אנו מודים ד ר סיימון ברטלט לצורך עריכה באנגלית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), ושל מיגל Servet התוכנית Fundación רמון Areces; עם השתתפות במימון של הועדה המחוזית Fondo Europeo דה Desarrollo (פדר). CNIC נתמך על ידי משרד הכלכלה, התעשייה, תחרותיות (MEIC), קרן CNIC Pro, Severo אוצ'ואה התמחות (SEV-2015-0505). RTF היא נוסדה על ידי Fundación רמון Areces, CNIC, VZG על ידי ISCIII, BHF על ידי דה אינסטיטוטו Investigación Sanitaria חולים 12 דה אוקטוברה (imas12) ו- jmg ב- G על ידי תוכנית Servet של מיגל ISCIII imas12.

נהלים ניסיוני אושרו על-ידי Fundación Centro נאסיונאל דה Investigaciones Cardiovasculares קרלוס השלישי (CNIC), את Autónoma קומונידד דה מדריד בהתאם להנחיות והאירופאים. עכברים התרבית פתוגן מסוים התנאים (SPF) חינם, היו מורדמים על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני (CO2).
1. בידוד תאי מח עצם העכבר מ Tibias ועצמות ירך
הערה: המתח העכבר congenic C57BL/6 נושאת ליקוציט דיפרנציאלית הסמן Ptprc, כלל מוכרות כמו CD45.1 או Ly5.1, ואילו פראי-סוג C57BL זנים לשאת אלל Ptprcb , המכונה CD45.2 או Ly5.2. CD45.1 ו- CD45.2 משתנים ניתן לזיהוי על-ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים. עכברים CD45.1, CD45.2 ו CD45.1/CD45.2 יכול לשמש כמקורות התא או הנמענים להעברת המאמצת, המתיר העקיבה של אוכלוסיות תאים נפרדים על-ידי cytometry זרימה. מעדיפים להשתמש גיל- ועכברים מתאימים-מין זכריים או נקביים מתחת גיל 12 שבועות.
<ol><li>
הכנת עצמות הירך, Tibias
	<ol>
<li>המתת חסד עכברים באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים.</li>
		<li>לחטא את הגפיים האחוריות ע י ריסוס על פני חיים עם 70% אתנול.</li>
		<li>להשתמש במספריים סטרילי, מלקחיים, ואזמלי מנתחים. עם איזמל, לעשות חתך בעור ולהסיר את העור מן החלק הדיסטלי של העכבר כולל את העור המכסה את קצות הגפיים האחורי. לקלף את העור סביב שריר עגל נמוך יותר ולהסיר את העור מן הרגליים לחלוטין (איור 2 א, 2 ב).</li>
		<li>להפריד את השריר הארבע ראשי בין עצם הירך באמצעות אזמל. Disarticulate מפרק הירך מבלי לשבור את הראש של עצם הירך. הסר את השרירים בשוקיים באמצעות אזמל (איור 2C, 2D). להפריד בין עצם הירך לבין עצם השוקה מבלי לשבור את קצות העצם.</li>
		<li>שמור את העצמות בצלוחית המכילה 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין במדיום רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 x 1 קרה כקרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תא בידוד הערה: כל השלבים הבאים חייב להתבצע תחת ברדס תרבות ועם חומר סטרילי כדי למנוע זיהום.<ol>
<li>בצלחת פטרי סטריליות, בזהירות לחתוך את קצוות לקרע, כל עצם עם אזמל.</li>
		<li>לרוקן את העצמות שוב ושוב עם הנפח הכולל של 10 מ"ל של מדיום חם RPMI מלאה (RPMI + 10% FBS, 2 מ מ EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 20 מ מ HEPES, 55 מיקרומטר מרקפטואתנול, פירובט נתרן 1 מ מ ו- 2 מ מגלוטמין). לרוקן את העצמות משני הכיוונים באמצעות מחט 25 גרם המצורפת מזרק 1 מ"ל.</li>
		<li>להעביר את effluate צינור חרוטי 50 מ ל מצויד במסנן אינטרנט 70 מיקרומטר ניילון. בזהירות לסלק פסולת ותא וקונצרנים על ידי ערבוב עדין ו pipetting.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב x 250 g 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר קר פירוק תאי דם אדומים (0.15 מ' NH4קלרנית + 1 מ"מ KHCO3 + 0.1 מ"מ EDTA, מנוכי עונתיות pH עד 7.2 עם HCl N 1, מיקרומטר 0.4 סטרילי מסונן, ומאוחסנים ב 4 ° C). לשמור בקירור למשך 5 דקות עם המדריך רועדת.</li>
		<li>להוסיף 10 מ ל מאגר קר (1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) + 2 מ מ EDTA + 2% אלבומין שור (BSA)) בטל. ולשטוף את המאגר פירוק תאי דם אדומים.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>לשטוף תאים עם 25 מ ל בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>Resuspend התאים 5 מיליליטר בינוני RPMI מלאה. מערבבים 50 µL של התליה תא 1:1 עם trypan blue. לקבוע את מספר הנייד בחדר הספירה תחת מיקרוסקופ. לחשב את מספר הנייד באמצעות הנוסחה: תאים למ"ל = [(ספירת תאים שאינם שהוכתמו/4) x 2 x 10,000]12. הערה: עצם זה התשואות 40 x 10 בשיטה6 עד 60 x 106 תאים במח לכל 8-12 בת שבוע C57BL/6 העכבר נגוע.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DC בידול, ההבשלה וטעינה אנטיגן
<ol><li>
תא מוניטור קציר
	<ol>
<li>זרע התרבות מלאה על 6-ובכן נמוך במיוחד-מצורף משטח צלחות-106 תאים לכל מיליליטר בינוני, בדרך כלל ב 5 מ לכל טוב. מקרופאגים הבדיל לצרף התרבות-הצלחות. לאחר 12 שעות, להעביר את תגובת שיקוע, המכיל בעיקר ומונוציטים, לנקות צלחות 6-ובכן, השמטת צלחות 6-ובכן הישן עם המקרופאגים מודבקת.</li>
		<li>לקדם תאית התמיינות, התרבות התאים שאינם מחסידי ב 5 x 10 תאי5 מ ל בדרך כלל 5 מ"ל לכל טוב של בינוני RPMI מלאה המכילה 20 ng/mL מסחרית שהושג רקומביננטי מאתר GM-CSF-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2), התבונן מדי יום.</li>
		<li>כל 3 ימים, ספין למטה תאים מושעה לאסוף את תאים חסיד עם 5 מ מ EDTA ב- PBS ו ספין למטה. לשלב, resuspend ב 5 x 105 תאים למ"ל בינוני טריים המכילים 20 ng/mL rm-GM-CSF.</li>
		<li>ביום 8, לאסוף תאים חסיד ומנותק כאמור לעיל ו- resuspend-5 x 105 תאים למ"ל בשנת בינוני המכיל 20 ng/mL GM-CSF ו ng/mL 20 ליפופוליסכריד (LPS) במשך 24 שעות ביממה בשאינם תרביות רקמה-מטופלים עקר פטרי, לזירוז גבוהה MHC-II , ביטוי CD80 ו- CD86.</li>
		<li>בידול DC הסימון מאת cytometry זרימה כפי שמצוין בשלב 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בידול Cytometry זרימה וניתוח ההבשלה.
	<ol>
<li>Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C. חזור על שלב זה פעמיים.</li>
		<li>Fc לחסום קולטנים מאת המקננת בגדר תא resuspended ב העכבר Fc קולטן חוסם הפריטים המוקפצים (מטוהרים אנטי עכבר נוגדן2b אג CD16/CD32) למשך 15 דקות ב 4 ° C לפי הוראות היצרן.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>עבור כל בדיקה, resuspend 250,000 בתאים µL 300 מאגר cytometry זרימה (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) ב 4 º C.</li>
		<li>להעביר 30 µL של התא פתרון לכל טוב 96-ובכן-צלחת.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע והוסף 30 µL של נוגדן המכיל מאגר כדי כל גם בעקבות האינדיקציות של היצרן. דגירה התאים עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 º C. הערה: בדרך כלל המועסקים סמנים עבור בקרי קבוצת מחשבים, ומונוציטים ו מקרופאגים הם CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 ו CD86 (איור 3).</li>
		<li>Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend ב µL 200 לאדם טוב של מאגר cytometry זרימה קר המכילה סמן כדי לא לכלול תאים מתים (למשל, propidium יודיד, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) או של צבע אמין-ריאקטיבי )-הריכוז המומלץ של היצרן13.</li>
		<li>צג התמיינות תאים על-ידי העברת הדגימות צינורות cytometry זרימה וביצוע הניתוח cytometry זרימה לא כולל תאים מתים בימים 0, 3, 6 ו- 9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טעינת DC אנטיגן.
	<ol>
<li>יום 8, centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי במדיום µL 200 (RPMI + 10% FBS ללא אנטיביוטיקה). חזור על שלב זה פעמיים.</li>
		<li>דגירה Dc עם µg/mL 10 OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) לכל עונה 1 פרק 107 DCs ב 1 מ"ל של מדיום (RMPI + 1% FBS) צינור פלסטיק במשך לפחות 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש DCs שאינם טעונים OVAp כתנאי שליטה שלילי.</li>
		<li>Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי 200 µL בינוני RPMI מלאה. חזור על שלב זה פעמיים.</li>
		<li>Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי במדיום µL 200 (RPMI + 10% FBS)-עונה 2 פרק 106 תאים/מ ל....</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. בידוד תאי T CD4 תמים מן OTII עכברים
הערה: שיטה זו מניבה כ 100 x 10 spleenocytes6 לכל 8 נגוע העכבר C57BL/6 בת שבוע 12. הן הזכרים והן הנקבות יכול לשמש. תאי CD4 T ניתן לבודד את הטחול או בלוטות הלימפה; תאי CD4 T חשבון עבור 25% ו- 50% של תאים באיברים אלה, בהתאמה. בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים.
<ol><li>לבודד מפשעי בבית השחי, נחתכו, צוואר הרחם, מצע המעי העליון בלוטות הלימפה והטחול מן העכברים הטרנסגניים OTII (איור 4) ומעבירים אותם אל פלסטיק פטרי המכיל 10 מ"ל של מדיום RPMI מלאה.</li>
	<li>לשטוף את מסננת תא 2 מ של מדיום RPMI מלאה ולהסיר אותו מהצינור 50 מ. העברת הלימפה והטחול כדי מסננת תא מיקרומטר 70 הניח צינור 50 מ. Homogenize באמצעות מזרק בוכנה (איור 5) ולהוסיף בינוני עד 15 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend בגדר ב-15 מיליליטר בינוני RPMI מלאה. חזור על שלב זה פעמיים.</li>
	<li>הטחול תא השעיה, resuspend בגדר התא ואת lyse כדוריות דם אדומות כפי שמצוין בשלב 1.2.5.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף תאים עם 25 מ ל בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g למשך 5 דקות ב- RT.</li>
	<li>Resuspend התאים 5 מ של מדיום. מערבבים 50 µL של התליה תא 1:1 עם Trypan blue. לקבוע את מספר הנייד באמצעות חדר הספירה תחת מיקרוסקופ. לחשב את מספר הנייד באמצעות הנוסחה: תאים למ"ל = [(ספירת תאים שאינם שהוכתמו/4) x 2 x 10,000]12.</li>
	<li>חזור על שלב 2.2.2.</li>
	<li>עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, דגירה התאים עם 1:800 דילולים של נוגדנים biotinylated CD8α IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25, DX5 במשך 30 דקות על הקרח מאוחר יותר שלילי לבחירה של תאי CD4 T.</li>
	<li>ההוראות של היצרן, בהתבסס על מספר התאים לבין היכולת של החרוזים, לחשב את הכמות הנדרשת של גרגרי מגנטי מצופה streptavidin בידוד תאי CD4 T באמצעות מפריד תא מגנטי המתאים ההפרדה עמודות.</li>
	<li>Resuspend התאים 5 מיליליטר בינוני RPMI מלאה ולשמור אותם על קרח בזמן ספירת תאים חיים כפי שמתואר בשלב 3.7.</li>
	<li>חלץ 2 x 105 תאים וסמנו את הטוהר של התאים שנאספו באמצעות אנטי CD4, CD3, B220 ו CD8 נוגדנים פלורסנט ב cytometer זרימה באמצעות ממליץ יצרן דילולים נוגדן.</li>
	<li>כתם תאי CD4/OTII T נאיבי מבודד-resuspend 106 תאים במאגר µL 500 (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA). הכנת 500 µL המכיל מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) להכפיל את הריכוז מומלץ היצרן הסופי של התא חיוני מעקב לצבוע. לערבב שני פתרונות על-ידי הוספת לאט הפתרון מעקב תא התליה תא. דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעמיים. Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיום RPMI מלאה-עונה 1 פרק 107תאים/מ ל....</li>
</ol>4. הפעלת in Vivo , התפשטות, Th1 בידול Assay
הערה: תא חיוני מעקב צבע carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFSE), אחרים succinimidyl מבוסס-אסתר צבעים, אשר שמחים, פולטים קרינה פלואורסצנטית באורכי גל שונים, נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך את התפשטות לימפוציטים על ידי זרימת cytometry שלהם בעוצמה גבוהה פלורסצנטיות, חיים ארוכים, השתנות נמוך וכתוצאה רעילות נמוכה14.
<ol><li>Adoptively להעביר דרך הווריד (עירוי) עונה 1 פרק 106 התא חיוני בשידור חי מעקב תמים שהוכתמו לצבוע T CD4/OTII בתאים µL 100 ל- PBS לכל העכבר. תאי T עם תוויות יכול להיות הועבר adoptively על-ידי וריד הזנב או רטרו-מסלולית הזרקת15; בשני המקרים, התאים בית לאיברים הלימפה (איור 6A).</li>
	<li>אתגר העכברים הנמען יום אחד מאוחר יותר על ידי העברת adoptively 100,000 התבגר-LPS טעונים OVAp DCs בזריקה תת עורית (ס. י) ב- footpads (איור 6B).</li>
	<li>הקציר popliteal הלימפה עכברים הנמען ולעבד אותם עד הקניית המתלים תא בודד ביצוע הפעולות המתוארות כאמור 3.1 ו- 3.2. לעשות זאת על חיסונים שלאחר יום 2 כדי למדוד את הפעלת תא T CD4/OTII ועל יום 5 כדי למדוד את התפשטות פלוס Th1 בידול.</li>
	<li>כדי לנתח את תא T הפעלה ביום 2, כתם תאים עם פלורסנט נוגדנים נגד CD4, CD69 ו CD25 (לחלופין CD45.1 ו- CD45.2), לקבוע את אחוזי C69+CD25+ T תאים באוכלוסיה CD4. ניתוח על ידי cytometry זרימה (איור 7).</li>
	<li>כדי לבדוק את תא T התפשטות ביום 5, כתם תאים באמצעות נוגדנים פלורסנט המתאים CD4, ובמידת CD45.1, CD45.2. לנתח את הדעיכה של האות לצבוע תא חיוני מעקב באוכלוסייה CD4 ידי cytometry זרימה (איור 8). מספר פרמטרים יכול להיקבע במחקרים אלה, כגון מספר חלוקות תאים עברה על ידי תאים בלוחיות לצבוע מעקב תא חיוני האחוז של תאים שיחצה כל שיא פלורסצנטיות, אחוז התאים החלוקה בתא סכום אוכלוסייה.</li>
	<li>כדי לקבוע Th1 בידול ביום 5, צלחת תאים 400,000 לכל טוב של צלחת 96-ובכן ב- 200 µL בינוני RPMI מלאה המכילה 1 מיקרומטר ionomycin ו 10 ננוגרם למ"ל phorbol 12 פעילים 13 אצטט (PMA) עבור 6-אייץ ' ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. במשך 4 שעות האחרונות, להוסיף 3 – 10 µg/mL brefeldin כדי לחסום את הפרשת ציטוקינים למדיום.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך מהיר של צלחת 96-ובכן.</li>
	<li>חזור על שלב 2.2.2.</li>
	<li>כתם קרום התא על ידי המקננת למשך 15 דקות ב 4 ° C ב- 30 µL מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) המכיל נוגדנים ל CD4 ולבחירתך גם CD45.1, CD45.2-דילולים יצרן-מומלץ. לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 150 מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA), centrifuge את הצלחות במשך 5 דקות ב x 250 g ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לתקן התאים על-ידי הוספת µL 100 של paraformaldehyde/1% 2% סוכרוז למשך 20 דקות ב- RT. צנטריפוגה הלוחות עבור 5 דקות ב x 1000 g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Permeabilize בתאים על-ידי הוספת µL 50 permeabilization תאיים מאגר (1 x PBS + 0.1% BSA, 0.01 M HEPES, סאפונין 0.3%) ואת תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להוסיף 150 µL של PBS, צנטריפוגה עבור 5 דקות בכל 1,000 x g ב- RT. להשליך תגובת שיקוע.</li>
	<li>כתם ציטוקינים תאיים על-ידי הוספת 30 µL של fluorophore-מצומדת אנטי-נוגדן IFNγ במאגר (PBS + 0.1% סאפונין) ואת תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.</li>
	<li>לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 150 מאגר (PBS + 0.1% סאפונין). Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 1000 g ב- RT וזורקים את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים.</li>
	<li>לנתח אוכלוסיות תאים על-ידי cytometry זרימה (איור 8).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+effector+CD4+T+cell+populations+(*).">Differentiation of effector CD4 T cell populations (*).</a> Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).</li><li>Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+Lymphocyte+Polarity+in+Cognate+Immune+Cell-Cell+Interactions.">Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).</li><li>Gonzalez-Granado, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+lamin-A+couples+actin+dynamics+with+immunological+synapse+architecture+and+T+cell+activation.">Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation.</a> Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).</li><li>Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+lamin-A+as+a+coordinator+of+T+cell+activation.">Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation.</a> Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).</li><li>Rocha-Perugini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD9+Regulates+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Trafficking+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells.">CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).</li><li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+and+memory+T-cell+differentiation:+implications+for+vaccine+development.">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li><li>Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Differentiation+of+Naive+CD4(+)+T+Cells:+A+Tool+for+Understanding+the+Development+of+Atherosclerosis.">In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).</li><li>Toribio-Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+augments+Th1+differentiation+and+response+against+vaccinia+virus+and+Leishmania+major.">Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (1), 9 (2018).</li><li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice.">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).</li><li>Cruz-Adalia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+CD4(+)+T+cells+present+bacterial+antigens+to+induce+cytotoxic+and+memory+CD8(+)+T+cell+responses.">Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses.</a> Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).</li><li>Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+Capture+Bacteria+by+Transinfection+from+Dendritic+Cells.">T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies.">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies.</a> European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).</li><li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes.">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Warth, S. C., Heissmeyer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+transduction+of+naive+CD4+T+cells+to+study+Treg+differentiation.">Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node.">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

פרוטוקול זה מאפשר אפיון הקיבולת של מוניטור-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות, התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. יתר על כן, זה יכול לשמש גם כדי להעריך את הרגישות של תאי CD4 T מודולציה על-ידי בקרי נגזר מוניטור. עם פרוטוקול זה, שינויים באירועים אלה יכולים להיות נמדד ויוו.
בהתאם ההשערה ...

תאי CD4 T אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) כגון DCs מגשרים נדרשת חסינות חיידקים פתוגנים1,2בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. באיברי הלימפה ההיקפית, תאי CD4 T מופעלים על הכרה של אנטיגנים ספציפיים שהוצגו על ידי נגמ שים3,4,5. תאי CD4 T מופעל להתרבות, להבדיל לתוך תאי Th ברורים אפקטור ספציפיים הדרושים להתפתחותם של תגובה חיסונית אדפטיבית נכונה6,7. שליטה על תהליכים אלה חיוני לייצור הגנה ראויה מסתגלת שהורג את הפתוגן מבלי לייצר רקמות מזיק נזק8. Th תאים מוגדרים על פי הביטוי או ייצור מולקולות על פני, גורמי שעתוק, ציטוקינים אפקטור ולבצע פונקציות חיוניות ומדויק בתגובה פתוגנים1. תאים של המשנה תא Th1 להביע את T-התערבות של גורם שעתוק של ציטוקין אינטרפרון וγ (IFNγ) ולהשתתף מארח הגנה מפני פתוגנים תאיים1. כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות Th1 בידול היא אמצעי שימושי להעריך את משחק התפקידים T תאים, תגובה חיסונית.
ניתוח זה הפרוטוקול מאפשר vivo בתוך לקיבולת של חוץ גופיתבשנוצר BM-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות ו Th1 התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. הפרוטוקול משמש גם כדי להעריך את היכולת של תאי CD4 T נאיבי להיות מופעל, המושרה כדי להתרבות, Th1 מבודלים (איור 1). פרוטוקול רב-תכליתי זה עוקף חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למדה גרידא אין ויוו בפרוטוקולים. ניתן יהיה ללמוד את ההשפעות של מולקולות שונות וטיפולים על בקרי תחום באמצעות מוניטור עכברים מהונדסים5 או בטיפול או מניפולציה גנטית מוניטור מבודד התאים9. באופן דומה, ניתן לסייר תא T תגובות על ידי קבלת בתאי T להעברת המאמצת ממקורות שונים או לאחר מספר מניפולציות3,8,10.
היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כפולה. הפעלת תא t התפשטות, בידול Th1 ניתוח בגישה cytometry זרימה; זה בשילוב עם ויוו מחקרים, ובכך הסב שינויים שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו איברים שלמים11.
השימוש של צבע חיוני היא טכניקה בשימוש נרחב כדי לעקוב אחר התפשטות תאים תוך הימנעות את השימוש רדיואקטיביות. מידת התפשטות עם ריאגנטים אלה מבוסס על דילול צבע לאחר חלוקת התא. יתר על כן, צבעים אלה ניתן להבחין באורכי גל מרובים, מנותחים בקלות על ידי cytometry זרימה בשילוב עם נוגדנים פלורסנט או סמני מרובים. אנחנו להדגיש את התועלת של פרוטוקול זה לפי מראה כיצד הפעלת תא T התפשטות, בידול Th1 ניתן לנתח מאת cytometry זרימה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20,824,365</td>
			<td>5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>10020-00</td>
			<td>Box of 100 blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Novico</td>
			<td>N15663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon web filter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood lysis buffer</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R7757</td>
			<td>100 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>ED2SS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A7906</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>302643-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture-plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Cambrex</td>
			<td>BE17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8-05740-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>BE13-115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)</td>
			<td>Prepotech</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well-plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>v450 anti-mouse CD11b antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD64 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>139303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD115 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse MHCII antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>125507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD86 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD80 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry tubes</td>
			<td>Zelian</td>
			<td>300800-1</td>
			<td>PS 12X75 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTII Ovoalbumine peptide</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>323-339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD8&#945; antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0081-U500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated IgM antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>406503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated B220 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0452-U500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD19 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0193-U500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD11b antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0112-U500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD11c antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD25 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0251-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated DX5 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin-coated magnetic microbeads</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic cell separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD8 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Violet Tracer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C34557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD25 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>20-0251-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 anti-mouse CD69 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>65-0453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>20-0453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>60-0453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD45.2 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>8-18715-02100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular permeabilization buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFNg antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>20-7311-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.SJL CD45.1 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa&#8482; Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo mouse model to measure na&#239;ve cd4 t cell activation, proliferation and th1 differentiation induced by bone marrow-derived dendritic cells

כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות, בידול T helper 1 (Th1) התאים היא דרך שימושית כדי להעריך את התפקיד שממלאת בתאי T בתגובה חיסונית. פרוטוקול זה מתאר את הבידול במבחנה של מח העצם (מוניטור) אבות כדי להשיג גרנולוציט מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (GM-CSF) נגזר-תאים דנדריטים (Dc). הפרוטוקול מתאר גם את ההעברה המאמצת של פפטיד אובלבומין (OVAp)-טעון DCs GM-CSF-derived ותאי CD4 T תמים מן העכברים הטרנסגניים OTII על מנת לנתח את הפעלת ויוו , התפשטות ו Th1 הבידול של תאי CD4 T שהועברו. פרוטוקול זה עוקף המגבלה של גרידא אין ויוו שיטות המוטלים על-ידי חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למד. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לימודים בסביבת ויוו , וכך להימנע שינויים לגורמים פונקציונלי שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות את השפעת סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו באיברים ללא פגע. הפרוטוקול הוא כלי שימושי עבור יצירת שינויים ב- DCs ו- T תאים זה לשנות את תגובות מערכת החיסון מסתגלת, פוטנציאל לספק תוצאות חשוב להבין את המקור או את התפתחות מחלות רבים הקשורים החיסון.

איור 1 מדגימה את השלבים המתוארים פרוטוקול זה. איור 2 מדגים את הבידוד והתרבות של העכבר מוניטור תאים. התוספת של GM-CSF ו LPS לתרבויות אלה מאפשר הדור במבחנה , ההבשלה של בקרי תחום. איור 3 מדגימה ניתוח cytometry זרימה של בידול ועם בגרו?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÂ¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells at JoVE

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

an-vivo-mouse-model-to-measure-nave-cd4-t-cell-activation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.3K Views.  Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC). כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.

Video: An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.