המחברים מודים רוברט Kelsh לחביבות שיתוף מגיב אמרגן sox10 דג הזברה.

1. אוסף עובר לphotoconversion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר לפחות עשרה זוגות של sox10: דג הזברה מהונדס קאאד בין 5 ל 6:00 בערב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, למשוך את החוצצים ולאסוף ביצים בסביבות הצהריים. להעביר אותם לצלחות פטרי ולשים אותם לתוך 28.5 חממת מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבות 24 הודעה שעה הפריה, לנקות את צלחות פטרי על ידי הסרת עוברים מתים. בדוק את שלב ההתפתחות של עוברים 13 באמצעות מיקרוסקופ שדה אור וכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מסנן (EGFP). קאאד יהיה גלוי דרך מסנן זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוברים להגיע 60 העברת hpf חמישה עוברי ניאון בהירים לתוך צלחת פטרי נפרדת וdechorionate במידת צורך. </li></ol> 2. הרכבה של עובר לphotoconversion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את העובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נורמלי. ההרכבה של עוברים על מיקרוסקופ confocal היא מאוד מאתגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדוכןמים ארד E3 או להכין E3 הטרי באמצעות המתכון הבא: להוסיף את הדברים הבאים לליטר אחד של DH מים מזוקקים 2 O להוסיף את הדברים הבאים כדי להפוך את E3L 1x: 0.292 גרם 5.0 מ&quot;מ NaCl 0.013 גרם 0.17mm KCl 0.044 גרם 0.33mm CaCl 2 (יבוש, 96%, מגיב ACS) 0.081 גרם .33 מ&quot;מ MgSO 4 (anhydrated) אופציונאלי: להוסיף 200 μl של 0.05% מתילן כחול ל1X E3 כמו פטריות ומערבבים. בינוני שומר בטמפרטורת חדר למשך השבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש tricaine סטנדרטית או להכין tricaine באמצעות המתכון הבא: ל5 L של .0.2% tricaine לערבב את המרכיבים הבאים: 45 מיליליטר טריס-Cl (1M pH9.5) 5 LH 2 O 10 tricaine גרם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &#39;מיץ סרט&#39; (50 מיליליטר E3, 0.015% פתרון tricaine), על ידי הוספת tricaine 3.75 מיליליטר 0.2% ל46.25 מיליליטר E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את agarose על ידי ערבוב 46.25 מיליליטר מים E3 עם נקודת 46.35 מ&quot;ג נמוך היתוך agarose (LMP) בבקבוק זכוכית 50 מ&quot;ל ולפזר חלקיקים מוצקים על ידי במיקרוגל. לאחר מכן להוסיף3.73 tricaine 0.2% מיליליטר לagarose ולשים את בקבוק זכוכית עם agarose לתוך 50 ° C אמבט מים עד שימוש. </li></ol> 3. הכנה והרכבה של עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עובר עם E3/0.015% פתרון tricaine עשה בשלב 1.1.2 ועובר העברה לתא שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספוג את כל עודפי E3 עם רקמת נייר ולשים agarose על עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר עמדה מגבה בצורה מושלמת עם טיפים microloader. ודא שכל העובר אינו מרחף על גבי agarose, אבל לדחוף את הגוף כולו. ואז לשפוך E3/0.015% פתרון tricaine על עובר מוטבע agarose עד החדר מתמלא באופן מלא בנוזל. </li></ol> 4. התאמת הגדרות תוכנה על Confocal מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אובייקטיבי 20X אוויר immersible (צמצם מספרי 0.75; גודל חריר 20) למיקוד העובר. ואז ללחוץ על כפתור אור L100 על המיקרוסקופ ובחר ערוצים בתוכנה. controls/A1settings לפתוח את הסמלים להציג / רכישה וclick confocal התקנת הכפתור. הבא לחץ על &#39;אוטומטי&#39; ובחר ערוצים הבאים לפני סגירת החלון שוב: CH1: ננומטר DAPI ערוץ 403.4 (ניתן להשתמש באורכי גל שבין 350-410 ננומטר) CH2: 488.0 ננומטר CH3: 561.9 ננומטר </li></ol> 5. Photoconversion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את CH1 ו -3 ולהדליק CH2 לפני לחיצה על לחצן משתלבים הסרה וסריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בתאים של עניין לphotoconversion, שהוא הטוב ביותר שנעשה על ידי הפעלה עם מתח 1frame/sec וגבוה (HV) 200 ולאחר מכן עולה במסגרות / השנייה והוריד HV בהתאם עד שמגיע 1/32 מסגרות / sec וHV סביב 100-120, תלוי ברעש הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העובר הוא בפוקוס, נראה בקצה הימני של מסך, לתפוס את השפה הירוקה ולהפוך אותו קטן יותר, כך שהוא מתאים לאזור של עניין לphotoconversion קליק ימני עם העכבר. קטן יותר הוא טוב יותר, כי photoconversion היא בלתי הפיכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מסגרות / sec עד 1 וHV 200 ופגעלסרוק. תמונה מוגדלת באזור של photoconversion גלויה עכשיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Photoconvert ידי הפעלת CH1 (403.4 ננומטר). לחשוף לליזר photoconverting כל מקום 5-60 שניות, תלוי בגודל של האזור עד קאאד הירוק כפי שניתן לראות דרך ערוץ ה-GFP הוא כמעט נעדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אות קאאד הירוקה היא כמעט נעדר, לכבות CH1. הפעל CH2 ו -3 ב. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על חלון בשדה אזור סריקת A1 ופגעתי &#39;חזרה לגודל מקורי&#39; כדי לבדוק אם תאים רצויים היו photoconverted. </li></ol> 6. מה שהופך את Z-מחסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הסמל &quot;Z-הסדרה ללכוד&quot; בשורת התפריט והיכולת להציב גבולות העליונים ותחתונים של Z-מחסנית לפני שמתחילים אותו. הגדר LUTs. </li></ol> 7. תוכנת הגדרות זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתיבת A1Simple GUI וסמן את ההגדרות הבאות: 1/32 מסגרות / sec גודל 1024 ממוצע או 8X 4 תלוי במספר של Z-ערימות שיש לקחת בלולאה אחת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל:פקדי תצוגה / רכישה / רכישת רצף ND ומסגרת זמן שנקבע (8-v30), לחץ מתמשך ולחץ על Z-מחסנית. הגדר גבולות כפי שנבדק בעבר ולהתחיל סרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להוסיף E3/0.015% קאמרי שקופיות פתרון tricaine לאורך כל היום. בלילה, למלא את האולם לחלוטין. שיימשך עד למחרת בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, למלא E3/0.015% פתרון tricaine ולבדוק אם עובר הוא עדיין בחיים. הפסד של הקרינה מצביע על מוות. המשך מילוי ובדיקות לאורך כל היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המבנה סיים להרכיב, או את העובר מת, לסיים את הסרט. </li></ol> 8. עיבוד פוסט פרודקשן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;הקרנת מופע מקסימום עוצמת&#39; בסרגל כלים, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על התמונה וליצור מסמך חדש. הווידאו הוא נראה באיכות הטובה ביותר האפשרית עכשיו. ללכת על מנת להסיר מסגרות שאינם נחוצות ולהתאים LUTs. לבסוף לשמור כ. avi. פורמט זה יהיה בסדר עבור Windows. עבור לא תוכנה להורדת מקo להמיר. mov או. wmv. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate:+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+(IPDTOC).">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li><li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li><li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting.">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton.">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Fate+Map+of+First+Pharyngeal+Arch+Structures+in+the+sox10:+kaede+Zebrafish+Transgenic+Model.">Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model.</a> J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).</li><li>Trainor, P. A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+genes,+neural+crest+cells+and+branchial+arch+patterning.">Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Swartz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish.">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+Defects+Res.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res.</a> C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).</li><li>Ando, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li><li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you/scube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling.">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development.">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הנה שיטה חדשה להדמיה של פיתוח craniofacial במודל דג הזברה מוצגת. Sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד כבר השתמש בהצלחה כדי לתאר את דפוס הנדידה של CNCC בפירוט משמש כאורגניזם מודל 5. מחקרים קודמים השתמשו בציוני דרך גולמית כגון העין למקד את התאי...

בתרי orofacial מייצג את עיוות craniofacial הנפוצה ביותר, עם 1/700-1, 000 משלוחים השפיעו 1. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת craniofacial יכול להוביל להיווצרות של שפה שסועה וחך (CL / P). בעוד סיבות לשסועות syndromic הוכחו במידה רבה, את הבסיסים הגנטיים ואפיגנטיים של צורות nonsyndromic של clefting orofacial עדיין צריכים להיחשף 2-4. על מנת להבין את האטיולוגיה ופתוגנזה של מומים אלה, יש צורך להבהיר את התפתחות מבני craniofacial על בסיס סלולארי. בכל מיני החולייתנים תאי גולגולת עצביים רכס (CNCC) להעביר מהצינור העצבי הגבי כדי לאכלס את קשתות בלוע, אשר יתרמו להיווצרות של מבני orofacial. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת רכס עצבי יכול להוביל להיווצרות של מומים craniofacial כולל CL / P 5-7. במודעהdition לדמיון מבני בין דג הזברה ופיתוח craniofacial יונקים (CNCCs מתגורר באזורים הומולוגיים), רשת הרגולציה הגן זה שמור ביותר. כמו כן, הוכיח כי CNCCs לפתח באותו אופן בין מיני amniote ודג הזברה 8, מה שהופך את דג הזברה אורגניזם רב עוצמה ללימוד בסיס ההתפתחותי והגנטי של CL / פ יש לו יתרונות רבים, לרבות גודל קטן, מהיר והתפתחות עוברית לשעבר ברחם, ושיעורי גידול גבוהים. יתר על כן, העובר הוא שקוף אופטי, מה שהופך אותו נוח לתצפית של אירועים התפתחותיים מורכבים מתחת למיקרוסקופ 9. זהו מודל חיה אידיאלי לחקר נדידה וההתמיינות של תאי רכס עצביים גולגולתי. הרחבת בעבר עבודה שפורסמה 8, 10, 11, דפוס הנדידה של CNCC תואר בפירוט באמצעות sox10: המודל המהונדס קאאד 5. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שtuאחיות מוסמכות מירוקים לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשרת לעקוב אחר CNCCs בדיוק. במהלך השינוי הזה את עמוד השדרה פפטיד הוא ביקע, טוען כי ההמרה היא יציבה, כלומר, יכולים להיות במעקב התאים ליעדן הסופי 12. קווים מהונדסים שכותרתו עם קאאד תחת שליטת תעתיק של sox10 הראו כי חיך amniote וצלחת כברתי של דג הזברה נוצרים homologously על ידי שילוב של בליטות הבילטראליים לסת (MXP) עם בולטות frontonasal (FNP) ושתפר היתוך Y בצורת משול בין מינים. בין יישומים אחרים, sox10: מודל דג הזברה מהונדס קאאד היה לשמש ליצירת קטעי וידאו של עוברי דג הזברה בשלבי התפתחותיים שונים כדי להראות היווצרות של מבני craniofacial נורמלים ולא נורמליים. Photoconversion של קבוצות ספציפיות של תאים מאפשרת לעקוב אחר התפתחותם. בשיטה זו גישה ליצור הדמיה חיה של פיתוח craniofacמבני ial בדג הזברה הוא הציג, מה שהופך את זה קל מבחינה ויזואלית להדגים תהליך התפתחותי מורכב זה. פרוטוקול זה מיועד לשיתוף החוויה של יצירת סרטונים אלה באמצעות ההתפתחות התקינה של צלחת כברתי בsox10: דג הזברה מהונדס קאאד לדוגמא ירושלים. פרוטוקול זה עוד יכול להיות מיושם על ביצוע קטעי וידאו הזמן לשגות של כל מבנה שמקורם בתאי רכס עצביים גולגולתי בדג זברה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sox10: kaede transgenic zebrafish line</td>
			<td>MGH</td>
			<td></td>
			<td>Available via the Liao lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100x15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mmx10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem</td>
			<td>LabTek</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloaders 200/pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Si Confocal Ti series</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy

palatogenesis חוליות הוא תהליך התפתחותי כוריאוגרפיה והמורכב ביותר, הכולל הגירה של רכס עצבי גולגולתי (CNC) תאים, התכנסות והרחבה של בליטות פנים, והתבגרות של שלד craniofacial. כדי ללמוד את התרומה של הרכס העצבי הגולגולת לאזורים ספציפיים של חיך דג הזברה sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד נוצר. Sox10 מספק הגבלת שושלת של חלבון כתב קאאד לרכס העצבי, ובכך הופך את תא תיוג תהליך מדויק יותר מאשר צבע מסורתי או הזרקת mRNA כתב. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שהופך מירוק לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשר לעקוב אחר תאים בדיוק. Sox10: הקו מהונדס קאאד שימש לביצוע ניתוח שושלת להתוות אוכלוסיות תאי CNC כי להצמיח לסת מול לסת תחתון, אלמנטים ולהמחיש הומולוגיה של בליטות פנים לamniotes. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים כדי ליצור וידאו חי זמן לשגות של sox10: עובר דג הזברה קאאד. פיתוח של צלחת כברתי ישמש כדוגמא מעשית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ביצוע הקלטת confocal זמן לשגות של כל קאאד או חלבון כתב photoconvertible דומה בדג זברה מהונדס. יתר על כן, ניתן להשתמש בו כדי ללכוד את הפיתוח לא רק נורמלי, אלא גם לא תקין של מבני craniofacial במוטנטים דג הזברה.

בsox10: CNCCs קו מהונדס קאאד, נדידה והודעה נודדת שכותרתו fluorescently ירוקה. תאי CNCC שכותרתו עם קאאד פלואורסצנטי הירוק לסכם ביטוי mRNA sox10 אנדוגני 5. בין יישומים אחרים, מודל חיה זה שימש כדי להמחיש את הפיתוח של מבני craniofacial תלויים CNCC טוב יותר...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

visualization-craniofacial-development-sox10-kaede-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  Massachusetts General Hospital.  ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חל...

Video: Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...