המחברים מודים אלכס Schier לחביבות שיתוף הקו המהונדס Zebrabow-M, ג&#39;פרי ברנס לוקטור pDEST ורנה Ethier-Daigle לטיפול מצוין של מתקן הדגים וקווים. מימון: אנו מודים לתמיכה נדיבה מימון מNIDCR RO3DE024490 ובתי החולים ריינרים לילדים (ECL) ומלגות הכשרת פוסט-דוקטורט מבתי החולים ריינרים לילדים (LR וי.ק.).

הכללית של מסצ&#39;וסטס ועדת בית חולים מוסדי טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) אישרה את כל הנהלים תחת מספר # פרוטוקול 2010N000106. זה עומד באגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים בינלאומי (AAALAC) הנחיות. 1. ריאגנטים וחומרי הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של 50X בינוני E3 עובר (ראה טבלת 1) ולהכין 1 ליטר של מדיום עובר 1X E3 (ראה טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני עובר E3 עם N-Phenylthiourea (PTU) על ידי הוספת 30 מ&quot;ג של PTU לL 1 של 1X E3. O מערבבים / N כדי להבטיח שPTU נמס לגמרי. אחסן בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון pronase, לדלל 150 μl של pronase (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) עם 15 מיליליטר של 1X E3. סכום זה מספיק לצלחת פטרי 1. להשתמש באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון Methylcellulose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון E3-tricaine על ידי ערבוב 75 מיליליטר של tricaine 0.2% עם 25 מיליליטרשל 1X E3. מרתיחים 3 גרם של methylcellulose ב -75 מיליליטר של תמיסת E3-tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את הנפח הסופי 100 מיליליטר עם פתרון E3-tricaine. פתרון methylcellulose הסופי הוא צמיג ואטום עם גוון צהבהב. אחסון: RT מוגן מפני האור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניית טמוקסיפן ופתרון אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;מ פתרון מניות טמוקסיפן ידי ההמסה ב 100% אתנול-hydroxytamoxifen 4. מניית החנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול טרי של טמוקסיפן בריכוז הרצון ב1X E3 להשיג פתרון האינדוקציה. זהירות! יש להתייעץ MSDS לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של tricaine 0.2% בהתאם לטבלה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג שקופיות confocal. דבק ארבעה coverglass (18 x 18) יחד כדי ליצור בלוק אז במקום 2 בלוקים על coverglass 24 x 60 סנטימטר זה מזה 2 כדי לאפשר הרכבה של העובר באמצע. </li></ol> 2. העובר הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קווים מהונדסים. <br/&gt; הערה: Zebrabow-M הייתה מתנה נדיבה מהמעבדה של אלכס Schier. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sox10: ERT2-Cre הערה: צור וקטור מיקוד pDestTol2- sox10: ERT2-Cre באמצעות שיטות שיבוט מולקולרי סטנדרטיים ומסחרית שהושגה רקומבינציה שיבוט טכנולוגיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 5 &#39;שיבוט כניסה (pENTR5&#39;- sox10p) המכיל 7.2Kb של אמרגן sox10, שיבוט אמצע Gateway (PME-ERT2-Cre), ו3&#39; שיבוט כניסה (pENTR3&#39;-פולה) בתגובת LR עם יעד עדשה וקטור pDestTol2- α-crystallin: YFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מבנה pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. שיתוף להזריק המבנה מטוהר (100 ng / μl) עם mRNA Tol2 transposase (50 ng / μl) לעוברי WT (F0) בשלב תא אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייסדי מבוגרים F0 מסך לשידור נבט-קו המבוססים על הקרינה צהובה חזקה בעוברי F1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Outcross Zebrabow-Mקו (2.1.1) עם sox10: הקו המהונדס ERT2-Cre. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים בחרו מציגים ביטוי חזק בכל מקום RFP וסמן עדשת YFP ולגדל אותם עד מבוגרים. </li></ol></li></ol> אוסף 3. העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקים כמה זוגות sox10: ERT2-Cre; דג הזברה מהונדס Zebrabow-M 17:00-06:00 ביום 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, למשוך את החוצצים בבוקר ולאסוף את הביצים בשעתי הצהריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר אותם לפטרי מנות ולהוסיף 15 מיליליטר של פתרון pronase לdechorionate את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר ל1 עד 5 דקות, עד כ -60% מהעוברים כבר dechorionated. לעצור את התגובה באמצעות אחסון פתרון pronase ולשטוף את העוברים 3-4 פעמים עם מדיום E3 טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר dechorionated בE3 ב RT O / N ולתת להם לפתח כדי להגיע לשלב 10 somites. דגירה 50-60 עוברים לכל מצמד, כדי למנוע צמיחה התפתחותיים שונה. </li></ol&gt; 4. טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שלב ההתפתחותי של העוברים תחת מיקרוסקופ שדה אור כדי להבטיח שהם נמצאים בשלב 10 somites. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP), לבודד את העוברים בצבע אדומים הבוהקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לאינדוקציה של Cre-רקומבינציה על ידי הוספת 10 מיקרומטר של פתרון hydroxytamoxifen לצלחת פטרי ודוגרים עוברים המבודדים על 28.5 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את פתרון טמוקסיפן ולשטוף את העוברים כמה פעמים עם E3. זהירות! השלך את פתרון טמוקסיפן במכל פסולת ביולוגי מיוחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר על 28.5 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הם עובר כ שלב somites 28-29 (כ 24 שעות לאחר ההפריה), דגירה את העוברים על 28.5 מעלות צלזיוס בלהלן פתרון E3-PTU. הערה: PTU הוא כאן נהג לעכב היווצרות melanophores בעוברים המתפתחים. טיפול זה הוא הכרחי ללמנוע את עיוות האות של הקרינה על ידי melanophores האוטומטי ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר על 28.5 מעלות צלזיוס </li></ol> בחירת 5. העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את מבני craniofacial מפותחים, בחר את העוברים על 4 ימים לאחר הפריה לעוצמת האות האדומה וחיוביות Cre סמן ביטוי (צהובה ברשתית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העוברים עם פתרון E3 / 0.015 tricaine%. הרדמה הוא אישר כאשר אין תנועות פעילים או פעילות סנפיר הוא ציינה כאשר בעדינות דוחפות את העובר. </li></ol> 6. הרכבה העובר בMethycellulose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העובר שנבחר להדמיה לצלחת פטרי המכילה ירידה של methylcellulose ועדינות לחנוט את העובר עם methylcellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשקופית confocal נקייה, במקום ירידה של methylcellulose הטרי והר העובר שלך בירידה באמצעות קצה microloader. עובר העמדה dorsally לוקח זהירות לא לגעתהעובר ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את העובר רכוב עם coverslip 25 x 25 ולהתאים את המיקום של העובר במידת צורך על ידי מניפולציה של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר מוכן לתמונה עכשיו. </li></ol> 7. ניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במטרת 20x היבשה העדשה (הצמצם מספרי 0.75; גודל חריר 2.0 מיקרומטר) להתמקדות העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור L100 על המיקרוסקופ ובחר את הערוצים בתוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר confocal התקנת לחצן ולחץ על &#39;אוטומטי&#39; ובחר את הערוצים הבאים לפני סגירת החלון: CH1: CFP, CH2: GFP, CH3: RFP או mCherry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל CH2 וCH3 לפני לחיצה על הכפתור &#39;להסיר את הנעילה&#39;. לחץ על &#39;הצגה&#39; כדי להתחיל בסריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד במבנה של עניין, שנעשה על ידי המיטב מתחיל עם מסגרת ½ / sec ומתח גבוה (HV) 150 ולאחר מכן לשנות את ההגדרות בהתאם עד איכות התמונה הרצויה היא AChieved. RFP יהיה בהיר יותר מצבע אחר, ולכן להתאים את HV. לשנות את מיקום Z למצוא שני YFP ותאים חיוביים RFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שנקבע עם ההגדרות, ללכוד את התמונה של העובר שלך. להציל את התמונה שלך בפורמט פורמט תוכנת הדמיה וTIFF confocal לעיבוד תמונה בכל ערוץ מפוצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להדמיה CFP, לכבות את CH2 וCH3 ולהפעיל CH1. להתאים מחדש את ההגדרות כמו בשלב 5 מבלי לשנות את אזור המיקוד. הערה: CFP יכול להיות ממש קשה לזהות בגלל אות רקע בערוץ כחול שניתן לעקוף באמצעות התאמת גודל חריר. גודל חריר גדול יותר מאפשר זיהוי טוב יותר של הקרינה על ידי הקטנת יחס רעש אות / רקע. עם זאת, חריר גדול יותר יפחית השפעת confocal, להתפשר על איכות תמונה. לכן, התאמה מדוקדקת של ההגדרות נדרש כדי להשיג את איכות תמונה הרצויה ועוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את התמונה ולשמור אותו בפורמט שניהם (תוכנת confocal וTIFF) לעיבוד תמונה. אז יכולות להיות מעובד תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה נפוצה למזג שכבות ולשפר את הגדרות צבע כפי שתוארו על ידי פאן ועמיתים 8. </li></ol>

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

קווים מהונדסים כחולים וphotoconvertible Alcian כפי שתואר לעיל משלים אחד את השני כדי להגדיר את התהליך המורכב של סחוס ועצם פיתוח. עם זאת, העברת חיה סלולרית וארגון במהלך organogenesis כבר שיערו ארוכה ובעקיפין הפגינו אבל מעולם לא דמיינו. קו מהונדס Zebrabow-M בשילוב עם סחוס Cre הספציפי מאפשר תצפ?...

פיתוח Craniofacial דורש אינטראקציות מולקולריות, תאיות ורקמות מורכבות לנהוג התפשטות תאים, הגירה ובידול 1,2, 3. תהליך מוסדר היטב ומורכב זה כפוף להפרעות גנטיות וסביבתיות, כגון שעיוותי craniofacial הן בין המומים הלידה הנפוצים ביותר 1-9. בעוד התערבות כירורגית להישאר התווך של טיפול בחריגות craniofacial, הבנת בסיס הפיתוח הוא חיוני לחדש טיפולים עתידיים. לכן, לימוד המורפוגנזה והמנגנונים בהתכנסות והרחבה והאינטגרציה תא מספק תובנות רומן להיווצרות של שלד craniofacial 1. להגר רכס העצבי גולגולתי ולאכלס את קשת בלוע הראשונה, תהליכי לסת אז טופס לזווג שמרחיבים לטופס סחוס של מקל, שבישר הלסת התחתונה. o המורפוגנזהF הסחוס של מקל דורש ארגון הכונדרוציטים באמצעות התפשטות כיוונית, קיטוב התא ו1,10 בידול. עם זאת, המורכבות של ארגון הכונדרוציטים בצמיחה וההרחבה של הסחוס של מקל עדיין לא ברורות. ההבנה דינמית התנהגות תא היא קריטית להבנת מומים מולדים המשפיעים על גודל לסת, כגון פנוטיפים לסת תחתונה היפופלסטי 11. עוברי דג הזברה מציעים יתרונות רבים התפתחותיים וגנטיים למחקר מפורט של המורפוגנזה הסחוס של מקל. נְהִילוּת הגנטית, שקיפות, vivo לשעבר והתפתחות מהירה הן יתרונות חזקים הלוואות זה טוב להתבוננות בתנועת תא וארגון על ידי הדמיה חיה 6. שימוש בכלי התחקות שושלת, כגון sox10: קו מהונדס קאאד, אנו ואחרים התוו את מקורות רכס העצביים של שלד craniofacial העוברי 1,5. Using sox10: ERT2-Cre עם UBI: קו מהונדס Zebrabow-M, ניתן כיום לחקור את הפרטים של תנועות סלולריות במהלך פיתוח craniofacial. Zebrabow-M, הוא קו מהונדס מהונדס עם אמרגן היוביקוויטין נהיגה הביטוי של fluorophores שונה, כל אחד מוקף אתרי קס 8. Fluorophore ברירת מחדל Zebrabow-M הוא אדום, להביע RFP. לאחר האינדוקציה של ביטוי Cre, Zebrabow-M לבנות משתלבת מחדש ותאים להביע שילוב של fluorophores שונה (RFP, CFP ו YFP) יצירת ביטוי רב-רפאים בעובר. כל תאי הבת שלחלק מהתאים שכותרתו לאחר אירוע רקומבינציה לאחר מכן כותרת clonally, כך שאוכלוסיות התאים שנובעות מאבות סמיכותם שונים מסומנות clonally. על ידי תיוג תא שיבוט זה, התפשטות תאים ונדידה עם רזולוציה משובט יכולים להיות אחרי (איור 1 ו -2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

פיתוח של מבני craniofacial חוליות דורש תיאום מדויק של נדידת תאים, התפשטות, הדבקה ובידול. דפוסים של סחוס של מקל, נגזר קשת בלוע ראשון, כרוך בהגירה של תאי רכס עצבי גולגולתי (CNC) ומחיצות, ההפצה המתקדמת וארגון של כונדרוציטים מובחנים. מספר מחקרים שתוארו הגירת CNC במהלך המורפוגנזה לסת תחתונה, אבל את הפרטים של איך להשיג כונדרוציטים ארגון בצמיחה וההרחבה של הסחוס של מקל עדיין לא ברורים. Sox10 מוגבל ורקומבינציה בתיווך recombinase Cre המושרית כימי יוצרת תמורות של חלבונים שונים ניאון (RFP, YFP וCFP), ובכך ליצור תיוג רב-רפאים של תאי אב וצאצאיהם, המשקפת אוכלוסייה משובט שונה. באמצעות צילום הזמן לשגות confocal, ניתן לצפות בכונדרוציטים behaviאו במהלך הפיתוח של הסחוס של דג הזברה מקל. תיוג תא Multispectral מאפשר למדענים להפגין סיומת של כונדרוציטים של מקל. במהלך שלב הארכה של סחוס של מקל, שבישר הלסת התחתונה, כונדרוציטים intercalate לבצע הרחבה כפי שהם המחסנית בשורה שכבתית תא בודד מאורגנת. כישלון של תהליך intercalating מאורגן זה לתווך הארכת תא מספק הסבר מכניסטי הסלולרי ללסת תחתונה היפופלסטי שאנו רואים במומי לסת.

הדמיה סחוס מסורתית על ידי כתמים כחולים הר Alcian כל כבר לא יסולא בפז בהתבוננות הסחוס של מקל פיתוח ונפוץ לדמיין (איור 1 א) הסלולרי סופי ארגון 12. כדי לנתח נוסף כונדרוציטים פיתוח שעות נוספות, התחקות שושלת באמצעות sox10: קווים מהונדסים קאאד אפשרו לנו ללמוד נד...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckelâ€™s Cartilage at JoVE.

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&amp;#8217;s Cartilage

ארגון תא של עצמות craniofacial כבר שיערו ארוך אבל אף פעם לא דמיין ישירות. תיוג תא Multi-רפאים ובשידור חי vivo הדמיה מאפשרת הדמיה של התנהגות הדינמית של תאים בלסת תחתונה דג הזברה. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול לתמרן Zebrabow דג מהונדס וישירות להתבונן עיבור תא ושינויים מורפולוגיים של כונדרוציטים בסחוס של מקל.

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

9.0K Views.  Harvard Medical School.  ארגון תא של עצמות craniofacial כבר שיערו ארוך אבל אף פעם לא דמיין ישירות. תיוג תא Multi-רפאים ובשידור חי vivo הדמיה מאפשרת הדמיה של התנהגות הדינמית של תאים בלסת תחתונה דג הזברה. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול לתמרן Zebrabow דג מהונדס וישירות להתבונן עיבור תא וש...

Video: Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...