המחברים מודים בתודה טום רובינסון לקריאה הוכחה של כתב היד, ג Bärtschi וה &#39;בנץ להקמת מערכת בקרת לחץ שהותקן. אנחנו רוצים גם להכיר בשימוש במתקן חדר הנקי הראשון ומרכז האור מיקרוסקופית (LMC), שניהם במכון הטכנולוגי של ציריך. העבודה מומנה על ידי חברת מרק סרונו והמועצה האירופית למחקר (ERC) תחת תכנית המסגרת ה -7 (ERC החל גרנט, פרויקט לא. 203,428, nμLIPIDs).

<ol>
	<li>Walling, M. A., Shepard, J. R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity+and+live+cell+arrays.">Cellular heterogeneity and live cell arrays.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).</li><li>Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+biological+single+cell+analysis.">Chemical and biological single cell analysis.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).</li><li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+single+cell+analysis:+from+promise+to+practice.">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li><li>Faley, S., Seale, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+real-time+signaling+analysis+of+multiple+single+T+cells+in+parallel.">Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel.</a> Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).</li><li>Huang, B., Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+enzyme+concentrations,+kinetics,+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays.">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).</li><li>Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyphenated+optical+trap+capillary+electrophoresis+laser+induced+native+fluorescence+system+for+single-cell+chemical+analysis.">A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis.</a> Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).</li><li>Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchamber+array+for+single+cell+isolation+and+analysis+of+intracellular+biomolecules.">A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules.</a> Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).</li><li>Agresti, J. J., Antipov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution.">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li><li>Ma, C., Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells.">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).</li><li>Shi, Q., Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells.">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).</li><li>Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+profiling+of+circulating+tumor+cells:+transcriptional+heterogeneity+and+diversity+from+breast+cancer+cell+lines.">Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.</a> PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).</li><li>Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+polarity,+stem+cells+and+cancer.">Epithelial cell polarity, stem cells and cancer.</a> Nature. 12 (1), 23-38 (2012).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li><li>Gao, Y., Majumdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+valve-enabled+microfluidic+cell+co-culture+platform+and+demonstration+of+its+applications+to+neurobiology+and+cancer+biology.">A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology.</a> Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).</li><li>White, A. K., VanInsberghe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+RT-qPCR.">High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).</li><li>Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+real+time+analysis+of+protein+secretion+from+single+cells.">Towards real time analysis of protein secretion from single cells.</a> Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).</li><li>Huang, Y., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion.">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).</li><li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping.">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li><li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., K&#252;ster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells.">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 .</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+(G6PD):+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress.">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

טכנולוגית מיקרופלואידיקה פתחה אפשרויות חדשות ומרתקות לניתוח תא בודד. בפרט, את האפשרות למלכודת ולשתק את התאים בנפרד על ידי כלים microfluidic אפשרה מחקרים לטווח קצר וארוך שיטתיים על מאפייני תא בודד ותגובה. בנוסף, אנקפסולציה של תאים בmicrodroplets תדירות גבוהה, שנוצר על שבב אלקטרוני, אפשרה מחקרי הפרשת תא בודדים, שלא ניתן לבצע עם מכשירי cytometry קונבנציונליים. גישת microdroplet, לעומת זאת, יש כמה מגבלות, כאשר שלבי דגירה ושטיפה נדרשים לפרוטוקול אנליטית. הגישה שלנו משלבת את שני המושגים של השמנה תא ובידוד, ולכן, זה מקל על ביצוע מבחני מורכבים יותר, כולל immunoassays מבוססת על נוגדנים משותקי פני השטח. בנוסף, השיטה היא מאוד גמישה ביחס לanalytes היישום והיעד. העיצוב של השבב מאפשר אפי (i)ההשמנה cient תא, (ii) אספקת מאגרים וחומרים כימיים שונים, וכן (iii) בידוד אמין בנפח קטן מאוד בעת צורך. בדרך זו הדילול של מולקולות המטרה הוא להימנע מכך. שישים (מאות) של microchambers ממוקמים על אחת מכשיר אחד המאפשר ניסויים רבים במקביל. השסתומים בצורה עגולות סגירת microchambers ניתן לטפל ביחד או בנפרד על ידי שורות או עמודות, וזה חשוב כאשר הזיהום צולב לתאי סמוכים יש למנוע. עם microchambers סגור, ניתן לטפל בערוצים עם פתרונות מזיקים כגון חומצה הידרוכלורית לניקוי מטרות מבלי להשפיע על התאים הלכודים. מצד השני, החלפה מהירה של הנפח בתוך microchamber אפשרית. נכון לעכשיו יש צורך בזמן מינימאלי של 200 אלפיות שניים כדי לפתוח באופן מלא את החדר ולהציג את חומרים כימיים חדשים (לחילופי microchamber הנפח מלאים, קצב הזרימה צריכה להיחשב). בעוד שהשיטה שלנו היא מאוד reliable ושחזור, אחד צריך לזכור שיש שתי נקודות קריטיות עיקריות בפרוטוקול של ייצור שבבים ותפעול. ראשית, המליטה של ​​שתי שכבות השבב לאחר הפעלת פלזמה צריכה להיעשות במהירות. היישור הוא קריטי, אחרת חלק מהתאים או אפילו את כל השבב הוא לא שמיש, שכן המליטה היא בלתי הפיכה. צעד זה יכול להיות קשה עבור משתמשים לא מנוסים, לעומת זאת, אחרי כמה אימונים אפילו פחות מנוסה עובדי מעבדה להשיג תוצאות טובות בדרך כלל. הנקודה הקריטית השנייה היא הניקיון במהלך הרכבה ושימוש בשבב האלקטרוני. אם חלקיקי אבק נמצאים על פני השטח של השבב, הם יכולים להתפשר ערוצי בקרה וסתומה או אפילו להוביל לשבירת PDMS-PDMS או אג&quot;ח PDMS זכוכית. לפיכך, אנו מבלים הרבה תשומת לב לתהליכי ניקוי. יש לציין כי מלבד ייצור הטופס השני (שבוצע בחדר נקי), אנחנו מייצרים ומשתמשים בשבבים בסביבת מעבדה רגילה, שבו אבקnd חלקיקים הם הווה. למרות כל הטיפול, אם התאים לא סוגרים בצורה נכונה, זה יכול להיות ששני קווי לחץ חסומים או תהליך ציפוי ספין לא ספק את עובי הקרום הנכון. כמו כן, מהעת לעת שצפינו מליטה לא מספיק, וכתוצאה מהשבירה של הקשר בין שתי שכבות PDMS. אם שבבים רבים מאותה אצווה מראים את הבעיה הזו, זה אפשרי, כי הזמן בין הפעלת פלזמה ויישור הוא ארוך מדי. לפעמים, אנחנו חווים PDMS הדביק על הוופלים שלא ניתן להסירו כראוי והיה תוצאה של silanization מספיק של פרוסות סיליקון. ברגע ששיטת הייצור הוא הקים, פלטפורמת microfluidic יכולה לשמש למחקרים רבים ושונים ברמת התא הבודד. כאן, אנו הראיתי זיהוי של סוכנים תאיים ומופרשים עם מבחני שונים, אך רבים מבחני אחרים אפשריים על גבי השבב. רוב החלבונים אינם ניאון ודהtection באמצעות immunoassays הוא לא פשוט. יישום ELISA לתוך השבב יביא תועלת רבות. ראשית, assay יכול להיות מתוכנן באופן ספציפי מאוד לחלבון הרצוי (כאשר הנוגדנים מתאימים נוכחים). שנית, מידע מELISA ניתן לכמת גם בגבולות ריכוז נמוכים, נותן את מספר העותקים של חלבון או מולקולה הנמצאים בתא. השבב הנוכחי שלנו מיועד לניתוח של תאי יונקים יחיד. עם זאת, שינוי של השבבים לתאים אחרים, כגון חיידקים, אצות ושמרים, צריך להיות אפשרי. עד עכשיו, המגבלה היחידה לניסויים היא הצורך של assay המבוסס על הקרינה. עם זאת, אנחנו כרגע לומדים את היישום של ספקטרומטריית מסה כטכניקת זיהוי. ברגע שזה נקבע, בטווח של בעיות אנליטיות שיכול להיחקר עם הפלטפורמה יהיה אפילו רחב יותר. יתר על כן, מאחר שלא כל ניתוח אפשרי בנוכחות מאגרי תמוגה תא, אנחנוכיום גם הערכת טכניקות תמוגה שונות אחרות על הרציף. אנו בטוחים כי פלטפורמת microfluidic צדדי המוצגת כאן מספקת בסיס למחקרי תא הבודד חדשים על proteome, metabolome וsecretome רמה.

מחקרים רבים בעבר חשפו הבדלי תא אל התא בתוך אוכלוסיית תאים גדולה 1-3, בפרט איתות מעבדת 4, או הכמויות של ביומולקולות תאית כגון חלבונים 5,6, מטבוליטים, וcofactors 7,8. heterogeneities אלה נחשבים חשובים ביסודו להסתגלות תאים והתפתחות 9, אבל גם לשחק תפקיד מרכזי בהופעתה וטיפול במחלות כגון סרטן 10-13. לכן, מחקרים ברמת התא הבודד הם עניין גבוה במחקר ביולוגי ותרופתי, במיוחד אם מחקרים אלה חושפים את תגובות תאים השונות לאחר טיפול עם חומרים כימיים ביו. בשנים האחרונות, רבות פלטפורמות אנליטיים פותחו המאפשרות ניתוח של תאי חיים בודדים או את ההרכב הכימי של התוכן הסלולרי. בעוד תא ניאון מיון מופעל (FACS) הוא הזהב standard לניתוח מאוד תפוקה גבוהה של תאי חיים בודדים, השיטה לא יכולה להיות מועסק לכימות של תרכובות תאיים או מופרשים. הופעתה של פלטפורמות microfluidic הבטיחה אסטרטגיות אנליטיות חדשניות למיצוב, טיפול ומעקב של תאים בודדים. אבן דרך במיקרופלואידיקה הושגה עם השילוב של שסתומים PDMS גמישים הבינו ידי Quake ועמיתים לעבודה 14,15. שסתומים אלו יעילים מכיוון שהם יכולים לבודד אזורים בשבב, לדוגמא להפריד בין שתי תרבויות 16. יתר על כן, הם רלוונטיים במיוחד לניתוח תא בודד, ולכן לעזור להפחית בעיות דילול אנליטי. כוחה של גישה זו לניתוח תא בודד הודגם לאחרונה על ידי הנסן ועמיתים לעבודה, שניתח את ביטוי גנים ממאה תאים בודדים ב17 מקבילים. כאשר מיקוד חלבונים ומטבוליטים, הניתוח קשה מאוד עקב חוסר המתאיםשיטות mplification, המספר הגדול של תרכובות שונות בהווה ובווריאציות שלהם בטבע כימי. יתר על כן, רוב ביומולקולות תאית צפויות להיות נוכח במספרים נמוכים עותק בסדר הגודל של כמה עשרות אלף 18, ולכן השיטה אנליטית המשמשת חייבת להיות רגישות גבוהה. מבחני יותר חזקים כגון immunoassays וimmunoassays צמודת אנזים (ELISA) קשים להשתלב במכשירי microfluidic כי הם דורשים כמה כביסה ושלבי דגירה, כמו גם חוסר תנועת פני השטח. בשל אתגרים אלה, אין זה מפתיע שרק כמה דוגמאות שדווחו בו חלבונים או מטבוליטים היו לכמת ברמת התא הבודד. לדוגמא, מחקרים על ההפרשה של תרכובות ניאון דווחו 19,20. לאחרונה, היישום עם ELISA הוצג לניתוח חלבונים מופרשים (nonfluorescent) מתרבית תאים (THP-1 תאים) 21 ויחידה (immune) תאים 10. מיקוד חלבונים תאיים, שי et al. פיתח מכשיר microfluidic שאפשר זיהוי של חלבונים תאיים לניתוח של מסלולי איתות בתאים סרטניים באמצעות immunoassay 11. עם זאת, רק כמויות יחסי של חלבונים שהיו נחושות ולא הגברה אנזימטית שימשה כדי להגדיל את האות לחלבוני שפע נמוך. לאחרונה, הצלחנו לשלב microdevice השמנה תא בודד עם מבחני הקרינה 8 וimmunoassays 22 (איור 1). תאים לכודים באופן פסיבי במבני משוכת microsized, המאפשרים אספקה ​​והחלפה (מהירה) של מדיום וחומרים כימיים אחרים ללא כל תנועה של התאים. שסתום בצורת טבעת סביב כל מלכודת מאפשר בידוד של התא בנפח קטן מאוד (&quot;microchamber&quot;). שסתום זה מונע מייד לאחר החדרת חיץ תא lysing (hypoosmolar), שהואNCE מניעת מולקולות תאיים או מולקולות מופרשים כדי לפזר משם. והכי חשוב, בשל גודלו הקטן של הנפח (625 pl) דילול גדול של המולקולות הוא התחמק. יתר על כן, מאז תמוגה וניתוח מבוצעים באותה התנוחה בשבב, אין אובדן של analytes בשל תחבורה. תכנון השבבים המתוארים כאן כולל 8 שורות לסירוגין של או 7 או 8 microchambers, בהיקף של 60 microchambers. התאים הם מופעלים בשורות, כך שזיהום צולב לאורך קו מנועה. הפלטפורמה יכולה לשמש בשילוב עם מבחני הקרינה, כמו גם מבחני חיסוניים (1D איור). באפשרות השנייה, הקמנו פרוטוקולים לחוסר תנועה של הנוגדנים, אשר עולים בקנה אחד עם ייצור השבבים ותהליך ההרכבה. לפיכך הפלטפורמה פותחת את הדרך למבחנים רגישים, אמינים וכמותיים ברמת התא הבודד. עד עכשיו, יש לנו השתמשתי במכשיר לניתוח של iאנזימי ntracellular והמופרשים (כימות יחסי על ידי מבחני האנזימטית), cofactors תאיים, חלבונים ומולקולות קטנות (כימות מוחלטת על ידי מבחני נקודת סיום או ELISA). בחלק הבא, אנו מתארים את תהליך ייצור שבבים באמצעות יתוגרפיה רב שכבתית רכה והפרוטוקולים לדפוסים של הנוגדנים באמצעות הדפסת microcontact וכימיה של פני השטח. בנוסף, כמה דוגמאות לשימוש בשבב ופעולות מקבלות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">REAGENTS:</td>
			<td style="width:284px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">SU-8 2015</td>
			<td style="width:284px;">MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane</td>
			<td style="width:284px;">ABCR (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">AB103608</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">4-Methylumbelliferyl &#946;-D-N,N&#8242;-diacetylchitobioside hydrate</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M9763</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Acetone</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">100014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Avidin</td>
			<td style="width:284px;">AppliChem (Axon Lab AG)</td>
			<td style="width:103px;">A-2568</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 1518</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 726 developer</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-4503</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-8549</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">13151-014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hexamethyldisilazane (HDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">40215</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">84422</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">109634</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">63068</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MR developer 600</td>
			<td style="width:284px;">Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PBS</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">10010-031</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted biotin</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">60132</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Protein G, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">41624</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:284px;">Si-Mat (Kaufering, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Dow Corning</td>
			<td>39100000</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1610716</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tween 20</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1706531</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Material Name</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">0.22 &#181;m PES syringe filter</td>
			<td style="width:284px;">TRP</td>
			<td style="width:103px;">99722</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1/1.5 mm biopsy puncher</td>
			<td style="width:284px;">Miltex, York PA</td>
			<td style="width:103px;">33-31AA/33-31A</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell Trics filter 20 &#181;m</td>
			<td style="width:284px;">Partec</td>
			<td style="width:103px;">04-004-2325</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Centrifuge Sigma 3-18K</td>
			<td style="width:284px;">Kuehner</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hotplate HP 160 III BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MA-6 mask aligner</td>
			<td style="width:284px;">Karl Suess</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Multizoom AZ100M microscope</td>
			<td style="width:284px;">Nikon Corporation</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Photomask</td>
			<td style="width:284px;">Microlitho, Essex, U.K.</td>
			<td style="width:103px;">n.a</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Plasma Cleaner PDC-32G</td>
			<td style="width:284px;">Harrick</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td>
			<td style="width:284px;">Laurell</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin Modules SM 180 BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Step profiler Dektak XT Advanced</td>
			<td style="width:284px;">Bruker</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Syringe pump neMESYS</td>
			<td style="width:284px;">Cetoni</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells

אנו מציגים מכשיר microfluidic המאפשר קביעת כמותית של ביומולקולות תאית בתאים בודדים מרובים במקביל. לצורך כך, התאים לכודים באופן פסיבי באמצע microchamber. עם ההפעלה של שכבת הבקרה, התא מבודד מהנפח שמסביב בחדר קטן. הנפח המקיף לאחר מכן ניתן להחליף מבלי להשפיע על התאים המבודדים. עם זאת, על פתיחה וסגירה קצרות של החדר, הפתרון בתא יכול להיות מוחלף בתוך כמה מאה אלפיות שנייה. בשל ההפיכות של התאים, יכול להיחשף לתאים ברצף פתרונות שונים באופנה לשליטה מאוד, למשל עבור דגירה, כביסה, ולבסוף, תמוגה תא. Microchambers הסגור היטב יאפשר השמירה של lysate, למזער ולשלוט בדילול לאחר תמוגה תא. מאז תמוגה וניתוח להתרחש באותו המיקום, רגישות גבוהה נשמר משום שאין ד נוסףilution או אובדן analytes מתרחש במהלך הובלה. עיצוב microchamber לכן מאפשר ניתוח אמין לשחזור של מספרי עותק קטנים מאוד של מולקולות תאיים (attomoles, zeptomoles) שוחררו מהתאים בודדים. יתר על כן, ניתן לארגן microchambers רבים בפורמט מערך, המאפשר הניתוח של תאים רבים בבת אחת, בהתחשב בעובדה שמכשירים אופטיים מתאימים המשמשים לניטור. יש לנו כבר השתמשתי בפלטפורמה למחקרי הוכחה של הקונספט לנתח חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors ושליחים שני באופן כימות או יחסי או מוחלט.

הפלטפורמה שלנו היא מסוגלת לנתח מגוון של תאיים, כמו גם מולקולות מופרשים בהווה באו המיוצר על ידי תאים בודדים. כאן, אנו רוצים להציג מחקרי ירושלים שונים כדי להדגיש את המגוון של מבחני אפשריים. אנו נותנים דוגמא לאנזים מופרש (איור 5 א), כמו גם אנזים תאיים (איור 5) וחלבון (5c דמויות וד). לדוגמאות נוספות, כגון cofactors או מולקולות קטנות, עיינו Eyer et al. (2012) וEyer et al. (2013). ראשית, אנו מציגים assay לאנזים מופרש (איור 5 א). עם הפעלה עם אצטט Myristate phorbol (PMA), מונוציטים האנושיים לגרום להפרשה של ליזוזים, אנזים שגורם תמוגה תא חיידק. עבור assay זה, חיץ התא מכיל 4-Methylumbelliferyl β-DN, N&#39;-diacetylchitobioside, מצע בחולשה ניאון לlysozyme. על המחשוף של שאריות סוכר על ידי האנזים, fluorophore משוחרר וניתן לאתרם בתוך החדר. כאן, היתרון של microchamber הוא הדילול הממוזער של האנזים המופרש, המאפשר זיהוי של ריכוזי אנזים נמוכים בתוך פרק זמן קצר. בציור 5a, כמה עקומות דוגמא מוצגות המייצגות את המחזור האנזימטית של ליזוזים המופרש מתאי U937 מגורה אחת. שורת תאי U937 נובעת מחולה עם לימפומה histiocytic, ויכולה להיגרם לבידול monocytic מסוף. שורת התאים מייצרת TNFα, ליזוזים וβ2-microglobulin לאחר גירוי עם PMA. אין תחלופה היא לזיהוי בתאים פתוחים או תאים ללא תאים (קו מקווקו). איור 5 מראה את כימות היחסית של אנזים תאיים, כאן דהידרוגנז גלוקוז 6 פוספט (G6PDH). G6PDH הוא חלבון משק ותאים מאותו המוצא הרקמות לא צריך<html> להשתנות במידה רבה בריכוז G6PDH 24. הנה, תאי U937 היו לכודים בתא, ואנו מסופקים assay הקרינה לצורך זיהוי של G6PDH יחד עם מאגר תמוגה. הוא מורכב מגלוקוז 6 פוספט, NADPH, diaphorase האנזים וresazurin המצע, אשר מומרת resorufin ניאון כאשר G6PDH הוא הווה. שיעור הגידול בקרינה לאורך הזמן מתאים לכמות G6PDH. השבב נוסף מאפשר מחקרים על ההשפעה של תרכובות רעילות, למשל על ידי דגירה של התאים עם רעלן (כאן camptothecin) במשך זמן מוגדר (60 דקות). לאחר טיפול זה, האנזים שפורסם היה סמוק משם והתאים היו lysed, ורמת G6PDH נמדדה. ואכן, לאובדן משמעותי של תוכן אנזים תאיים היה גלוי בשל עלייה איטית יותר של הקרינה (קווים אדומים ועמודות באיור 5 ב). ניתן למצוא את פרטים של מחקר זה בEyer et al. 8 e_content &quot;&gt; יתר על כן, אנו מציגים התוצאות מimmunoassay לניתוח של כמויות ה-GFP תאית. לביטוי מושרה, HEK293 תאים בי transfected עם מערכת ביטוי T-Rex. במערכת זו, ביטוי של GFP יכולים להיגרם על ידי התוספת של טטרציקלין . לאחר 8 שעות של דגירה, התאים היו מושעים, סמוק על השבב, לכודים, ולאחר מכן lysed. לכידת נוגדנים אנטי-GFP היו משותקים על משטח הזכוכית הבאה הפרוטוקול המובא כאן כדי לחייב את ה-GFP שוחררה מהתא. איור 5c מציגה את קינטיקה מחייבת של ה-GFP לנוגדן. בדוגמא זו, GFP ניתן היה למדוד באופן ישיר על ידי סך הכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפנימי בשל הקרינה של החלבון. אנו רוצים להדגיש יכולים גם להתגלות כי חלבוני nonfluorescent באמצעות כריך ELISA או דומה פורמטים. לשם כך, ניתן הציגו רכיבי assay נדרשו לאחר צעדי הכביסה. היתרון של ELISA הוא ההגברה האות בשללאנזים, מניב מוצר ניאון שהצטבר בתוך microchamber. לבסוף, ברצוננו להציג ELISA כריך תא בודד עם GAPDH כחלבון המטרה. אנחנו נקבע GAPDH בתאי ההשעיה U937, כמו גם תאים חסיד HEK293 (5D איור). לשם כך, אנחנו משותקים נוגדן אנטי GAPDH (נוגדן ללכוד). לאחר תמוגה תא, הנוגדן השני שכותרתו אנזים (נוגדן זיהוי) הוצג. התאים נפתחו ובשל הזרימה, נוגדני זיהוי מאוגדים נשטפו וAmplex האדום הוצג לחדר. המרה של Amplex אדום לניאון resorufin ידי HRP (נוגדן זיהוי) הייתה פיקוח לאורך זמן בכל 60 microchambers באותו הזמן. המדרון מהחלק ליניארי של התגובה היה נחוש. מדרון זה בקורלציה ישירה לריכוז של האנזים ולכן, לריכוז של חומר אנליטי. התוצאות מתאי U937 אחת הראו GAPDH ממוצעכמות 2.6 attomol, עם ערכים מינימאליים ומקסימאליים של 2.0 ו3.2 attomol, בהתאמה. ניתוח נתונים של 46 HEK תאים גילה כי תאים אלה כלולים בGAPDH הממוצע 2.5 attomol (attomol 0.9 המינימלי; attomol 4.1 מקסימאלי). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50618/50618fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. Microdevice והשרטוטים של מבחני השונים שהוצגו.) Microdevice התאסף. הנה, את התאים מלאים ובהעמסה להדמיה (הקרינה ירוקה). כמו כן גלוי הוא המאגר, חיבורים לשכבת הבקרה (לחץ, מחברים 2x4 בחלק האחורי שמאליים וימניים קדמי) ואת החיבור למשאבת המזרק (הקדמי). ב) קרב על אזור microchamber. רבים של תאים אלה יכולים להיות מסודרים במערך. להדמיה, לצבוע מזון כתום היה מבודד בתוך התאים, ואילו<html> צבע מאכל ירוק הוא הסמיק בין הערוצים. שכבת השליטה בלחץ מלאה במים. ג) זום בmicrochamber אחת. ד) סכמטי של פעולת המכשיר. בתוך microchamber (צד תצוגה), תא בודד הוא לכוד ומבודד. התא יכול להיות מגורה, מודגרות, שטף וסוף סוף lysed בתוך השבב. התוכן הסלולרי יכול להיות מנותח באופן ישיר עם מבחני לאנזימים או coenzymes בי מחצית ניאון נוצרה על תגובה (משמאל). לחלבונים אחרים, פני השטח יכולים להיות שונה עם נוגדנים הנקשרים באופן ספציפי לחלבון המטרה (מימין). מאז אנטיגן קשור אל פני השטח, lysate יכול להישטף וניתן להוסיף מולקולות זיהוי כגון נוגדנים משני לכמת את חלבון המטרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50618/50618fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> דואר 2 &quot;עבור: תוכן width =&quot; 5in &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50618/50618fig2.jpg &quot;width =&quot; &quot;/&gt; 500px איור 2. סכמטי של מערכות ערוץ וממדים של microchamber.) עיצוב מסכה של שכבת fluidic. שכבת fluidic מורכבת (משמאל לימין) לשקע, האזור קאמרי, מסנן כדי לשמור על חלקיקים וצבירי תאים וכניסה. 4 ברקיק יכולים נמל המבנים לייצור שבבים 10. ב) עיצוב מסכה של שכבת הבקרה המתאימה. בשל השטח הדרוש ליישור, 4 ברקיק מכיל מבנים לייצור השבבים 5. ג) סכמטי של שכבות מיושרות (משמאל) והגדלה מראה מלכודת תא (מימין), שניהם עם סולמות אורך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50618/50618fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה תמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width=רוחב &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50618/50618fig3.jpg&quot; = /&gt; &quot;500px&quot; איור 3. סכמטי של של SU-8 עיבוד והפקת PDMS.) סכמטי של פרוטוקול עיבוד SU-8. פרוסות סיליקון היא עם SU-8 ורכים אפוי ב95 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ספין מצופה. עיצוב ערוץ microfluidic הרצוי מועבר על SU-8 באמצעות photomask וחשיפה לקרינה UV-אור. לאחר לאפות לאחר חשיפה (95 מעלות צלזיוס, 5 דקות), SU-8 הוא פיתח וקשה אפוי ב180 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. ב) סכמטי של ייצור שבבי microfluidic. תערובת של oligomer PDMS וסוכן ריפוי היא על גבי טופס האב לערוצי fluidic ספין מצופה, ושפכה על טופס האב לשכבת השליטה. תשלילי הערוץ מתוארים בורוד. שני השכבות נרפאות בתנור. חלק שבב שכבה מלאה הוא מפורק מהרקיק (ערוץ בקרה בכחול) וחורים לחיבורי לחץ הם אגרוף (לבן). שני חלקי שליטה ושכבה הם נוזל ממוקמת בפלזמת חמצן, ולאחר מכן, הם מיושרים ומלוכד. כל השבב אז מפורק מטופס fluidic הראשי (ערוץ נוזל בצבע אדום) וחורי גישת fluidic הם אגרוף (לבן). לבסוף, השבב ושקופיות זכוכית מודבקים לאחר הפעלת משטח בפלזמת חמצן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50618/50618fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50618/50618fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. סכמטי של הדפסת microcontact.) ייצור אב ליתוגרפיה רכה. (1) PDMS חותמת הודגרו עם פתרון חלבון (bBSA). (2) הפתרון מוסר, החותמת היא שטפה וmonolayer של חלבון נשאר בחותמת. (3) החותמת ממוקמת בשקופית זכוכית, ובכך החלבונים מועברים לsur הזכוכית<html> פנים. במהלך תקופה זו, השבב יחד עם החותמת על הזכוכית חשוף לפלזמת חמצן. (4) החותמת מוסרת והשבב האלקטרוני הוא ערובה לשקופית הזכוכית. להדמיה, שני מבני דוגמא מוצגים, מודפסים עם הצמוד BSA-והעמסת ניאון. ב) אזור microcontact מודפס לכל תא. מאז ההדפסה ותאים לא מיושרים, הערכנו וריאציות על כתמים מחייבים (אזור מודפס) על שלושה שבבים שונים (מספרי 1-3) וכל 60 microchambers. כתוצאה מכך, השתנות תא לתא קטנות יחסית (&lt;2.5%) והשתנות שבב לשבב היו זניחות (&lt;1%), הוכחת כי אכן אין צורך ליישר את המבנים המודפסים לתאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50618/50618fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> &quot;Width =&quot; 18/50618fig5.jpg &quot;/&gt; 500px איור 5. תוצאות מG6PDH, ליזוזים, GFP ומבחני GAPDH. נציג תוצאות.) הפרשת אנזימים מהתאים בודדים. משמאל: סכמטי של assay לאנזים מופרש, כאן ליזוזים. ליזוזים מופרש על ידי תאים בודדים, הופעלו-PMA U937 ומצטבר בתוך microchambers הסגור, שבו הוא מזרז הייצור של 4 methylumbelliferone-הניאון. מימין: נתונים שהתקבלו מניסוי הפרשה. העקומות הירוקות מראות את עוצמת הקרינה לאורך זמן עבור תאים שנכבשו על ידי תא אחד, המוצגות גם הוא חדר ללא תאים (שחורה, קו מקווקו) להשוואה. ב) איתור של אנזימים תאיים בתאים בודדים. משמאל: סכמטי של assay לG6PDH האנזים תאיים. על תמוגה תא, G6PDH תאיים משתחרר לתוך התא, שבו הרכיבים האחרים למפל תגובה האנזימטית נוכחים. מימין: עקומות דוגמא ונתונים מייצגים. U937 יחידתאים נותחו לתוכן שלהם האנזים (השחור). Immunoassay על ההשפעה רעילה של camptothecin, שpermeabilizes הקרום, שני שלישים של האנזים אבדו (כתומה). ג) של חלבונים תאיים של תאים בודדים. משמאל: סכמטי של immunoassay, כאן לGFP החלבון תאיים. נוגדני Anti-GFP היו משותקים על הפרוטוקול לפי פני השטח המתואר במסמך זה. תאים אז היו lysed על שבב והכתמים מחייבים היו במעקב לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה TIRF. מימין: גרף מניסוי כזה מראה קינטיקה מחייבת של ה-GFP לנוגדנים משותקים. 1 נקודת הזמן מסמנת את כניסתה של מאגר תמוגה. בזמן נקודה 2, ה-GFP מתחילה להצטבר על פני השטח, כלומר תמוגה התא התרחשה. כריכה של ה-GFP לנוגדנים הושלמה בנקודת זמן 3. ד) כריך ELISA של חלבונים תאיים של תאים בודדים. משמאל: סכמטי של כריך ELISA, כאן לGADPH החלבון תאית. נגד-GAPDH נוגדנים היו משותקים על הפרוטוקול לפי פני השטח המתואר במסמך זה. תאים אז היו lysed על שבב וטופחו. GPADH המשוחרר חייב הנוגדן, החדר נשטף ונוגדן זיהוי (יחד-HRP) הוצג. בשלב אחרון, נוגדן זיהוי nonbound נשטף, מגיב לגילוי הוצג והתגובה הייתה פיקוח לאורך זמן. מימין:. כימות GAPDH בתוך תאי U937 וHEK293 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50618/50618fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> פרוטוקול שינוי פני השטח לELISA <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שלב </td><td></td><td> זמן </td><td> התרכזות </td><td> קצב זרימה </td><td> זמן דגירה ללא זרימה </td><td colspan="2"> הלשכה פתוחה / סגור </td></tr><tr><td></td><td></td><td> [דקות] </td><td> % (/ V w) </td><td> [Μl / min] </td><td> [דקות] </td><td></td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="2"> ארגון ה-BSA </td><td> 30 </td><td> 4 </td><td> - </td><td></td><td colspan="2"> פתוח </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS </td><td> 10 </td><td></td><td> 5 </td><td></td><td colspan="2"> פתוח </td></tr><tr><td colspan="2"> Avidin </td><td> 30 </td><td> 0.025 </td><td> 5 </td><td></td><td colspan="2"> פתוח </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS </td><td> 10 </td><td></td><td> 5 </td><td></td><td colspan="2"> פתוח </td></tr><tr><td colspan="2"> חלבון G, ביוטין </td><td> 30 </td><td> 0.0025 </td><td> 5 </td><td></td><td colspan="2"> פתוח </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS </td><td> 10 </td><td></td><td> 5 </td><td></td><td colspan="2"> פתוח </td></tr><tr><td colspan="2"> נוגדן </td><td> 20 </td><td> 0.0001 </td><td> 5 </td><td> 15 </td><td colspan="2"> פתוח </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS </td><td> 10 </td><td&gt; </td><td> 5 </td><td></td><td colspan="2"> פתוח </td></tr><tr><td colspan="2"> תאים (300,000 תאים / מיליליטר) </td><td> ~ 5 </td><td></td><td> 30 </td><td></td><td colspan="2"> סגור כאשר מלכודות תפוסות. </td></tr><tr><td colspan="2"> מאגר תמוגה </td><td> 5 </td><td></td><td> 30 </td><td></td><td colspan="2"> פתוח זמן קצר </td></tr><tr><td colspan="2"> מעכב (למשל 20 מ&quot;מ HCl) </td><td> 15 </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td colspan="2"> סגור </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS </td><td> 2 </td><td></td><td> 30 </td><td></td><td colspan="2"> סגור </td></tr><tr><td colspan="2"> מגיב לגילוי </td><td> 5 </td><td></td><td> 30 </td><td></td><td colspan="2"> פתוח זמן קצר </td></tr><tr><td colspan="8"> התחל ניטור תגובה </td></tr></tbody></table> טבלת 1. Modificatio Surfaceפרוטוקול n לELISA. להסבר ראה טקסט.

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells at JoVE.com

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  ETH Zurich, Switzerland.  במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון. 

Video: A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

ספיגת של חלקיקים חדשים מצופים השומנים, המכיל Falcarindiol על ידי גזע אנושי Mesenchymal

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...