות ללא קשר למאפייני הקינטית שלהם, לקבוע את השטח מתחת לעקומה (AUC) של העקבות נרשמו הארה (ספירות גלם פליטת אור לעומת זמן) כפרמטר ההקרנה. AUCs הם מקורבים לשלטון הטרפז (ראה 2a דמויות ו&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נורמליזציה התחבר להפוך את ערכי AUC כדי להבטיח נורמליות גבוהה יותר של נתונים (2b דמויות וב &#39;). ואז לנרמל את ערכי AUC היומן הפך לכל צלחת ספרייה עם שיטת Z-הציון החזקה (ראה 20). נורמליזציה התוצאה היא ערכים המייצגים את מספר סטיות תקן מהממוצע של כל נקודות הנתונים. בדרך זו,שגיאות שיטתיות, כגון השתנות בין ריצה, יוסרו מן הנתונים. כעת ניתן דמיינו את הנתונים על ידי התוויית Z-הציון הממוצע חזק של העתקים לכל טוב (2c הדמויות וג &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדי איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Heatmap על מנת להמחיש את ההשפעות צלחת קשורה, להתוות את הנתונים עבור כל צלחת כמו Heatmap באמצעות למשל פונקצית heatmap.2 של חבילת gplot 21. בדרך זו, ניתן לאתר השפעות קצה או לשאת על מתחם בקלות (לדוגמא להשוות איור 3 א עם 3 ב). תכלול צלחות תת אופטימליות מניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומת ROC כדי לקבוע את רגישות וסגוליות של assay, לחשב מקלט הפעלה למשל עקומה אופיינית (ROC) בעזרת חבילת BioConductor ROC 22 באמצעות ערכי Z-הציון שנקבעו ב( איור 3c) 7.2. בהמשך לכך, לקבוע את AUC של מ&quot;ק זהRVE. ערך AUC קרוב ל -1 מצביע על רגישות גבוהה וספציפיות של assay. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכה זיהוי כדי לייעל את ערך החתך לזיהוי של חומרים פעילים, לקבוע מדד Youden. כדי לחשב את המדד, יש להפחית את השיעור החיובי האמיתי המוערך (TPR) מהשיעור החיובי הכוזב (FPR) של עקומת ROC להגדלת ערכי חתך Z-ציון חזקים. קח Z-הציון חזק עם Youden המדד הגבוה ביותר (TPR מינוס FPR) כנקודת החתך. ניתן להעריך TPR / FPR על ידי זיהוי של בארות ביקורת חיוביות או של חומרים פעילים ידועים בספרייה. בעת השימוש בבקרה חיובית בארות לוודא שהם תואמים את כוח הלהיט הצפוי. </li></ol> 8. Retesting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך מחדש את תרכובות להיט חיוביות על ידי טיפול בזחלים עם דילולים סדרתי של התרכובות המתקבלות מספק שונה, תוך שימוש באותה ההקלטה ההגדרה שתוארה לעיל. להיטים אמיתיים צריכים לגרום להארהסימפוני בassay זה, באופן אידיאלי באופן תלוי מינון. </li></ol>

<ol>
	<li>Norris, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate Endocrinology. , (2007).</li><li>Kassel, O., Herrlich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+glucocorticoid+receptor+and+other+transcription+factors:+molecular+aspects.">Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects.</a> Mol Cell Endocrinol. 275, 13-29 (2007).</li><li>Baschant, U., Tuckermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+glucocorticoid+receptor+in+inflammation+and+immunity.">The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 69-75 (2010).</li><li>Schacke, H., Docke, W. D., Asadullah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+involved+in+the+side+effects+of+glucocorticoids.">Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids.</a> Pharmacol Ther. 96, 23-43 (2002).</li><li>De Bosscher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Glucocorticoid+Receptor+modulators.">Selective Glucocorticoid Receptor modulators.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 96-104 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nat Protoc. 4, 1422-1432 (2009).</li><li>Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+zebrafish.">Small molecule screening in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 3, 454-460 (2010).</li><li>Casals-Casas, C., Desvergne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors:+from+endocrine+to+metabolic+disruption.">Endocrine disruptors: from endocrine to metabolic disruption.</a> Annu Rev Physiol. 73, 135-162 (2011).</li><li>Grun, F., Blumberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+case+for+obesogens.">Minireview: the case for obesogens.</a> Mol Endocrinol. 23, 1127-1134 (2009).</li><li>Odermatt, A., Gumy, C., Atanasov, A. G., Dzyakanchuk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+glucocorticoid+action+by+environmental+chemicals:+potential+mechanisms+and+relevance.">Disruption of glucocorticoid action by environmental chemicals: potential mechanisms and relevance.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 102, 222-231 (2006).</li><li>Odermatt, A., Gumy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+and+mineralocorticoid+action:+why+should+we+consider+influences+by+environmental+chemicals.">Glucocorticoid and mineralocorticoid action: why should we consider influences by environmental chemicals.</a> Biochem Pharmacol. 76, 1184-1193 (2008).</li><li>Lohr, H., Hammerschmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+endocrine+systems:+recent+advances+and+implications+for+human+disease.">Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease.</a> Annu Rev Physiol. 73, 183-211 (2011).</li><li>Schaaf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+functional+glucocorticoid+receptor+beta-isoform+in+zebrafish.">Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish.</a> Endocrinology. 149, 1591-1599 (2008).</li><li>Schaaf, M. J., Chatzopoulou, A., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+for+glucocorticoid+receptor+research.">The zebrafish as a model system for glucocorticoid receptor research.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 75-82 (2009).</li><li>Alsop, D., Vijayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+stress+axis:+molecular+fallout+from+the+teleost-specific+genome+duplication+event.">The zebrafish stress axis: molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event.</a> Gen Comp Endocrinol. 161, 62-66 (2009).</li><li>Alsop, D., Vijayan, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+programming+of+the+corticosteroid+stress+axis+during+zebrafish+development.">Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 49-54 (2009).</li><li>Schoonheim, P. J., Chatzopoulou, A., Schaaf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+an+in+vivo+model+system+for+glucocorticoid+resistance.">The zebrafish as an in vivo model system for glucocorticoid resistance.</a> Steroids. 75, 918-925 (2010).</li><li>Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chemical+Screening+System+for+Glucocorticoid+Stress+Hormone+Signaling+in+an+Intact+Vertebrate.">A Chemical Screening System for Glucocorticoid Stress Hormone Signaling in an Intact Vertebrate.</a> ACS Chem Biol. 7, (2012).</li><li>Hirota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20746-20751 (2008).</li><li>Birmingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat Methods. 6, 569-575 (2009).</li><li>Warnes, G. R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> gplots: Various R programming tools for plotting data. 2.11.0, (2012).</li><li>Carey, V., Redestig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ROC: utilities for ROC, with uarray focus. , (2013).</li><li>Fan, F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening.">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 127-136 (2007).</li><li>Graf, S. F., Hotzel, S., Liebel, U., Stemmer, A., Knapp, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+fluidic+sorting+system+for+automated+Zebrafish+egg+sorting+into+multiwell+plates.">Image-based fluidic sorting system for automated Zebrafish egg sorting into multiwell plates.</a> J Lab Autom. 16, 105-111 (2011).</li><li>Letamendia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings.">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS ONE. 7, e36690 (2012).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

אנו מציגים כאן את העבודה וניתוח נתונים עבור מסך כימי מדידת פעילות GC in vivo באמצעות assay GRIZLY 18. יש assay מאפייני בקרת איכות ומדדי ביצוע שניתנים להשוואה עם מסכי סלולריים מבוסס קונבנציונליים, יתרון חשוב עבור השימוש בו בהגדרות תפוקה גבוהה. בנוסף לכך, עם זאת, vivo assay במזהה גם תרכובות שאינן נגישים במבחנת מסכים. זה בא לידי ביטוי על ידי הנוכחות של pregnenolone prohormone בין הלהיטים. לפיכך, assay GRIZLY מרחיב את היקף מסכי שמטרת פעילות איתות GC. החשיבות של זיהוי של in vivo אפקטים עם assay שלנו באה לידי ביטוי גם בתוצאות שהשגנו עם DBT מזהמי organotin וTBT 18. DBT, אבל לא TBT, הוכח לעכב איתות GC בתרבית תאים של יונקים, ואנו נצפו באותו בתרביות תאי דג הזברה לבטאing GRE: כתב לוק. חשוב לציין עם זאת, בassay GRIZLY, TBT הראה פעילות מעכבת על מסלול GC, כפי שהוא יכול להיות מומר לDBT על ידי חילוף החומרים הזחל. עיכוב זה נצפה כבר בריכוזים רלוונטיים לסביבה של TBT. תוצאות אלה נוספות להמחיש את הפוטנציאל של assay GRIZLY באיתור תופעות מורכבות, המבוססות על שיחה צולבת וחילוף חומרי שינויים בין אורגן של התרכובות בחי. הם גם מדגישים את פוטנציאל היישום של assay GRIZLY לניטור סביבתי. לפיכך, ניתן ללמוד אפקטי משבש אנדוקריני ברמה של איתות קולט, שבו המשבש מפריע לפעילות איתות GC הנגרמת על ידי אגוניסט GR כגון dexamethasone. אפשרות נוספת היא ללמוד השפעות מתחם על סינתזת GC-מגורה pregnenolone. איכות התפוקה הגבוהה של assay צריכה להתיר את ההקרנה המהירה של ספריות מדגם סביבתי. השימוש בלוציפראז כמו arגן eporter מאפשר טווח דינמי גבוה של זיהוי של איתות פעילות 23. ואכן, הרגישות של assay מאפשרת לזהות ייצור GC-Induced מתח האוסמוטי מזחלים בודדים 18. הרזולוציה הגבוהה הזמנית שהושגה עם הכתב בלוציפראז מאפשרת לנו לעקוב אחר פעילות איתות לאורך זמן, מה שהופך אותו ניתן לנתח גם קינטיקה של נתונים. חסרון פוטנציאלי עבור יישומים מסוימים הוא התאמתו המוגבלת לניטור המרחבי של מערכת הכתב הזה. מערכות כתב ניאון עשויות להיות מתאימות יותר עבור מבחני הדורשים ניטור של אזורים מסוימים של הזחלים. עם זאת, מבחני כאלה עלולים לסבול מרגישויות נמוכות יותר בשל השפעות רקע הנגרמות על ידי אור העירור, שגם מציב מגבלות על זיהוי של תרכובות ניאון. בנוסף, הם עשויים לספק פחות רזולוציה הקינטית בגלל היציבות בדרך כלל גבוהה יותר של חלבוני ניאון 23.יתר על כן, הם מציגים את האתגרים במונחים של ציוד הדמיה, ניתוח נתונים ואחסון נתונים שעשויים להגביל את השימוש בם למעבדות מחקר קטנות יותר. ההגדרה של assay GRIZLY כassay המבוסס צלחת microtiter מאפשרת אינטגרציה קלה לתוך זרימות עבודה הקרנה טיפוסיות. Assay הוא ישים בקלות גם במעבדות מחקר קטנות יותר כתוצאה מהטיפול שלה פשוט וניתוח נתונים. במקביל, היא מאפשרת למידה ניכרת של אוטומציה, למשל אוטומטית יישום תרופה על ידי pipetting רובוטים או הפצה אוטומטית של עוברים על ידי מכשירי עובר מיון 24,25. את ההודעה הפשוטה אינו דורש מיקרוסקופים הקרנה אוטומטיים או תוכנת ניתוח תמונה מתוחכמת, ועם זאת מספקת מערך עשיר של נתונים על היבטים של זמן וכמותי של מסלול האיתות למד. לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לassay הקרנה כימית זול יחסית, חזק וקל לידית לGCאיתות פעילות in vivo ובזמן אמת. Assay מאפשר קביעת in vivo השפעות של תרכובות בGC איתות לא ניתן לגילוי בתרבית תאים מבוסס מבחני. למשל הקביעה של השפעות גנטיות על איתות glucocorticoid, ניטור סביבתי של השפעות משבש אנדוקריני על סינתזת glucocorticoid ואיתות פעילות, וההקרנה של תרכובות להשפעות לא רצויות על איתות GC או לרומן במאפנני vivo מכך, בין יישומים רבים עבור assay הם מסלול איתות חשוב.

גלוקוקורטיקואידים (GCS) הם הורמוני סטרואידים המיוצרים על ידי בלוטת יותרת הכליה אשר ממלאות תפקידים חשובים בתגובת הלחץ ובויסות חילוף החומרים 1. GCS לאגד קולטני glucocorticoid cytoplasmic (GRS) של superfamily רצפטור הגרעיני אשר, על כריכה, translocate לתוך הגרעין 2. כאן, הם יכולים למשל לדכא שעתוק על ידי הפרעה עם גורמים אחרים שעתוק (transrepression) או להפעיל את שעתוק הגנים באמצעות אלמנטי glucocorticoid תגובה (Gres, transactivation). בשל התכונות אנטי דלקתית שלהם, GCS הטבעי והמלאכותי נמצא בשימוש נרחב תרופות לטיפול במספר המחלות, כגון אסטמה או דלקת פרקים 3. עם זאת, ובמיוחד שימוש לטווח ארוך של GCS יכול להוביל לתופעות לוואי קשים, כוללים סוכרת וגלאוקומה 4. לכן, תרכובות רומן מיקוד GC איתות עם יעילות טיפול שעלול להיות מועילה יותר וסבילות הן מאוד מבוקשים ומאחוראה. חשוב מכך, השפעות יגנד נצפו בתאים בתרבית יכולות להיות שונות מאלו שראו בvivo 5. תופעות כאלה עלולות תוצאות הטיה שהושגו עם תרבית תאים קונבנציונלית מבחני מיון תרופות מבוססות. הקרנת in vivo כימית כמו מופעל על ידי מודל דג הזברה הגיעה לאחרונה אל מוקד, שכן היא מאפשרת הקביעה של השפעות לא ניתן לגילוי בתא התרבות 6,7. יכולים גם להיות מושפעים מסלולי איתות הורמונלי על ידי מזהמים סביבתיים. כימיקלים שנקרא האנדוקרינית לשבש (EDCs) להשפיע על תהליכי הורמון מוסדר שונים 8. לפיכך, רבייה והתמיינות מינית של אורגניזמים החיים במים יכולים להיות מווסתת על ידי חומרים עם פעילות דמוית אסטרוגן. לאחרונה, חששות הועלו, כי הפרעות מטבוליות עשויות להיות קשורות לEDCs בסביבה 9. מסלול אחד הממוקד על ידי &quot;שיבוש מטבולים&quot; כזה הוא מסלול glucocorticoid, שגם היה מעורב בקסנוהשפעות biotics על התפתחות ותפקוד מערכת החיסון 10,11. עם זאת, בהשוואה לכמות הגדולה של מידע נגיש בתרכובות מפריעות לפעולה הורמון סטרואידי מין, יחסית מעט מאוד ידוע על השפעות הפרעה אנדוקרינית בתיווך באמצעות GR. לכן, יש צורך בכלים המאפשרים ניטור השפעות של מזהמים על איתות GC in vivo. דג הזברה כבר זמן רב מודל פופולרי בביולוגיה התפתחותית ולאחרונה גם משך חוקרים מתחומים אחרים, כולל אנדוקרינולוגיה 12. בהשוואה לבעלי חוליות אחרות, מערכת איתות GC של דג הזברה היא דומה יותר לזה של יונקים, שכן הגנום דג הזברה מכיל רק גן אחד GR בניגוד לקולטנים המשוכפלים בהרבה מיני דגים אחרים 13-15. בנוסף, הציר ההיפותלמוס, יותרת המוח, יותרת הכליה הוא כבר פונקציונלי בזחלי דג הזברה בן 5 ימים, אשר להגביר את ייצור GC אנדוגני בתגובה ללחצים 14,16-18. יש לנו לאחרונה שנוצרו קו מהונדס דג הזברה, GRE: לוק, המאפשר הניטור של פעילות איתות GC in vivo ו בזמן אמת 18. שורת נושא מבנה גן כתב לוציפראז תחת שליטה של אמרגן מינימאלי TATA תיבה וארבעה GRES concatemerized (איור 1 א). פליטת אור מושרה GC ניתן למדוד מGRE אחת: זחלי לוק ב96 צלחות microtiter גם in vivo על פני תקופות זמן ממושכות. assay זה GRIZLY (עבור &quot;תגובה בvivo דג הזברה בלוציפראז פעילות Glucocorticoid&quot;) ניתן להשתמש במספר תחומי מחקר שונים, כגון מחקר מתח, ניטור סביבתי, ומסכי תרופתיים 18. היינו מסוגל לזהות את עליית אנדוגני בקורטיזול לאחר לחץ האוסמוטי מזחלים בודדים ויכולים לעקוב אחר ההתבגרות של התגובה בזמן פיתוח. יתר על כן, אנחנו יכולים לעקוב אחר ההשפעות על איתות GC של organotinים שדורשים metabolization ידי הזחל. חשוב מכך, הקו היה מסוגל לזהות את ההשפעות הללו בריכוזים רלוונטיים לסביבה. לבסוף, במסך טייס assay ברגישות ובאופן ספציפי זוהה תרכובות עם פעילות GC מספרייה כימית, כולל מתחם אחד שמגורה ייצור קורטיזול אנדוגני בזחלים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למסכים כימיים באמצעות assay GRIZLY.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer composition + reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA approved drug library</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiprobe II</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>8 channel, equipped with disposable tip adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquidator 96</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
 <td></td>
			<td>hand-operated 96-channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision XCite Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasticware + consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Storage Plate</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0765</td>
			<td>round well, 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover films,</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>6018412</td>
			<td>self adhesive, DMSO resistent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
			<td>LRF-200L</td>
			<td>for liquidator 96, 200 &#956;l, low retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005299</td>
			<td>white opaque 96-well microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Labels</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1608182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered polypropylene IsoTip pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>S058.4809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRE:Luc fish</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ZDB-TGCONSTRCT-120920-1</td>
			<td>available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chemical screening procedure for glucocorticoid signaling with a zebrafish larva luciferase reporter system

הורמוני לחץ glucocorticoid ונגזרים המלאכותי שלהם נמצאים בשימוש נרחב תרופות לטיפול בדלקת, אבל טיפול ארוך טווח עם גלוקוקורטיקואידים יכול להוביל לתופעות לוואי חמורים. יש צורך במערכות בדיקה כדי לחפש תרכובות רומן המשפיעות על איתות glucocorticoid in vivo או לקבוע לוואי בלתי רצוי של תרכובות במסלול איתות glucocorticoid. הקמנו assay דג הזברה מהונדס המאפשר המדידה של פעילות איתות glucocorticoid in vivo ו בזמן אמת, assay GRIZLY (Glucocorticoid תגובה בvivo דג הזברה בלוציפראז פעילות). Assay מבוסס לוציפראז מזהה השפעות על איתות glucocorticoid עם רגישות גבוהה וספציפיות, כוללים השפעות על ידי תרכובות שתידרשנה metabolization או להשפיע על ייצור glucocorticoid אנדוגני. אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לביצוע מסכי כימיים עם assay זה. אנו מתארים רכישת נתונים, נורמליזציה, וניתוח, הצבת דגש על בקרת איכות ונתונים להדמיה. Assay מספק readout פשוט, זמן נפתר, וכמותי. זה יכול להיות מופעל כפלטפורמה עצמאית, אבל גם לשלב בקלות לתוך זרימות עבודה הקרנת תפוקה גבוהה. יתר על כן הוא מאפשר ליישומים רבים מעבר להקרנה כימית, כגון ניטור סביבתי של משבשים האנדוקרינית או מחקר לחץ.

בפרסום קודם 18, אנו הוקרנו ספרייה של 640 תרופות FDA במסך טייס כדי להעריך את הביצועים של assay GRIZLY. ספרייה זו הכילה 12 תום לב GCS, ובכך מאפשר לנו לקבוע מדדי איכות לרגישות וסגוליות של assay. איור 2 מראה דוגמאות טיפוסיות של ניתוח נתונים הגולמי והנורמליזציה נלקחה מהמסך הזה. תוצאה אופיינית משליטת dexamethasone גם מתוארת באיור 2 א, הממחישה את המידע הזמני שניתן על ידי נתונים. שיא בפליטת אור המתרחש בכ -12 שעות לאחר הטיפול יורד באיטיות על פני הבא 36 שעות של מדידה. איור 2 א &#39;מדגיש את הקירוב לערך AUC בשיטת הטרפז. חישוב זה מתבצע עבור כל הבארות וכל חוזר טכני. התוצאה של השינוי ביומן מוצגת איורים 2b &lt;/ Strong&gt; וב &#39;. הנה הממוצע של הבקרות החיוביות מותוות בעלילה QQ נורמלית. התחבר שינוי מוביל לקירוב רב יותר של נקודות נתונים לערכים מתפלגים נורמלי התיאורטי שצוינו על ידי האלכסונים האדומים. שינוי כדי להשיג את הנורמליות של הנתונים מגביר את הכוח הסטטיסטי של הניתוחים שלאחר מכן. לבסוף, 2c הדמויות ו2c &#39;להראות את ההשפעה של נורמליזציה Z-ציון חזק בהשתנות צלחת לצלחת: ערכי הבסיס השונים שהושגו עם צלחות שונות (איור 2 ג) הם מנורמלים בעלילת Z-הציון החזקה באיור 2 ג&#39;. ערכי Z-הציון חזקים יכולים לשמש כדי לזהות טעויות שיטתיות בנתונים על ידי הדמיה ההפצה של הלהיטים על פני הצלחות. איור 3 א מציגה דוגמא אחת לHeatmap של צלחת ספרייה, שבו Z-הציון חזק valUES הם זממו בצבעים לתפקידים טובים. אפשר בקלות מזהה עמודה 12 עם הבקרות חיוביות בצלחת. תרכובות ספריית ניקוד חיוביות נראות בF8 היטב ו, אם כי חלש יותר, 3 ב E2. איור מראה צלחת שבטעות שיטתית היא הווה. אחד מציין סדרה של תרכובות עם ירידה בערכי Z-ציון בשורות ו-E על פני כמה עמודים. אף אחת מהתרכובות בבארות אלה נבדק חיוביים בבדיקה מחדש. מאז הבארות עם פעילות מבחן זה של פחיתת GRIZLY ממוקמות לאורך שביל רובוט pipetting לוקח כאשר aliquoting צלחות הספרייה, תבנית זו מעידה על לשאת על של מתחם חיובי במהלך תהליך pipetting האוטומטי. הנורמליזציה Z-הציון החזקה יחד עם הנוכחות של GCS הידוע בספרייה גם אפשרה לנו לחשב מקלט הפעלת עקומה אופיינית (ROC) עבור המסך 18. איור 3 ג מציג עלילה של אסתיהזדווגו שיעור חיובי אמיתי נגד השיעור החיובי הכוזב המשוער לערכים חזקים שונים Z-ציון חתך. השיעור החיובי האמיתי המוערך מוגדר כאחוז מלהיטים חיוביים אמיתיים (כאן, גלוקוקורטיקואידים הידוע כיום בספרייה) הנמצאים בשווי חזק ניתנה Z-ציון חתך. השיעור החיובי הכוזב המוערך המקביל מצביע על אחוז של תרכובות שאינן חיוביות פגע בשווי חתך זה. AUC של עקומה זו הוא 0.95, מה שמעיד על רגישות וסגוליות גבוהות של המסך וביצועי assay מצוינים. עקומת AUC שימשה גם כדי להעריך את ערך החתך האופטימלי לזיהוי להיט על ידי חישוב מדד Youden לZ-ציונים חזקים שונים. אנחנו זיהינו את Z-הציון חזק של 1.49 כבעל מדד Youden הגבוה ביותר. ערך חתך זה מופיע באיור 2 ג &#39;כקו שחור שהפריד בין הלהיטים מחלק הארי של התרכובות. במסך שלנו18, הצלחנו לזהות GCS כמעט כל הידוע קיים בספרייה. רק שלוש מ12 GCS בתום הלב לא התגלו. במקרה של אצטט melengestrol, זה היה ממצא שלילי כוזב, שכן מתחם זה נמצא חיובי בבדיקה מחדש בריכוז גבוה יותר מזה המשמש בספרייה. שני GCS האחר היו שלילי גם בבדיקה החוזרת. Corticosterone הוא GC הגדול במכרסמים, אך לא בדגים או בני אדם 1, בעוד פרדניזון prodrug לא יכול להיות חילוף חומרים היטב על ידי מערכת הזחל. מעניין, גם שתי תרופות שאינן מבוארות כGCS זוהו במסך, מתוכם אחד לא יכול להיות מאושרת בבדיקה מחדש (ספירונולקטון, אנטגוניסט לרצפטור mineralocorticoid). המתחם האחר, pregnenolone, הוא מבשר ביוסינתזה סטרואידים, אשר מומרת לקורטיזול מבלוטת יותרת הכליה. ואכן, טיפול עם pregnenolone מגורה ייצור הקורטיזול בזחלים 18. כל תוצאות אלה מאשרות את ביצועים גבוהיםormance של assay: רק אחד שלילי כוזבת ומתחם אחד חיובי כוזב היו בין תוצאות המסך הראשי, ו10 של 11 תרכובות אישרו עם פעילות גירוי איתות GC כבר זוהו במסך הראשי. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig1.jpg" /> איור 1. עיקרון כללי של assay ואת זרימת עבודה של הליך המיון.) תכנית של לבנות כתב assay GRIZLY. ביטוי לוציפראז (צהוב) נשלט על ידי אמרגן מינימאלי (דקות P, כתום) וארבעת אלמנטי GRE concatemerized ((GRE) 4, לבן), שמאוגדים על ידי homodimers GR-הופעל ליגנד (GR, כחול). תיבות אדומות מצביעות אתרי transposase Tol2 המאפשרים אינטגרציה של המבנה לתוך הגנום. התיבה הוורודה מייצגת אתר poly-adenylation (PA). זחלים הטרנסגניים שנשאו קון זהstruct ממוקמים בצלחות microtiter גם 96 אטומות למדידות פליטת אור. ב) ערכה של תגובת לוציפראז. בלוציפראז מזרז החמצון של Luciferin לoxyluciferin, מה שמוביל לפליטת אור (hν). התגובה דורשת גם ה-ATP וMg 2 +, הניתן על ידי הזחל. אני PP, זרימת העבודה pyrophosphate. ג) של המסך. דילולים מניית עבודה מוכנים מן ה-FDA אישרה תרופה בספריית 96 צלחות היטב, עמודה אחת המכילה שלילית בתוך צלחת שליטה (DMSO בלבד, ירוק) ועמודה אחת המכילה ביקורת חיובית (דקסאמתאזון, אדום) (עיצוב ספרייה). GRE: זחלי לוק מופצים ב96 צלחות היטב (5-11 משכפל) וטופלו בתרכובות הספרייה (יישום תרופה). עקבות פליטת אור נרשמות עם קורא פליטת אור במשך יומיים (איסוף נתונים). עקבות פליטת אור משולבים (חישובי AUC), להיכנס והפכתי Z-ציון חזק מנורמל (normaliלאספקה). נתונים מנורמלים משמשים לקביעת מדדי איכות ולזיהוי להיט (ניתוח נתונים). להיטים נבחרו נבדקים מחדש לפעילות תלוית מינון בassay (החוזר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig2.jpg" /> איור 2. ניתוח נתונים מאויר עם נתונים ממסך של ה-FDA אישרה תרופת ספרייה. א) עקבות נציג מביקורת חיובית כן. &#39;) השטח מתחת לעקומה (AUC) מקורב לשלטון בצורת הטרפז. הטרפזים המשמשים לחישוב מוצגים בגוונים שונים של אדום. ב) עלילה רגילה QQ של ערכי גלם AUC של הבארות החיוביות שליטה (ציר y) לעומת אוכלוסייה (ציר x נורמלי סטנדרטי) לפני שינוי היומן. ב &#39; )<html> עלילת QQ נורמלית של ערכי AUC לאחר שינוי היומן. התפלגות נורמלית הוא הצביע על ידי הליניאריות של נקודות נתוני היומן השתנה. מגרש ג) ליומן הפך הנתונים גולמיים לכל נבדק במסך התרכובות. מגרש אפור, כל התרכובות האחרות ג &#39;) של נתוני מסך לאחר נורמליזציה Z-ציון חזק; כחול, גלוקוקורטיקואידים בתום לב.. שגיאות שיטתיות כגון וריאציות בין צלחת הוסרו מהנתונים. קווים אדומים מציינים את הממוצע ± SEM של חיובי בקרות בתוך הצלחת. קו שחור: פגע ערך חתך זיהוי כפי שנקבע על ידי אופטימיזציה של Youden המדד (איור 3). לשכפל באישור מ14 2012 ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> 0439fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. תוצאות מסך. א) Heatmap של תוצאות מסך. ערכי Z-ציון חזק של תרכובות ספרייה הם זממו לעמדות גם בהתאמה. הביקורת החיובית בטור 12 כמו גם שני מתחמי להיט חיוביים בבארות F8 וE2 גלויות. ב) Heatmap של צלחת מראה לשאת על של מתחם חיובי במהלך הכנת ספרייה עם רובוט pipetting. שיפוע של פעילות גלוי לאורך שביל pipetting נלקח על ידי הרובוט. ג) מקלט הפועל עקומה אופיינית (ROC) עבור המסך. השיעורים מוערכים נכונים החיוביים (ציר y השמאלי) ושווא השיעורים חיוביים (ציר x) הם זממו להגדלת ערכים חזקים Z-ציון חתך (מקודד לפי צבע, ציר y ימני). ערך AUC של העקומה וכתוצאה מכך הוא קרוב ל -1, המעיד על ביצועי assay טובים. תרכובות לוח לשכפל באישור מ14 2012 ACS. ד) מראה פעיל (Yellow) או לא פעיל (כחול) במסך הראשי (prim.) או במבחן החוזר. גלוקוקורטיקואידים בתום לב לא תמיד להערכה מחדש (לבן). מצויר מחדש באישור 14 2012 ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> הגדרות כלליות: </td></tr><tr><td colspan="4"> שלב 1.1 </td></tr><tr><td> נוהל </td><td> סוג: </td><td colspan="2"> נוזל אחת </td></tr><tr><td></td><td> מצב: </td><td colspan="2"> נשיפה </td></tr><tr><td></td><td> מחלק לכל לשאוב: </td><td colspan="2"> 1 </td></tr><tr><td></td><td> אופטימיזציה עבור מהירות: </td><td colspan="2"> כן </td></tr><tr><td></td><td> מערכת פערי אוויר: </td><td colspan="2"> 10 μl </td></tr><tr><td></td><td> תחבורה: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td> סומק / לשטוף </td><td colspan="3" width="426"> לא </td></tr><tr><td> לשאוב </td><td> סוג של הגדרה </td><td> ערך </td><td> הערות </td></tr><tr><td></td><td> עמדה </td><td> B7, B10, B13, B16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> לשאוב Vol. </td><td> 10 μl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מהירות </td><td> 200 μl / sec </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מעקב נוזלי </td><td> 60% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> גובה לשאוב </td><td> ברירת מחדל מעבדתי </td><td> 22.28 </td></tr><tr><td> לחלק </td><td> סוג של הגדרה </td><td> ערך </td><td> הערות </td></tr><tr><td></td><td> עמדות </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> לוותר Vol. </td><td> 10 μl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מהירות </td><td> 200 μl / sec </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מעקב נוזלי </td><td> 100 μl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> לוותר על גובה </td><td> ברירת מחדל מעבדתי </td><td> 17.01 </td></tr><tr><td colspan="4"> שלב 1.2 </td></tr><tr><td> נוהל </td><td> סוג: </td><td colspan="2"> מגיב </td></tr><tr><td></td><td> מצב: </td><td colspan="2"> פסולת </td></tr><tr><td></td><td> מחלק לכל לשאוב: </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td></td><td> אופטימיזציה עבור מהירות: </td><td colspan="2"> כן </td></tr><tr><td></td><td> מערכת פערי אוויר: </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 15 μl </td></tr><tr><td></td><td> תחבורה: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> סומק / לשטוף </td><td colspan="2"> לא </td></tr><tr><td> לשאוב </td><td> סוג של הגדרה </td><td> ערך </td><td> הערות </td></tr><tr><td></td><td> עמדה </td><td> A4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> לשאוב Vol. </td><td> 3 x 490 μl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> פערי אוויר </td><td> 15 ו0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מהירות </td><td> 200 μl / sec </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מעקב נוזלי </td><td> 400% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> גובה לשאוב </td><td> פני נוזל </td><td></td></tr><tr><td> לחלק </td><td> סוג של<html> etting </td><td> ערך </td><td> הערות </td></tr><tr><td></td><td> עמדה </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> לוותר Vol. </td><td> 490 μl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> פערי אוויר </td><td> 15 ו0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מהירות </td><td> 200 μl / sec </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מעקב נוזלי </td><td> 100% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> לוותר על גובה </td><td> ברירת מחדל מעבדתי </td><td> 17.01 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. הגדרות עבור multiprobe השני. הפרוטוקול בטבלה 1 מתאר את ההכנה של 4 צלחות (כל 96 בארות). הצלחות ממוקמות על מתאמי צלחת באזור עובד בתפקידים שצוין על ידי הרובוט (B7 למשל, B10, B13, B16). <html> 1 &quot;עבור: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="4"> הגדרות כלליות: </td></tr><tr><td colspan="2"> מספר חזרות assay </td><td colspan="2"> תלוי באורך של הריצה </td></tr><tr><td colspan="2"> מספר הצלחות </td><td colspan="2"> בלתי מוגבל </td></tr><tr><td colspan="2"> בקרת טמפרטורה </td><td colspan="2"> 28 ° C </td></tr><tr><td colspan="2"> פרוטוקול </td><td colspan="2"> חישובים </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> לום ארה&quot;ב 96 (CPS) לקרוא </td></tr><tr><td></td><td> זמן מדידה </td><td> 2.5 שניות </td><td rowspan="3"> תיקון crosstalk </td></tr><tr><td></td><td> מרחק בין צלחת וגלאים </td><td> 0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> זוהר גורם תיקון (CT2) </td><td> 0% </td></tr></tbody></table>תוכן &quot;&gt; הגדרות Envision טבלה 2. משמשות למסך.

Watch this Scientific Journal Video about A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System at JoVE.com

הליך סקר כימי לאיתות גלוקוקורטיקואידים עם מערכת מדווחת לוציפראז זחלי דג זברה | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

אנו מתארים את ההליך וניתוח נתונים של מערכת כימית הקרנה לאיתות הורמון לחץ glucocorticoid באמצעות זחלי דג הזברה: assay תגובה Glucocorticoid בvivo דג הזברה בלוציפראז הפעילות (GRIZLY). Assay ברגישות ובאופן ספציפי מזהה השפעות על איתות glucocorticoid ידי תרכובות שתידרשנה metabolization או להשפיע על ייצור glucocorticoid אנדוגני.

הליך מיון כימי לGlucocorticoid איתות עם מערכת כתב דג הזברה הזחל בלוציפראז

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

a-chemical-screening-procedure-for-glucocorticoid-signaling-with

Google

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Human Biology

Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.8K Views.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus North.  אנו מתארים את ההליך וניתוח נתונים של מערכת כימית הקרנה לאיתות הורמון לחץ glucocorticoid באמצעות זחלי דג הזברה: assay תגובה Glucocorticoid בvivo דג הזברה בלוציפראז הפעילות (GRIZLY). Assay ברגישות ובאופן ספציפי מזהה השפעות על איתות glucocorticoid ידי תרכובות שתידרשנה...

Video: A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג&#39;ין

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...