עבודה זו נתמכה על ידי האגף למחקר העירוני של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID), המכון הלאומי לבריאות (NIH) בארה&quot;ב. כל העכברים נשמרו על האגודה אמריקנית להסמכה של מתקן בעלי החיים טיפול בבעלי חיים מוכר מעבדה במכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) ושוכנו בבהתאם לנהלים המפורטים במדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה תחת חסותו של פרוטוקול שאושר על ידי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש של NIAID.

1. בידוד של תאים במח עצם עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים תוך שימוש בפרוטוקול הטיפול בבעלי החיים של המוסד אישרה ועדה ולרסס את פני השטח החיה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בעור באמצע הבטן, ולהסיר את העור מחלק הדיסטלי של העכבר כולל העור המכסה את הגפיים התחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את השרירים מהגפיים התחתונים באמצעות מספריים ולנקוע זהירות מרחשת ממפרק הירך, תוך הימנעות מלשבור את ראש עצם הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השרירים שנותרו מעצם הירך ועצם השוק באמצעות אזמל ומספריים ולהפריד את עצם הירך מעצם השוק בטיפול בפעילות גופנית מפרק הברך לא לשבור את קצות העצם. מניחים את העצמות בצלחת פטרי המכילה RPMI קר כקרח 1640 1X בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לשלבים הבאים מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה. לנקוט אמצעי זהירות נוסף כדי לשמור על טכניקות סטריליות מחמירות כדי להימנע מneutrophiהפעלת ליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כל עצמות עם אתנול 70% (בתוך צלחת פטרי) ואחרי שלושה שוטף הבאים בPBS סטרילי קר כקרח (בתוך צלחות פטרי) כדי לשטוף את אתנול מפני השטח של העצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צלחת פטרי סטרילית נקיות, לחתוך את אפיפיזות של העצמות ולשמור אותם בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט 25 מד ומזרק 12 סמ&quot;ק מלאים RPMI השלים עם FBS 10% ו2 מ&quot;מ EDTA, ולשטוף את תאי מח העצם משני הקצוות של פירי העצם על שפופרת 50 מיליליטר בורג עליון פלקון מצוידת עם 100 מיקרומטר לסנן. כדי להסיר ביעילות את כל התאים, לגרד את פני השטח הפנימיים של העצמות באמצעות מחט 25 מד. </li></ol> הערה: חליטה של ​​עצמות מצביעה על כך שהתאים כבר גרד מספיק. הערה: השתמש כ 10 מ&quot;ל של תקשורת כדי לשטוף זוג שוקה ירך /. הוספת EDTA למדיום היא חיונית כדי למנוע יצירת גושים של התאים. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עצם אפיפיזותב 3 חתיכות קטנות 0.5-1 מ&quot;מ עם אזמל ולנפץ אותם דרך מסנן 100 מיקרומטר באמצעות הקצה האחורי של 2.5 מ&quot;ל אפנדורף Combitip פלוס קצה פיפטה Biopur. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב -1,400 סל&quot;ד במשך 7 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse את כדוריות הדם האדומים על ידי resuspending התא גלולה ב 20 מ&quot;ל של 0.2% NaCl לכ 20 שניות אחריו תוספת של 20 מ&quot;ל של 1.6% NaCl. (קריטי: לא יעלה על 20-30 שניות של תמוגה hypotonic כדי למנוע מוות של תאי מוח עצם השימוש בhypotonic NaCl לתמוגה מומלץ על חיץ lysing ACK משום שהאחרון יש הפוטנציאל להפעיל את נויטרופילים.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 1400 סל&quot;ד ב 4 ° C כדי לאסוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם RPMI 1X 1640 בתוספת 10% FBS ו 2 מ&quot;מ EDTA וצנטריפוגות כמו בשלב 1.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התשואה של תאים במח עצם בשיטה זו היא כ 60-80,000,000 לC57BL בן שבוע 8-12 נגוע / 6 עכבר. </li></ol> 2. הפרדה של נויטרופיליםעל ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי מח העצם וresuspend ב 1 מ&quot;ל של PBS סטרילי קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של Histopaque 1119 (צפיפות, 1.119 גרם / מ&quot;ל) בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת 3 מ&quot;ל של Histopaque 1077 (צפיפות, 1.077 גרם / מ&quot;ל) ב 3 מ&quot;ל של Histopaque 1119. </li></ol> הערה: Histopaque 1119 וHistopaque 1077 יש לחמם ל18-26 מעלות צלזיוס לפני השימוש. שלב קריטי: הכן הדרגתיים מייד לפני שימוש כהכנת השיפוע מראש יגרום לדיפוזיה בין שתי השכבות וטוהר נויטרופילים הכי מוצלח והתאוששות. שלב קריטי: כיסה Histopaque 1077 על 1119 שצריכים להיעשות באיטיות על מנת להימנע מערבוב שתי הצפיפויות, אשר ימנעו הפרדת תא במהלך צנטריפוגה. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי ההשעיה תא מוח העצם על גבי Histopaque 1077. </li></ol> שלב קריטי: Overlaying ההשעיה תא מוח העצם מעל 1077 הצרכים Histopaque להיעשות באיטיות על מנת למנוע הפרעה לממשק בין התאים וHistopaque 1077. הערה: resuspending תאי מח עצם מעכבר נגוע ב1 מ&quot;ל של PBS מניב טוהר של נויטרופילים&gt; 90%. עם זאת, איגום דגימות מח עצם רבים פוגע בטוהר נויטרופילים, למשל, resuspending 300 x 10 6 תאים ב3 מ&quot;ל PBS מפחית טוהר נויטרופילים מ&gt; 90% ל ~ 80%. לכן, חוקרים צריכים לבצע ניסויי פיילוט על מנת לזהות את התנאים לספור / נפח התא האידיאלי עבור הניסויים הספציפיים שלהם <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 30 דקות ב -2,000 סל&quot;ד של 25 מעלות צלזיוס, ללא בלם. </li></ol> הערה: צנטריפוגה של הצבע בטמפרטורת חדר היא קריטית וחיונית להפרדה יעילה של נויטרופילים. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הנויטרופילים בממשק של 1119 Histopaque וHistopaque 1077 שכבות. </p&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הנויטרופילים נאספו פעמיים עם RPMI 1640 1X בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ו צנטריפוגות ב -1,400 סל&quot;ד במשך 7 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את הנויטרופילים ולקבוע הכדאיות שלהם. </li></ol> הערה: נויטרופילים הם בדרך כלל&gt; 95% קיימא ו&gt; 90% טהורים, כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS. התשואה הטיפוסית של נויטרופילים ממח העצם (עצם ירך 2 כלומר 2 ועצמות שוקה) של C57BL בן שבוע 8-12 נגוע / 6 תאי עכבר היא ~ 6-12,000,000. מספר זה הוא באופן משמעותי יותר כאשר נויטרופילים נקצרים ממח עצם של בעלי חיים נגועים. לפיכך, ~ מיליון נויטרופילים / עכבר 30-40 התגלו כאשר עכברים נגועים בקנדידה שמשו לקצירת תא 6. 3. תיוג של נויטרופילים באמצעות צבעי CellTracker <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הנויטרופילים ב5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל PBS prewarmed על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף צבע CellTracker בconcent סופימנה של 5 מיקרומטר. </li></ol> הערה: CellTracker גרין (CMFDA (diacetate 5 Chloromethylfluorescein) וCellTracker אורנג&#39; (CMTMR (5 - (ו- 6)-4-Chloromethyl Tetramethylrhodamine אמין בנזואיל) היה בשימוש בפרוטוקול זה כדי לתייג נויטרופילים באופן דיפרנציאלי מהסוג פרוע וגן לקוי עכברים. הערה: הכן פתרון המניות של 10 מ&quot;מ של גרין CellTracker וCellTracker אורנג&#39;, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד היום של הניסוי. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נויטרופילים עם 5 מיקרומטר של צבע CellTracker המקביל למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים רועדים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמיים עם תאי RPMI 1X 1640 קר כקרח בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. </li></ol> הערה: כביסה יעילה של התאים לאחר צעד התיוג עם צבע CellTracker הוא חיוני, כדי למנוע זיהום צולב צבע לפני ערבוב אוכלוסיות נויטרופילים דיפרנציאלי שכותרת לירידותמחקרי Repopulation תחרותיים tream. 4. העברת מאמצת של נויטרופילים בעכברים ובניתוח של נויטרופילים המועברים באמצעות cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נויטרופילים Resuspend ב קר כקרח PBS בריכוז של 25 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ולהזריק 200 μl של ההשעיה לוריד הזנב לרוחב כך ש5 x 10 6 נויטרופילים מועברים לכל עכבר. ללימודי נויטרופילים Repopulation תחרותיים, לערבב נויטרופילים wild-type והגן לקויים בביחס 1:1 ולהזריק כולל של 5 x 10 6 נויטרופילים לכל עכבר כאמור לעיל. </li></ol> הערה: לפחות עד 10 x 10 6 נויטרופילים ניתן להעביר adoptively לכל עכבר ללא רעילות מיידית ברורה לבעלי החיים. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמנים שונים לאחר העברת מאמצת (למשל 1, 2, 3 או 4 שעות שלאחר העברה), להרדים עכברים ודם קציר, ו / או מח עצם ו / או איבר המטרה אחר (ים) של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את siהשעיות ngle סלולריים מרקמות אלה לניתוח כמותי ואיכותי של נויטרופילים הועברו adoptively כותרתו תוך שימוש בפרוטוקולים שפורסמו 6,15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צביעה חי / מת כדאיות וסגר FC, תאי תווית עם CD45 (שיבוט 30-F11), Ly6G (שיבוט 1A8) וCD11b (שיבוט M1/70) ושער בשידור החי בCD45 + + Ly6G CD11b + נויטרופילים. נויטרופילים בשער זה כוללים נויטרופילים ילידים של עכבר הנמען, כמו גם את נויטרופילים שהכותרת הועבר adoptively, שהם + FITC (אם מסומן עם CellTracker הירוק) או PE + (אם תווית עם מעקב הסלולרי אורנג&#39;). </li></ol> הערה: נויטרופילים עשויים להיות במעקב בדם, מח עצם וכליה של עכברים נגועים בקנדידה להעברה לאחר לפחות 4 שעות. הערה: קיבוע עם paraformaldehyde 2% ב-PBS אינו משפיע על עוצמת הקרינה הממוצעת של נויטרופילים שכותרתו עם Gr CellTracker רעהeen או CellTracker אורנג&#39; לפחות 48 שעות.

<ol>
	<li>Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+host+defense.">Neutrophils and host defense.</a> Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).</li><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).</li><li>Blomgran, R., Ernst, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+neutrophils+facilitate+activation+of+naive+antigen-specific+CD4++T+cells+during+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).</li><li>Narasaraju, T., Yang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+neutrophils+and+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+acute+lung+injury+of+influenza+pneumonitis.">Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis.</a> Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).</li><li>Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+Ccr1+drives+neutrophil-mediated+kidney+immunopathology+and+mortality+in+invasive+candidiasis.">Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis.</a> PLoS Pathog. 8 (8), (2012).</li><li>Casc&#227;o, R., Ros&#225;rio, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+rheumatoid+arthritis:+More+than+simple+final+effectors.">Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors.</a> Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).</li><li>Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs.">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+isolation+of+neutrophils+from+murine+blood+using+negative+immunomagnetic+separation.">A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation.</a> Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).</li><li>Hasenberg, M., K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).</li><li>Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+antibacterial+host+defense+in+mice+lacking+the+N-formylpeptide+receptor.">Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor.</a> J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).</li><li>Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice.">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).</li><li>Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+and+CXCR4+antagonistically+regulate+neutrophil+trafficking+from+murine+bone+marrow.">CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow.</a> J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).</li><li>Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+innate+immune+responses+in+a+mouse+model+of+invasive+candidiasis.">Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis.</a> J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).</li><li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pouri&#233;, C., Steinckwich, N., Dournon, C., N&#252;sse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils.">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+negative+enrichment+of+CD4++and+CD8++T+cells+from+murine+spleen+via+nylon+wool+adherence+and+an+optimized+antibody+cocktail.">Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail.</a> J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).</li><li>Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17RA+signaling+reduces+inflammation+and+mortality+during+Trypanosoma+cruzi+infection+by+recruiting+suppressive+IL-10-producing+neutrophils.">IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).</li><li>Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+screen+identifies+reactive+oxygen+species+as+key+regulators+of+neutrophil+chemotaxis.">Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).</li><li>Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roff&#234;, E., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Chemokine+Receptor+Ccr7+Exacerbates+Atherogenesis+in+ApoE-deficient+Mice.">Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice.</a> Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).</li><li>Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+the+reciprocal+production+of+granulocytes+and+lymphocytes+in+bone+marrow.">Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow.</a> J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).</li><li>Berkow, R. L., Dodson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+evaluation+of+mature+neutrophils+from+human+bone+marrow.">Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow.</a> Blood. 68 (4), 853-860 (1986).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

בזאת אנו מציגים פרוטוקול אמין, פשוט, מהיר וחסכוני לבידוד של מספר גדול של נויטרופילים ממח העצם של עכברים עם טוהר גבוה וכדאיות באמצעות גישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות. כאשר פרוטוקול זה מתבצע בצורה נכונה, יכולים להיות התאוששו ~ 6-12 × 10 6 נויטרופילים מעכבר נגוע ורבים כמו ...

הנויטרופילים הם לויקוציטים הנפוץ ביותר בבני אדם. הם המרכיב התאי העיקרי של מערכת החיסון המולדת ולפעול כקו הגנה ראשון נגד הפולשים מיקרואורגניזמים. חולים עם נויטרופניה רכשה וimmunodeficiencies העיקרי המשפיעים על מספרים ו / או פונקצית נויטרופילים לפתח זיהומים, המדגישים את החשיבות של תאים אלה בשורת 1 הגנת חיידקים ופטריות פולשניות מסכנות חיים. הכרה חיסונית של פלישת פתוגנים באתר הזיהום על ידי תוצאות זיהוי ההכרה הקולטנים מאותו המקור שלהם באינדוקציה של תגובה חיסונית מולדת מתוזמרת, מה שמוביל להפרשת chemoattractants שיוצרים שיפוע chemotactic מסוגלים נויטרופילים גיוס ממחזור הדם לתוך הרקמה הדלקתית 2 . לאחר נויטרופילים להיכנס לאתר הזיהום, הם הופכים להיות פעילים, מה שמוביל לציטוקינים וchemokine ייצור, ספיגת הפתוגן, והרג דרכי חמצוני והלא חמצוניchanisms 3. חוץ מזה התפקיד שלהם המוכר היטב בחסינות מולדת, נויטרופילים יש גם הוכחו לאחרונה לתפקיד חשוב כיוזמי תגובות חיסוניות אדפטיבית יעילות 4. מצד השני, מלבד התפקידים המגן שלהם בחסינות, נויטרופילים עשויים גם לתווך פגיעה ברקמות וimmunopathology בשל צבירה ו / או הפעלה באתרים של דלקת מוגזמת, כפי שמוצגים במגוון רחב של מחלות זיהומיות ומחלות אוטואימוניות 5-7. למרות התפקיד החיוני של נויטרופילים בתגובות חיסוניות מולדות הרכבה יעילות ופונקציות מפעיל pleiotropic בכמה מחלות זיהומיות ומצבים דלקתיים, בעיות טכניות בטיפול בתאים אלה וחוסר פרוטוקולי ניסוי אמינים עכב מחקר עם נויטרופילים בעשורים האחרונים. לכן, שימוש במבחנים לשעתק לבידוד של נויטרופילים צריכים להקל על מחקר נוסף על immunolo נויטרופילים בתיווךvivo gical הפונקציות לשעבר וin vivo. נכון להיום, מספר שיטות שתוארו לבידוד של נויטרופילים כגון צנטריפוגה צפיפות שיפוע של דם אדם ודם עכבר או מח עצם 8,9, העשרת immunomagnetic חיובית או שלילית של נויטרופילים מדם עכבר או מח עצם 10,11, וקציר של נויטרופילים מחלל הצפק של עכברים לאחר הזרקת intraperitoneal של thioglycollate או סוכנים דלקתיים אחרים 12. למרות שיכולים להיות מבודד בקלות נויטרופילים במספרים גדולים מדם אנושי, שיטה זו היא הכי מוצלח בעכברים, בשל הכמות המוגבלת של דם עכבר שמונע בידוד של נויטרופילים מספיקים ללימודים תפקודיים או ניסויי העברת מאמצת 13. בנוסף, למרות שהתשואה של thioglycollate-הושרה התאים מחלל הצפק הוא גדולים יותר בהשוואה לזה של דם עכברים, טוהר של נויטרופילים בשטיפת הצפק הדלקתי משתנה בין60-90%, ונויטרופילים המבודדים תערוכת פנוטיפ הופעל. לכן, התאים שנאספו בשיטה זו ניתן להשתמש רק לביצוע מחקרים תפקודיים של הופעל אך לא של נויטרופילים unstimulated, כחלל הצפק העכבר יש כמה נויטרופילים במצב היציב 12. במקום זאת, מח העצם הוא מאגר נוח לקצירת מספרים גדולים של שני unstimulated או הופעלו נויטרופילים 11,14, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בם ללימודי המשך, פונקציונליים, כגון phagocytosis, הרג וdegranulation, או להעברת מאמצת לעכברים נמען. בזאת אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (~ 2 שעות), המספק תשואה גבוהה (6-12 ~ 10 × 6 נויטרופילים / עכבר נגוע, או עד 30-40 × 10 6 נויטרופילים / עכבר נגוע) של (80 טהורים -95%) נויטרופילים עם&gt; כדאיות 95% ממח העצם. שיטה זו משתמשת Histopaque זמין באופן מסחרי, שהם נפרדים תא שיפוע צפיפותתקשורת מזון בהיקף של Ficoll וdiatrizoate נתרן, כדי להפריד בין נויטרופילים ממח העצם של עכברים. שיטה זו מניבה מספרים גדולים יותר באופן משמעותי של נויטרופילים לכל עכבר בהשוואה לדם או חלל הצפק, זה יכול לשמש כדי לאסוף נויטרופילים מעכברים הן במצב יציב או לאחר הדבקה, וזה קל יותר לשכבה בהשוואה לשיטת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות המשתמשת רציף הדרגתיים Percoll בהיקף של 55% / 65% / 75% בPercoll PBS 9. בנוסף, הזמן והמשאבים הנדרשים לאיסוף נויטרופילים טהורים הם ירדו באופן משמעותי בהשוואה לבידוד נויטרופילים באמצעות מיון תא הקרינה המופעל. כמו כן, מכיוון ששיטה זו אינה כרוכה בצעד העשרת immunomagnetic, זה יותר יעיל וחסכוני, וזה ימנע את החשיפה של תאים לעמודה ונוגדנים מגנטיים, וכך להקטין את הסבירות להפעלת נויטרופילים. בנוסף לביצוע מחקרים תפקודיים של neutroph המבודדILS לשעבר vivo והעברת מאמצת של תאים לעכברים נמען, פרוטוקול זה גם מתאר שיטה לתיוג של נויטרופילים המבודדים באמצעות צבעי CellTracker שונים. תיוג ההפרש של נויטרופילים מעכברים של רקע גנטי שונים יכול להיות מותאם במחקרי Repopulation התחרותיים למעקב אחר נויטרופילים שהועברו ברקמות של עכברי נמען באמצעות cytometry זרימה, אשר יכול לספק תובנה מכניסטית בתפקיד הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם ליעד איברים מודלקים 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
 <td>GemCell</td>
 <td>100500</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td>Quality Biological Inc</td>
 <td>351-027-101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.2% and 1.6% sodium chloride</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3624</td>
 <td>Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1077</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>10771</td>
 <td>Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1119</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>11191</td>
 <td>Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>210-40-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
 <td>The Warner Graham Company</td>
 <td>64-17-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-7025</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-2927</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>170451-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>551461</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>560599</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>47-0112-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>553141</td>
 <td>Use at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-23105</td>
 <td>Use at 1:1000 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>67-68-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
 <td>USB Corporation</td>
 <td>19943</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Taconic</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430053</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml centrifuge tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229225B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229210B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229205B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes (3 ml)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>357575</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 ml syringes</td>
 <td>Kendall monoject</td>
 <td>512878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
 <td>BD</td>
 <td>305122</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 mm cell strainers</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352360</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bactericidal Petri dishes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>351029</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Combitips Plus Biopur</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>2249608-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)</td>
 <td>Biomedical Research Instruments</td>
 <td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td>
 <td>Instruments sterilized prior to use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>The Baker Company</td>
 <td>SG403</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated centrifuge</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>75004521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37 &deg;C shaking water bath</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>3166721</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments

הנויטרופילים הם תאי מפעיל קריטיים של מערכת החיסון המולדת. הם גויסו במהירות באתרים של דלקת חריפה והשפעות המגנות או פתוגניים בהתאם לסביבה הדלקתית. יחד עם זאת, על אף התפקיד החיוני של נויטרופילים בחסינות, הבנה מפורטת של הגורמים המולקולריים המתווכים השפעות מפעיל וimmunopathogenic &#39;נויטרופילים במחלות זיהומיות שונות ומצבים דלקתיים עדיין חסר, גם בגלל זמן מחצית החיים הקצר שלהם, את הקשיים בטיפול באלה תאים והעדר פרוטוקולי ניסוי אמינים להשגת כמות מספקת של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם וניסויים העברת מאמצת. לכן, שיטות פשוטות, מהירות, חסכונית ואמינות הן רצויות מאוד לקציר בכמות מספקת של נויטרופילים עכבר להערכת פונקציות כגון phagocytosis, הרג, ציטוקינים ייצור, degranulation וסחר בנשים. לשם כך,אנו מציגים פרוטוקול לשעתק צפיפות שיפוע מבוסס צנטריפוגה, אשר יכולה להיות מותאם בכל מעבדה לבודד מספר גדול של נויטרופילים ממח העצם של עכברים עם טוהר וכדאיות גבוהים. יתר על כן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט שמשתמש בצבעי CellTracker לתייג את נויטרופילים הבודדים, אשר לאחר מכן ניתן להעביר adoptively לעכברים נמען ולעקוב אחריו בכמה רקמות להעברה לאחר לפחות 4 שעות באמצעות cytometry זרימה. שימוש בגישה זו, תיוג ההפרש של נויטרופילים מעכברי wild-type והגן לקויים עם צבעי CellTracker שונים יכול להיות מועסק בהצלחה לבצע מחקרי Repopulation תחרותיים להערכת התפקיד הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם אל רקמות יעד in vivo .

פרוטוקול זה הוא מותאם לקציר של תאים במח עצם מעכברים וההפרדה הבאה של נויטרופילים מתאי אלה על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות באמצעות מדיה הפרדת תא Histopaque זמינה מסחרי. נויטרופילים מבודדים באמצעות שיטה זו יכולה לשמש למגוון רחב של מחקרי vivo לשעבר התפקודי במורד הזרם ולני?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments at JoVE.com

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד וטיהור של נויטרופילים ממח עצם בעכבר על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות ותיוג באמצעות צבעי CellTracker נויטרופילים. זה מייצג שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור וחסכוני להשגת מספר גדול של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם או ניסויי העברה ומעקב מאמצים.

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

isolation-purification-labeling-mouse-bone-marrow-neutrophils-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.4K Views.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. אנו מתארים פרוטוקול לבידוד וטיהור של נויטרופילים ממח עצם בעכבר על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות ותיוג באמצעות צבעי CellTracker נויטרופילים. זה מייצג שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור וחסכוני להשגת מספר גדול של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם או ניסויי העברה ומעקב מאמ...

Video: Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

בידוד ואפיון של נויטרופילים, נגזר Microparticles ללימודי פונקציונלי

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.