עבודה זו נתמכה על ידי גרנט-in-Aid למחקר מדעי בתחומים חדשניים &quot;Mesoscopic Neurocircuitry&quot; (מס &#39;22,115,002) ו&quot; מקיף ברשת מדעי המוח &quot;(מס 221S0003) של משרד החינוך, תרבות, ספורט, המדע, וטכנולוגיה, יפן ולגרנט-in-Aid למדענים צעירים (ב) (מס &#39;21,700,344) של יפן האגודה לקידום המדע (JSPs) HK

1. הכנת זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על לטוס קווי OK6-Gal4, כטב&quot;מ-ChR2 או OK6-Gal4, כטב&quot;מ-NpHR2 בבקבוקוני פלסטיק המכילים מזון זבוב סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרי מורחים דבק המכילים רשתית כל טרנס (ATR) בריכוזים מתאימים (1 מ&quot;מ לChR2, 10 מ&quot;מ לNpHR2 (&quot;NpHR&quot; בקיצור) על צלחת אגר מיץ תפוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים 2 nd או 3 זחלי instar Rd מהבקבוקונים ולשים אותם על הצלחת המכילה ATR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלהם אחורי של 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך תקופה מתאימה של זמן (יום 1 לChR2, 2 ימים לNpHR.) </li></ol> 2. התקנת מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מצלמת CCD (XCD-V60, סוני) למיקרוסקופ confocal קונבנציונלי (במקרה שלנו, FV1000, אולימפוס) עם קובץ מצורף C-Mount (הגדלה 0.35x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש תריס לאורך נתיב האור מהעדשה האובייקטיבית למצלמת CCD, שסוגרת בסריקת לייזר, להסיר אותו בזהירות. כצעד זה תלוי במייקרולהתמודד התקנה, פנה ליצרן מיקרוסקופ לקבלת תמיכה טכנית, במידת צורך. </li></ol> 3. בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את זחלי ATR-fed עם מים כדי להסיר את שארית אוכל מהגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הזחל על צלחת מצופה sylgard, צד עד הגבי (יש צד גב שני צינורות קנו נשימת הריצה longitudinally, אחד מכל צד של קו אמצע הגב). העובי של 5 מ&quot;מ sylgard הוא כ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס סיכת חרק (סיכות חרקים אוסטרליץ, Φ0.10mm, נירוסטה) לתוך הזנב בין הצינורות קנו נשימה עם מלקחיים (# 5 Inox, FST ידי דומונט, שוויץ). הפינים, שאורכו 10 מ&quot;מ, צריכים להיות כפופים או לחתוך להיות קצר מספיק (~ 2 מ&quot;מ ארוך) כדי להימנע מהפגיעה וניזק לפני השטח של העדשה האובייקטיבית. ואז לשים את סיכת החרק השנייה לראש של הזחל בסמוך לקרס הפה, המבנה דמוי טופר שחור בקצה הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מלח Ca 2 + ללא נורמלי (140 מ&quot;מ NaCl, 2 מ&quot;מ KCl, MgCl 2 6 מ&quot;מ, HEPES-NaOH 5,סוכרוז 36 מ&quot;מ (pH7.1)) כדי לשמור את הזחל לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן ליד הזנב במספריים מיקרו (MB-50-7, Napox, יפן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהחתך, לעשות חתך אורכי לאורך קו האמצע הגב לכיוון הראש. היזהר שלא לגרום נזק לחוט עצב הגחון (VNC) ואקסונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בראש רוחבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 4 סיכות בכל פינה של bodywall גזור. קיר הגוף צריך להיות מתוח מספיק כדי להמחיש דפוס מגזרי של קיר הגוף, אבל הרבה לא יותר מדי כדי לעכב את תנועת peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האיברים הפנימיים למעט המוח וVNC ולשטוף את המדגם עם Ca 2 + מלח רגיל חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הכיוון של חוט עצב הגחון להיות סימטרי בילטרלי על ידי שינוי העמדה והכיוון של סיכות חרקים על קיר גוף. כדי לתקן את המיקום של חוט עצב הגחון, הכנס סיכה דרך רקמות בין המוח והפה להתחבר אל sylgard. </li> &lt;li&gt; החלף את החיץ עם 2 מ&quot;מ Ca 2 + פתרון רינגר (130 מ&quot;מ NaCl, KCl 5 מ&quot;מ, MgCl 2 2 מ&quot;מ, CaCl 2 2 מ&quot;מ, HEPES-NaOH 5, סוכרוז 36 מ&quot;מ (pH7.3)). </li></ol> 4. הדמיה עם תאורת לייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף עדשה אובייקטיבית יבשה 4x (UPlanSApo 4x, NA 0.16, אולימפוס, יפן) במיקרוסקופ confocal ולהגדיר את הכנת הזחל על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבל תמונת שידור של ההכנה גזור עם לייזר אדום (633nm) כדי לאתר את חוט עצב הגחון על ידי מיקרוסקופ confocal. לסריקה זו, הקפד לא להשתמש בליזר או 488nm 559nm, אשר גורם לגירוי לא רצוי של ChR2 או NpHR, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האזור של עניין (ROI) על תמונת השידור. מצב מוגדל יכול להיות שימושי להגדרה מפורטת של ההחזר על ההשקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מערכת הסינון של מיקרוסקופ כדי להאיר באור 488nm או 559nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר את ההכנה עם מנורת הלוגן לדמיין את קיר הגוף. ההכנת דואר יכולה להיות במעקב עם מצלמת CCD מחוברת למיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט את התנועה של קיר הגוף ולעבור את קרן לייזר ברשת ומחוצה תוך ניטור התנועה. </li></ol>

<ol>
	<li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae.">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li><li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae:+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation.">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+control+of+genetically+designated+neurons+in+functioning+circuits.">Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+neuronal+activation+by+Channelrhodopsin-2+and+TRPA1+determine+behavioral+output+in+Drosophila+larvae.">Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae.</a> J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).</li><li>Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+teaching+laboratory:+using+channelrhodopsin-2+to+study+the+neural+basis+of+behavior+and+synaptic+physiology+in+Drosophila.">Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila.</a> Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).</li><li>Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+neural+circuits+responsible+for+Drosophila+larval+locomotion+with+halorhodopsin.">Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin.</a> PLoS One. 6, e29019 (2011).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).</li><li>Hildebrand, E., Dencher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photosystems+controlling+behavioural+responses+of+Halobacterium+halobium.">Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium.</a> Nature. 257, 46-48 (1975).</li><li>Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+long-lifetime+photointermediate+of+s-rhodopsin+is+a+receptor+for+negative+phototaxis+in+Halobacterium+halobium.">Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרעות זמנית ומקומיות של פעילות עצבית היא טכניקה לא יסולא בפז לניתוח דינמיקת הרשת של מעגלים עצביים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לתפעל את הפעילות עצבית על ידי optogenetics באמצעות לייזר. יווני גבוהות של לייזר מאפשרת גירוי optogenetic מקומי יותר מגירוי שדה הרחב באמצעות כספית או קסנון מנורה. למרות תאורות לייזר כבר הוחלו optogenetics במחקרים קודמים, מערכים מיוחדים כגון סיבי זכוכית, micromanipulator, ומקור לייזר, נדרשים במחקרים הקודמים ביותר. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במיקרוסקופיה confocal קונבנציונלית לתאורה מקומית. מאז הוא משמש את מערכת מיקרוסקופ confocal נרחבת, שיטה זו תפתח את ההזדמנות ליישם optogenetics ברזולוציה גבוהה יותר במעבדות רבות. יש הפרוטוקול שתי נקודות קריטיות: נתיחת הזחל וכוח לייזר. ראשית, אם המוח, חוט עצב הגחון או עצב מוטורי פגום דורינתיחת נג, הזחלים יפגינו פחות או תנועה ספונטנית peristaltic אף אחד. Precision לכן חיוני, במיוחד בעת ביצוע חתך בצד הגבי עם מספריים באביב והסרה איברים פנימיים עם מלקחיים. פרטים על הנתיחה כבר דווחו בעבר 21. שנית, אם גירוי מספק הוא להיות מושגת, כוח לייזר של כ 0.1 ~ 1 mW / 2 מ&quot;מ או 1 לChR2 נדרש ~ 10 mW / 2 מ&quot;מ לNpHR. הערכנו את כוח לייזר ככולל כוח האור מתחת לעדשה אובייקטיבית מחולקת בשטח מוערך של תאורה. אנחנו נמדדים כולל כוח האור באמצעות מד כוח (mobiken, Sanwa MI Technos, יפן). הערכנו את השטח של תאורה כקבועות פעמים חוזרים רבועות של אורך הגל של לייזר, אשר בערך נותן שטח מואר בגבול השתברות. כוח התאורה אפקטיבי על המדגם יכול להיות מותאם לא רק על ידי כוחו של פלט לייזר, אלא גם על ידי שינוי המהירות ותחושת הסריקהאה של חזרות. אנחנו סרקנו לייזר עם 20-100 פיקסל μsec / ל63 פעמים. בנוסף, רמת הביטוי של חלבון optogenetics והסכום של ATR הן גם קריטית ליעילות גירוי. בהתאם לכך, אם זחלים לא הראו תגובת optogenetic, יש לבדוק את הנקודות הבאות ותיקן: 1) כוח לייזר (על ידי אופטימיזציה של מערכת מיקרוסקופ), 2) רמת ביטוי של חלבון optogenetics (על ידי בדיקת גנוטיפ וטמפרטורת גידול), ו 3) הסכום של ATR (על ידי התאמת ריכוז של ATR ומאכיל את התקופה). NpHR דורש ריכוז גבוה יותר של ATR מאשר ChR2 עושה על ידי 13 מסיבות לא ידועות. ChR2 עובד היטב בזחלים גודלו במזון המכיל פחות ATR (לדוגמה 0.1 מ&quot;מ) מאשר שתואר כאן (1 מ&quot;מ). כהאכלת זחלים לATR 1 מ&quot;מ מספיק להכנת ChR2 צילום תגובתי, אנו ממליצים לריכוז זה המשפט הראשון בChR2 ניסויים. הריכוז של ATR לאחר מכן ניתן טיטרציה למטה מ 1 מ&quot;מ. מבחינת משך חשיפה לATR, אנו ממליציםהמשך מתואר כאן לבקרה חזקה optogenetic. לעתים קרובות אנו לא הצלחנו להתבונן תגובת optogenetic כאשר האכלת זחלים לATR למשך זמן קצר יותר. בפרוטוקול זה, תאורת לייזר ורכישת תמונה המופעלות על ידי מחשב נפרד. לכן, זיהוי ברור של דפוס spatiotemporal של תאורת לייזר על ידי מצלמת CCD הוא קריטי לניתוח נתונים. אם כתם לייזר או קו הוא עמום על תמונת CCD, אתה צריך לייעל את כוחה של מנורת הלוגן וערך רווח של מצלמת CCD לדמיין את תאורת לייזר, תוך שמירה על קיר גוף גלוי. תאורת spatiotemporal שמוצגת בפרוטוקול זה מספק מידע על מעגלים מוטוריים זחל, עם זאת, יש כמה מגבלות השיטה. אשר להיבט &quot;מרחבי&quot;, המיקום של התאורה שתועד על ידי תמונת CCD ההגדלה נמוכה המשמשת לצילום וידאו תנועות גוף קיר. בהתאם לכך, ניתן להקצות שטח תאורה ברמת מגזר, אבל לא ברמה תאית. באשר ל&quot; לא&quot;היבט, פער זמן בין emporal מיתוג על ידי סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal ותאורה על ידי לייזר תלוי במערכת מיקרוסקופ confocal ומצב סריקה. כתוצאה מכך, כמה בדיקות על ידי ניסוי וטעייה נדרשת כדי להתאים את תזמון תאורה. מאז העיתוי של הארה יכול ייקבע בסרטי CCD תמונה באמצעות תוכנה מתאימה כמו ImageJ, הגורם הקריטי בהחלטה זמנית הוא במסגרת שיעור של מצלמת CCD הדמיה. אנחנו בדרך כלל להגדיר את המסגרת דולר ל7.5-15 פריימים לשנייה. התקדמות בכלים optogenetic לספק לנו הזדמנות לשנות את הפרוטוקול זה. אנחנו השתמשנו 3 rd זחלי instar בעל OK6-Gal4 וכטב&quot;מ-ChR2 [H134R] או כטב&quot;מ-NpHR2. כלים optogenetic אחרים במקום ChR2 [H134R] או NpHR2 כגון ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 או קשת יכולה להגביר את היעילות של השליטה בפעילות 22. בנוסף, באמצעות Gal4 קווים אחרים או ניתוח בשלבי התפתחות אחרים יכול לספק מידע נוסף על המנוע circui<html> TS. בפרוטוקול זה, פעילות המוטורית הייתה פיקוח על ידי תמונות שידור של התכווצות bodywall עם מצלמת CCD. הפעילות של הנוירונים מוטוריים הקרינה עם מולקולות סידן רגישות (למשל GCaMP) יכולה גם להיות במעקב באופן ישיר תוך מניפולציה פעילות עצבית עם ChR2 או NpHR. במקרה זה, תאורת אור כחולה באזור רחב ומצלמת CCD רגישה מאוד (EMCCD מצלמה למשל) משמשות במקום מנורת הלוגן ומצלמת CCD הרגילה שתוארה קודם לכן במסמך זה. כדי לשפר את הרזולוציה המרחבית של גירוי תוך תנועת bodywall ניטור, תוך שימוש בעדשת מטרה נוספת עשויה להיות שיטה מתקדמת יותר: תאורה של חוט עצב הגחון על ידי עדשה אובייקטיבי ההגדלה גבוהה (למשל 40X) מלמעלה ומדגם bodywall ניטור על ידי עדשת ההגדלה נמוכה (לדוגמה: 4x) להלן המדגם. מערכת עדשות כפולה זה עשויה לאפשר לנו לעורר את מערכת עצבים ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר. &quot;Jove_content&quot;&gt; הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מיושם על מעגלים עצביים אחרים, יכולים לבוא לידי ביטוי כלים optogenetic ניתנים במערכת העצבים, וניתן להקים בי הכנה מספיק אור יכול להיות מועברת לתוך הרקמה העצבית.

תנועה קדימה peristaltic בזחלים תסיסנית מתרחשת על ידי ההפצה של התכווצות שרירים מאחוריים למגזרים קדמיים. תנועה זו מתממשת על ידי הפעלה רציפה של הנוירונים מוטוריים בחוט עצב הגחון לאורך ציר אורך הגוף. כדי לבחון את המעגלים מאחורי פעילות הפצת דוגמת זו, הפרעות מקומית של פעילות עצבית יכולה להיות גישה אינפורמטיבי. למרות assay התרופתי יכול לשלוט בחומר מסוים, כגון מוליכים עצביים, ברקמה עצבית, ההשפעה של תרופות תרופתיות יכולה להיות דומה בין המגזרים, כי כמעט כל חוט עצב הגחון הזחל הוא מבנה חוזר על עצמו מורכב מneuromeres דומה לאורך ציר האורך. לחלופין, אפשר להביע optogenetic או מולקולות בדיקה רגישות טמפרטורה במספר קטן של מגזרים. עם זאת, Gal4 קווים ספציפיים כאלה קשים מאוד לייצר. כאן אנו מציגים שיטה למניפולציה בתאי עצב מעטים צינוקments באמצעות תאורת לייזר. ניצול של התאורה מרחבית מרותק במיקרוסקופיה confocal, אפשר לטרוד את הפעילות של תאי עצב באזור מקומי. בשילוב עם דפוס הביטוי של החללית על ידי תת קבוצות של Gal4 קווי נוירון ספציפיים, שיטת תאורת לייזר זה משפרת באופן משמעותי ברזולוציה מרחבית להפרעות. ומכיוון ששיטה זו דורשת רק מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, רכישת ציוד מעבדה נוספת שלו בדרך כלל לא הכרחית. שימוש בטכניקה זו, בדקנו את התפקיד של פעילות עצבית מוטורית במהלך ההתפשטות של מנוע פלט 13. על ידי חסימת פעילותם של הנוירונים מוטוריים בתוך כמה מגזרים בזמן תנועת peristaltic, היינו יכול לבחון האם הפעילות של תאי עצב מוטוריים עצמם נדרשת להתפשטות של אות הפלט המוטורית. מצור מקומי וזמני של הנוירונים מוטוריים נעצר ההתפשטות של תנועת peristaltic. לאחר המצור הוסר, פרוpagation הופיע בקטע שבו הגל נעצר. תופעה זו מצביעה על כך שללא הפעלה עצבית מוטורית, גל propagative לא יכול להתקדם לאורך חוט עצב הגחון הלאה, ובכך ההפעלה של מנוע הנוירונים היא הכרחית לתנועת peristaltic. יש לנו דיווח נתונים ודיונים על תופעה זו מפורטים בעבר בInada et al. (2011) 13. כאן, אנו מתארים את השיטה כדי לטרוד פעילות עצבית אופן אינטרקטיווי תוך מעקב אחר התנועה של הזחלים גזורים. שימוש Gal4 קווים וסדרה של דפוסי spatiotemporal למניפולצית פעילות שונים, אפשר לחקור היגיון מעגלים דרך תזזית מאפייני תגובה של מעגל המנוע.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

תנועת הזחל דרוזופילה היא מערכת מפוארת מודל במדעי המוח התפתחותית ופיסיולוגיים, מכוח הנגישות הגנטית של הרכיבים העצביים הבסיסיים במעגלים 1-6. יישום של optogenetics 7,8 במעגלים העצביים הזחל מאפשר לנו לתפעל את הפעילות עצבית בדרכים 9-13 בדוגמת מרחב ובזמן. בדרך כלל, דגימות מוארים באופן רחב עם מנורת כספית או LED, ולכן הספציפיות של הנוירונים היעד נשלטת על ידי מערכות ביטוי גנים בינאריות כגון מערכת Gal4-כטב&quot;מ 14,15. בעבודה זו, על מנת לשפר את הרזולוציה המרחבית ל&quot; רזולוציה משנה גנטית &quot;, אנו באופן מקומי מוארים משנה של תאי עצב בחוט עצב הגחון באמצעות לייזרים שיושמו במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. תוך מעקב אחר התנועה של קיר הגוף של הזחלים למחצה ללא פגע, אנו אינטראקטיביים מופעלים או עכבות פעילות עצבית עם channelrhodopsin 16,17 Or 18-20 halorhodopsin, בהתאמה. על ידי תאורה מוגבלת מרחב ובזמן של הרקמה העצבית, אנחנו יכולים לתפעל את הפעילות של תאי עצב מסוימים במעגל בשלב מסוים של התנהגות. שיטה זו שימושית לחקר הקשר בין הפעילות עצבית הרכבה מקומית בחוט עצב הגחון ודפוס spatiotemporal תפוקת מנוע.

<html> הפעלה מקומית וזמנית של הנוירונים מוטוריים עם ChR2. אנחנו הביעו ChR2 בתאי עצב מוטורי. את האקסונים של תאי עצב מוטוריים המתעוררים מכל פרויקט קטע VNC לקטע מקביל לקיר הגוף. כאשר אנו מגורה מגזרים אחת או שניים של VNC עם לייזר כחול, שרירים במגזרים המקבילים הציגו התכווצויות (איור 1). עיכוב מקומי וזמני של הנוירונים מוטוריים עם NpHR. אנחנו הביעו NpHR בתאי עצב מוטורי. כאשר אנו מגורה כמה (1 ~ 2) קטעים של VNC עם לייזר צהוב בהתכווצויות השרירים peristaltic, גל הפצת נעצר במגזרים המקבילים של קיר הגוף (איור 2). ואז הגל מחדש מהמגזרים שנעצרו כשכיבינו את תאורת לייזר 13. 50513fig1.jpg &quot;alt =&quot; איור 1 &quot;עבור: תוכן-width =&quot; 5.5in &quot;עבור: src =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; איור 1. הפעלה מקומית של הנוירונים מוטוריים עם ChR2. תכנית א &#39;של ההפעלה המקומית של הכנת פילה. על ידי תאורה בצבע הכחול בהירה של כמה קטעים של חוט עצב הגחון להביע ChR2 בנוירונים מוטוריים, שרירים במגזרים המקבילים מכווצים (ראש חץ). תמונות תמסורת של זחל גזור. תאורה מקומית של חוט עצב הגחון (חץ ראשים) גורמת להתכווצות שרירים מגזרי של קיר גוף (חיצים). <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> איור 2. עיכוב מקומי של הנוירונים מוטוריים עם NpHR תכנית. א העיכוב המקומי של הכנת פילה. על ידי צהוב-Lתאורת ight של כמה קטעים של חוט עצב הגחון להביע NpHR בנוירונים מוטוריים, התכווצות שרירים באופן ספונטני, התרחש תנועת peristaltic (ראש החץ בחלק העליון) רגועים (ראש החץ בתחתית.) תמונות תמסורת של זחל גזור . תאורה מקומית של חוט עצב הגחון (ראשי חץ) רגועה מגזרי קיר הגוף באופן ספונטני, התכווץ (חיצים).

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion at JoVE.com

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא פגע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים באמצעות לייזרים במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להשיג הפרעות מקומית של פעילות עצבית בכמה neuromeres להבהיר את הדינמיקה של מעגלים מוטוריים.

הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים בתנועה

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K Views.  The University of Tokyo. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא פגע דרוזופילה זחלים באמצעות לייזרים במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להשיג הפרעות מקומית של פעילות עצבית בכמה...

Video: Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

עצבי פעילות הרבייה בהיפוקמפוס הכנה פרש בחודר מיקרו-אלקטרודה Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.