<ol>
	<li>Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+plasma+membrane+proteomics+identifies+components+of+transport,+signal+transduction+and+membrane+trafficking.">Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking.</a> Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).</li><li>Brown, D. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+GPI-anchored+proteins+to+glycolipid-enriched+membrane+subdomains+during+transport+to+the+apical+cell+surface.">Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface.</a> Cell. 68, 533-544 (1992).</li><li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N-metabolic+labeling+for+comparative+plasma+membrane+proteomics+in+Arabidopsis+cells.">15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells.</a> Proteomics. 7, 750-754 (2007).</li><li>Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratio-dependent+significance+thresholds+in+reciprocal+15N-labeling+experiments+as+a+robust+tool+in+detection+candidate+proteins+responding+to+biological+treatment.">Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment.</a> Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).</li><li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes.">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li><li>Simons, K., Ikonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+rafts+in+cell+membranes.">Functional rafts in cell membranes.</a> Nature. 387, 569-5672 (1997).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).</li><li>Silvius, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+membrane+molecules+between+raft-and+non+raft-domains:+insights+from+model+membrane+studies.">Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).</li><li>Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+and+animal+cells,+detergent-resistant+membranes+do+not+define+functional+membrane+rafts.">In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts.</a> Plant Cell. , (2011).</li><li>Lauwers, E., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+yeast+transporters+with+detergent-resistant+membranes+correlates+with+their+cell-surface+location.">Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location.</a> Traffic. 7, 1-15 (2006).</li><li>Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-&#223;-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics.">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-&#223;-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+signal+transduction.">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li><li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling,+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins.">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li><li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity.">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li><li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco.">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li><li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation.">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li><li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li><li>Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+synthesis+of+proteins+in+cell+suspensions+of+a+kinetin+dependent+tobacco.">Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco.</a> Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).</li><li>Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+plant+cell+cultures+with+K15NO3+as+a+tool+for+quantitative+analysis+of+proteins+and+metabolites.">Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites.</a> Plant Methods. 2, 1-11 (2006).</li><li>Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants.">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+accuracy+mass+spectrometry+in+large-scale+analysis+of+protein+phosphorylation.">High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation.</a> Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).</li><li>Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+loss+activation+method+for+improved+phosphopeptide+sequence+analysis+by+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometry.">A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).</li><li>Frese, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID,+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos.">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li><li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StatQuant:+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry.">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li><li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+wants+cRacker:+Automated+standardized+data+analysis+of+LC/MS+derived+proteomic+data.">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li><li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+of+remorins,+a+plant-specific+protein+family:+Evolutionary+and+functional+perspectives.">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li><li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondetergent+isolation+of+rafts.">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li><li>Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method.">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li><li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts.">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li><li>M&#252;hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).</li><li>Schulze, W., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).</li><li>Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+quantiative+proteomics+of+lipid+rafts+reveales+high+specificity+for+signaling+factors.">Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).</li><li>Lilley, K. S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+organelle+proteomics.">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li><li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins.">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. המחבר, ויטולד שימנסקי, הנו עובד של מכון מקס פלנק למולקולרי Plant Physiology. המחבר, היים שולץ הוא עובד באוניברסיטת הוהנהיים, גרמניה.

הפרוטוקול שהוצג במאמר זה מכיל שלבים רבים וכל אחד מהם הם חיוניים כדי להשיג חלוקה טהורה ונציג של קרום הפלזמה הצמח לממברנות עמידות חומרי ניקוי ושברים מסיסים חומרי ניקוי. לכן, חשוב לעקוב אחר כל צעד בהתאם להנחיות. טיפול בשבריר קרום הפלזמה עם חומר ניקוי שאינו יוניים (שלב 3.2) יש ההשפעה החזקה ביותר על איכות חלוקה microdomain הממברנה. כדי להשיג תוצאות לשחזור בין תכשירים שונים, וכדי להיות מסוגל להשוות דגימות שונות מאותו הניסוי, זה מאוד חשוב להעריך במדויק את ריכוזם של חלבונים בקרום פלזמה וליישם את חומר הניקוי תמיד באותו היחס ביחס לתכולת חלבון ותמיד לאותו ריכוז סופי. מבחינה מעשית, זה אומר שלפעמים יש צורך לדלל דגימות עם ריכוז חלבון גבוה או להשתמש במניות ריכוז שונותשל טריטון X-100. במחקרים ביוכימיים, לאחרונה חלה נטייה בקרב חוקרים להשתמש בשיטה ללא חומר ניקוי לבידודה של microdomains הקרום 28-30. שיטות אלה מבוססות על הפרעה מכאנית של קרום הפלזמה של גז באמצעות מחט קטנה מאוד בהשוואה לעיתונות תא לחץ הצרפתית. נהלים אלה מיושמים בהצלחה בתרביות תאים של יונקים עשירים בmicrodomains קרום, אבל יישום לקיר תא המכיל אורגניזמים (שמרים, תאי צמח) לא דווח. שימוש פרוטאומיקה כמותית יחד עם סוכני שיבוש בסטרולים, כגון מתיל-beta-ציקלודקסטרין, זה היה הראה כי שברי ה-DRM שהוכנו מקרום הפלזמה צמח אל מכילים חלבונים שהם סמנים לmicrodomains קרום 11. לגבי התוצאות הסופיות של quantitation ספקטרומטריה, התוצאות טיפוסיות שמוצגת באיור 6 מייצגות את המצב האידיאלי בשעוצמת יון עבור רוב פפטידים שכותרת וללא תווית קרובות זהה. עם זאת, במקרים מסוימים ניתן להבחין במידה מסוימת של שונות ביולוגיות בין הסטים של תרביות תאים שכותרתו וללא תווית. לכן, לפני טיפול ביולוגי או שכותרתו או תרבית תאים ללא תווית מתבצעת, ניתוח של תערובת של תאים שכותרתו שליטה וללא תווית, שניהם ללא כל טיפול, מאפשר זיהוי של פפטידים עם יחסים מסתעף מאידאל 00:59 מצבים. חלבונים אלה עם יחס מסתעף אינדיקציות לשינוי ביולוגי. כדי להתגבר על האתגר של השפעות טיפול הייחודיות מוריאציה ביולוגית, ולכן אנו מציעים להשתמש תיוג הגומלין בניסויים לזווג 20. בהגדרת הניסוי ההדדית, שני הגרסאות של הניסוי מבוצעות כפי שהוצעו באיור 1 והצעדים של הפרוטוקול הם אחריו כפי שתוארו. ואז, בהשוואת יחסי עצמת יון של proteins משני הניסויים ההדדיים, ניתן להבחין אם ההבדלים בין יחסי עצמת יון הם עקב וריאציה ביולוגית או כהשפעה של הטיפול מיושם. שיטה נוספת לטיפול בבעית ההבחנה בין השפעות טיפול ווריאציה ביולוגית היא השימוש סטנדרטי שכותרתו פנימית כנקודת התייחסות לכל הטיפולים ביום 31. בגישה זו, שליטה ללא תווית וללא תווית תאים שעוברים טיפול ביולוגי מעורבבים עם אותה הכמות של תאי שליטה שכותרתו כבדים, המגיעים מאותה אצווה. היא מאפשרת ומבטלת את ההשפעה של שונות ביולוגיות על יחס פפטיד, כי חלבונים נחשבים כמשמעותי, אם יחסי עצמת יון של 14 N-שליטה / 15 N-בקרה ו14 N-טיפול / 15 N-שליטה שונים באופן משמעותי. זה אפשרי, כמו התקן שכותרתו הוא בדיוק אותו בכל המקרים. אחד drawbacks של הליך העשרת DRM שתואר כאן הם חלבוני שיתוף הטיהור שיכולה להיות מזוהה בשבריר הקרום עמיד חומרי הניקוי. ברשימה של חלבונים שזוהו משבריר קרום אבקת עמידה בצפיפות נמוכה, אנו יכולים לצפות באופן קבוע במספר רב של חלבוני ריבוזומלי. בשל הצפיפות הנמוכה יחסית של חלבוני ריבוזומלי, הם נודדים באותו שבריר כמו חלבוני קרום תלויים בסטרולים בשיפוע סוכרוז. היא הוצגה ללא כל ספקות כי חלבוני ריבוזומלי הם בבירור לא מרכיבים של microdomains קרום 11. כדי לא לכלול אלה וחלבונים שיתוף טיהור אחרים לא ממש קשורים עם השברים קרום בצפיפות נמוכה אבקת עמידה, אנו מציעים לנתח גם את הרכב proteomic של הקרומים תאיים (IM) אשר ניתן להפיק מהשלב dextran נמוך יותר משני מערכת השלב ולהשוות את יחסי השפע של חומרים מזהמים המשוערת בין הקרום הפנימי וה-DRMחלק קטן (ראה דוגמאות באיור 5). חלבוני ה-DRM שותף לטיהור צריכים שכיחות דומה בשני השברים (IM וDRM). חלוקה של תמציות תא וmicrodomains הקרום היא אסטרטגיה משותפת להפחית את המורכבות במדגם לניתוח proteomic 32. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן הוא שימושי לכל המחקרים של איתות תהליכים בקרום הפלזמה של תאי צמח. יישומים ביולוגיים נמצאים בלומדים את תגובות לחץ, כמו גם זיהומי פתוגן שכל במידה רבה לגרום לשינויים בהרכב קרום פלזמה ושינוי של חלבוני קרום 14,15. חוץ מזה לומד את תגובות לחץ, לכמת את שכיחותם של חלבונים בקרום שברים שונים יכול מאוד לסייע לביאור של חלבונים עדיין לא ידועים 33 34,35.

ב1972, ג&#39;ונתן סינגר וגארת&#39; ניקולסון הציעו מודל פסיפס נוזל מודל מבנה ממברנות תאים, החלפת מודל כריך חלבון שומנים החלבון שהיה מקובל ב 1960s מוקדם. זינגר וניקולסון הניחו כי הקרום הביולוגי יכול להיחשב כנוזל דו ממדים שבו כל מולקולות השומנים וחלבונים מפוזרות באופן חופשי ובקלות 5. מאז אותה תקופה, מודל מבנה של קרום הפלזמה והידע של הרכב הקרום הפך למורכב עוד יותר. במיוחד, בתוך קרום הפלזמה, ניתן לראות מבנים כגון קומפלקסי חלבונים וmicrodomains מבני מסודר המבוסס שומנים / סטרולים. בממברנות מודל מלאכותיות 6,7, סטרולים וsphingolipids יכולים רוחבי להפריד ממינים שומנים אחרים כדי ליצור אזורים עם מאפיינים פיזיים שונים. הפרדה זו בתוך קרום התא נגרמת בעיקר על ידי מאפייני שיוך העצמי בין סטרולים וsa מאודשרשרות פחמימנים turated של phopsho וsphingolipids 8. במיוחד, טבעות סטרולים הנוקשה להעדיף אינטראקציות עם נוקשה ומיני שומנים ישר רוויים ואינטראקציות אלה יאלצו את שרשרות הפחמימנים שכנים ליותר תצורות מורחבות, הגדלת עובי קרום ואת קשיות. אחד המאפיינים שנצפה של microdomains קרום סטרולים מועשרים היה insolubility על טיפול בחומרי ניקוי שאינו יוניים כגון טריטון X-100 או 35 בריג&#39;. שברים אלה נחשבים לזהים עם microdomains קרום ונקראו קרומי סבון עמידים (DRM) המבוססים על שיטת ההכנה ביוכימיים שלהם 2. השימוש בחומרי ניקוי nonionic במהלך חילוץ DRM קיבלו ביקורת כהכנת ה-DRM ביוכימיים לא יכולה ישירות מתאימות לכל תא קרום ספציפי בתוך התא החי 9. במיוחד, חומרי הניקוי ליחס חלבון נראה מכריעים בהכנות כאלה,חומרי ניקוי של שונים, כמו גם כמויות חומרי ניקוי שונות יכול להניב הרכב של שבריר קרום אבקת עמידה 10 שונה. עם זאת, יש ראיות לכך שמיני חלבון מסוימים באופן ספציפי לקשר עם תחומים אלה קרום סלולארי סטרולים עשירים, ושחלבונים אלו מועשרים גם בהכנות ביוכימיים של שברים קרום אבקת עמידה 11. הליבה של חלבונים, שנמצאו בחלק ה-DRM צמח, ואשר הנוכחות בDRMs הייתה סטרולים תלויה, היו בעיקר חלבונים מעוגנים-GPI, כגון חלבונים כמו fasciclin-arabinogalactan (flas) ובני משפחת חלבון מק. גם כמה חלבוני איתות, כגון קינאזות כמו קולטן או phospholipases נמצאו 11. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים רבים proteomic על microdomains קרום היונקים 12,13. גם בצמחים יש להגדיל ראיות לתפקיד של microdomains קרום בהקשר של תגובה ללחץ 14 -16. הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה חזקה לחלוקה של microdomains קרום פלזמה ובמיוחד משתמש בחלבון לריכוז חומר ניקוי שמאפשר לנו לתאר שינויי מתח מושרה של תא קרום סטרולים עשירים 4,11,14.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia (stock 25 % solution)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>010-03166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 10 &mu;m</td>
			<td>GL-Science</td>
			<td>5020-75010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol(PEG 3350)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>88276</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran T500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K15NO3</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-765-PK</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac RVC 2-25</td>
			<td>Christ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and membrane fractionation for comparative proteomic analysis of arabidopsis thaliana suspension cell cultures

microdomains קרום פלזמה הם תכונות המבוססות על התכונות הפיסיקליות של סביבת השומנים וסטרולים ויש תפקידים מסוימים באיתות תהליכים. חילוץ microdomains קרום מועשר בסטרולים מתאי צמח לניתוח proteomic הוא משימה קשה בעיקר בשל צעדי הכנה מרובים ומקורות לזיהומים מתאים סלולריים אחרים. קרום הפלזמה מהווה רק כ 5-20% מכל הקרומים בתא צמח, ולכן הבידוד של חלק קרום פלזמה מטוהר מאוד מאתגר. שיטה משמשת לעתים קרובות כרוכה מחיצות מימיות שני שלבים בפוליאתילן גליקול וdextran, אשר מניבה שלפוחית ​​קרום פלזמה עם טוהר 95% 1. microdomains קרום סטרולים עשירים בתוך קרום הפלזמה הם מסיסים על טיפול עם חומרי ניקוי nonionic קרים ב-pH בסיסי. שבריר קרום אבקת עמידה זה יכול להיות מופרד מקרום הפלזמה כמויות גדולות על ידי ultracentrifugation כבשיפוע ucrose 2. בהמשך לכך, ניתן להפיק חלבונים מהלהקה הצפיפות הנמוכה של שיפוע סוכרוז על ידי משקעים מתנול / כלורופורם. חלבון המופק לאחר מכן ניתן יהיה טריפסין מתעכל, desalted ולבסוף נותח על ידי LC-MS/MS. פרוטוקול החילוץ שלנו לmicrodomains סטרולים עשירים מותאם במיוחד להכנה של שברים קרום נקיים חומרי ניקוי עמיד מתרביות תאי thaliana ארבידופסיס. אנו משתמשים בתיוג טבולים מלא של תרביות תאי ההשעיה thaliana ארבידופסיס עם 15 K NO 3 כמקור חנקן היחיד ללימודי proteomic השוואתיים כמותית לאחר טיפול ביולוגי של עניין 3. על ידי ערבוב יחסים שווים של תרביות תאים שכותרתו וללא תווית להפקת חלבון משותפת ההשפעה של צעדי הכנה בתוצאה הכמותית סופית נשמר במינימום. גם אובדן של חומר במהלך החילוץ ישפיע גם שליטה ודגימות טיפול באותה הדרך,ד ולכן היחס של אור ופפטיד התרומה יישאר קבוע. בשיטה המוצעת או שכותרתו או תרבית תאים ללא תווית עוברת טיפול ביולוגי, ואילו השני משמש כשליטה 4.

עם הפרוטוקול שהוצג באמצעות תרביות תאי ארבידופסיס שכותרת מטבולית זה אפשרי לבודד ממברנות פלזמה מרקמות צמח (step2, איורים 2 ו 4), ומעשיר לשברי קרום אבקת עמידה בתוך קרום הפלזמה (שלב 3, איורים 3 ו -5). בהמשך לכך, הפרוטוקול מאפשר מיצוי של חלבונים משברי קרום אבקת עמידה אלה (שלב 4) ועיכול של החלבון לניתוח השוואתי proteomic (שלב 5). לבסוף, ההעשרה אופציונלית של phosphopeptides (שלב 8) היא מעניינת במיוחד בחקר תהליכי איתות תאיים. השלב האחרון ואז הוא ניתוח נתונים כמותיים (שלב 9, איור 6) של יחסי שפע חלבון בקרום שברים מתרבית תאים שכותרתו וללא תווית. תוצאות אופייניות לאחר הערבוב של מערכת 2-השלב (שלב 2) ולאחר מכן הם צנטריפוגה ושלב עליון בצבע בהירירוק בצבע שלב נמוך יותר (איור 2). שלפוחית ​​קרום פלזמה מעדיף לשייך את שלב PEG העליון, בעוד שלפוחית ​​קרום מכלורופלסטים ירוקים וקרומים פנים אחרים ישולבו בשלב dextran נמוך יותר. אם לא ניתן להבחין בהפרדת הצבעים, שלב 2 לא בוצע בצורה נכונה וקרומים פלזמה יהיו מזוהמים עם כמויות משמעותיות של קרומים פנימיים. העשרה של חלבוני קרום פלזמה יכולה להיות מוצגת על ידי ניתוח proteomic של aliquots הקטנים של שברים פלזמה הממברנה וחלבונים בשלב נמוך יותר של המערכת בשני השלבים. השלב התחתון מכיל הקרום הפנימי של התא. לדוגמא, חלבונים במיוחד טיפוסיים ידועים פלזמה ממברנה, כגון חלבוני קינאז רצפטור הראו שפע גבוה בשבריר קרום פלזמה (PM) ושפע נמוך בחלק התחתון השלב (איור 4 א) המכיל את הקרומים הפנימיים (IM). בתורו חלבונים ידועים, של מופע reticulum endoplasmatic הגבוהשפע בשבריר הקרום הפנימי ולא נצפה בשבריר קרום פלזמה (איור 4). ההעשרה הבאה של שברים חומר ניקוי עמידים קרום (שלב 3) תהיה במקרים אידיאליים לגרום להיווצרות טבעת חלבית של שלפוחית ​​קרום בצפיפות נמוכה בכ 1/5 th של גובה הצינור (איור 3). אם ההתאמה של טריטון X-100 ריכוזים או חומר הניקוי ליחס חלבון (שלב 3.2) היא אופטימלית להפרדה לשברים מסיסים אבקת עמידה וחומרי ניקוי, ניתן לראות טבעות נוספות בחלקים התחתונים של השיפוע ותהיינה גם גושי קרום בלהקה בצפיפות הנמוכה. במקרים אלה, חומרי ניקוי ליחס חלבון או בסך הכל כמות חומר ניקוי הוא שונה מריכוז micelle הקריטי ההכרחי להפרדה לשחזור של שני השברים תחום הממברנה. שימוש בריכוז חומר הניקוי הסופי וחומרי ניקוי ליחס חלבון שתואר כאן, Enrichment של חלבוני microdomain טיפוסיים, כגון remorin (AT3G61260) 27 יכולים להיות מאושר על ידי ניתוח השוואתי ספקטרומטריה של שבריר DRM, חלק אבקת מסיס (שלב 3.8), כמו גם קרום הפלזמה unfractionated וקרומים פנימיים. השפע הגבוה ביותר חלבון remorin של נמצא שבברי ה-DRM כצפוי (איור 6 א). חלבונים לא נמצאים בmicrodomains הקרום, כגון AT1G59870 ABC-טרנספורטר (איור 6), לא מראים שפע מוגבר בחלק ה-DRM. מזהמים גם טיפוסיים, כגון חלבון המיטוכונדריה (AT2G07707) ממתחם ATPase F0 (איור 6 ג) וחלבון ריבוזומלי (At1G001100) מהריבוזום 60S (איור 6 ד) לא מראים שפע מועשר בשבריר DRM, אם כי בכמויות מצומצמות יכולה עדיין להיות מזוהה. לאחר יחסי שכיחות ניתוח ספקטרומטריה, חלבון מעמד זירחון החלבון בפלזמהברי קרום של תרביות תאים שכותרתו וללא תווית ניתן להבחין כמותית (איור 6). תוצאות אופייניות מMSQuant <a href="http://msquant.sourceforge.net/" target="_blank">(msquant.alwaysdata.net</a> חלון quantitation) צריכים להראות יחס עוצמת יון של אחד לאחד במשך רוב הפפטידים שזוהו (איור 6 א). פפטידים אלו עם יחס עוצמת יון לסטות באופן משמעותי מ1:01 נחשבים כהפרש מוסדר בין תרבית התאים שכותרתו וללא תווית, והם מועמדים להתאמה לחלבונים מושפעים מהטיפול המוחל (איור 6 ג). בקרת איכות טובה של תיוג חילוף חומרים מוצלח היא שיתוף elution של שניהם שכותרתו וגרסאות ללא תווית הפפטיד כשיא יחיד בהפרדת ננו HPLC (שלב 9) כפי שמוצגת ב6B דמויות ו-D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig1.jpg"/&gt; איור 1. אסטרטגיה ניסיונית תיוג מטבולית. ייצוג סכמטי של שתי גרסאות של עיצוב ניסיוני בעת שימוש בתרביות תאי thaliana א &#39;ללא תווית באופן מלא שכותרתו וחילוף חומרים. הנסיין יכול להחליט להשתמש 14 N תאים (ללא תווית) כביקורת ו15 N תאים (שכותרתו מטבולית) שעוברת טיפול ביולוגי או להיפך. בתכנון ניסוי גומלין שני הגרסאות מתבצעות במקביל. <img alt="איור 2" fo:content-width="5.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig2.jpg" /> איור 2. זרימת עבודה להפרדה של שלפוחית ​​קרום צמח במערכת דו שלב מימית המבוססת על פוליאתילן גליקול (PEG) וdextran. שלפוחית ​​קרום פלזמה מופרדת לשלב PEG העליון תוך הכלורופלסט וקרומים פנימיים אחרים הקשורים לבוטשלב dextran אום לאחר צנטריפוגה. עם שטיפה נוספת של שלב העליון ניתן להשיג טיהור טובה יותר, אבל הפסד גם חומר הוא גדל. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig3.jpg" /> איור 3. העשרה של שברים קרום בצפיפות נמוכה. ייצוג שיפוע סוכרוז להעשרת שברים קרום אבקת עמידה בצפיפות נמוכה. המיקום הצפוי לאחר צנטריפוגה הלילה של להקת השלפוחית ​​הנמוכה צפיפות קרום מצויינים. <img alt="איור 4" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig4.jpg" /> איור 4. העשרה של חלבוני קרום פלזמה לאחר טיהור במערכת שני שלבים. מנורמלתעוצמות יון חלבון לחלבונים נמדדו בקרום פלזמה (PM) וקרום פנימי שבריר (IM). () מרכיבים ידועים אופייניים של קרום פלזמה מראים שפע הרבה יותר גבוה בשבריר PM מאשר בשבריר IM. מרכיבים ידועים (ב &#39;) הטבעי של קרומים פנימיים מציג את ההתנהגות ההפוכה. לנורמליזציה, סכומי עוצמת יון עבור כל חלבון באו לידי ביטוי כחלק מעוצמת יון סך הכל לדגימה ולאחר מכן בממוצע בין משכפל. חלק בסך הכל בעוצמות יון אז בא לידי ביטוי כביחס לממוצע בין שני הטיפולים. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלוש הכנות מתרביות תאים גדלו באופן עצמאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50535/50535fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig5highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50535/50535fig5.jpg&quot; /&gt; איור 5. . שפע של סמני חלבון סטנדרטיים בתוך שברים נמדדו מגרשים מייצגים את חלוקת עוצמות יון חלבון מנורמלות של סמנים שנבחרו חלבון לתאי subcellular מסוימים (DRM - microdomains סטרולים עשירים, אחר הצהריים - קרום פלזמה, מסרים מיידיים - קרום פנימי, SP - חלבונים מסיסים). דפוסי שפע () remorin כסמן לmicrodomains קרום סטרולים עשירים, (ב) חלבון משפחת טרנספורטר ABC מסוג כנציג של חלבון לא סטרולים תלויים, (ג) למקטע של קומפלקס F0 המיטוכונדריה, (ד &#39;) 60S מקטע של הריבוזומים כמו זיהום שיתוף טיהור טיפוסי. לנורמליזציה, סכומי עוצמת יון עבור כל חלבון באו לידי ביטוי כחלק מעוצמת יון סך הכל לדגימה ולאחר מכן בממוצע בין משכפל. חלק בסך הכל בעוצמות יון אז באו לידי ביטוי כביחס לממוצע בין שני הגידtments. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלוש הכנות מתרביות תאים גדלו באופן עצמאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50535/50535fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig6.jpg" /> איור 6. תוצאות צפויות של חלבון הכמותי ספקטרומטריית מסה. צילום מסך מMSQuant מראה את היחס של 1:1 עוצמת יון הצפוי של הפפטיד מתערובת 1:1 של תמציות חלבון מן הספקטרום שכותרת ותאי ארבידופסיס ללא תווית. () מלא סריקה של DNNLLGK פפטיד באופן ברור הפרדה שכותרתו (שיא מימין) וגרסה ללא תווית (שיא שמאלי) של פפטידים על הציר מ &#39;/ z. מסת monoisotopic והאיזוטופ הראשון מסומנות על ידי סימנים כחולים. (ב &#39;) שכותרתו (כחול)גרסאות ד ללא תווית (אדום) של הפפטיד שיתוף elute כשיא יחיד בכרומטוגרפיה ננו HPLC. ספקטרום סריקה מלא של הפפטיד עם יחס עוצמת יון של 01:05 כמועמד לחלבון באופן דיפרנציאלי מוסדר (C). (ד &#39; ) כמו כן חלבונים עם יחס שונה מ01:01 שיתוף elute בכרומטוגרפיה התהפך שלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50535/50535fig6large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures at JoVE.com

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא 15 N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים להבין תהליכי איתות.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

metabolic-labeling-membrane-fractionation-for-comparative-proteomic

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

14.0K Views.  Max Plank Institute of Molecular Plant Physiology.  כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא 15 N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים ל...

Video: Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

ניתוח התנהגות גדילה תודרנית לבנה באיכויות שונות אור

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

חקירה מרחבית-זמנית של דינמיקת ERL1 באמצעות הדמיה קונפוקלית

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Author Spotlight: שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...