המחברים מבקשים להודות למעבדת Kucenas לדיונים חשובים וQuorum Technologies, Inc לתמיכה טכנית מעולה. העבודה נתמכה על ידי הקרן למצוינות בUVa מדע והטכנולוגיה (FEST) (SK).

1. הכנה והרכבה של עוברי דג הזברה לאבלציה והדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלאי של 0.8% הנמוך להמיס agarose במי ביצה. Aliquot לתוך 13X 100 מ&quot;מ צינורות תרבות חד פעמי ולאחסן ב 4 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה מבוגר צלב המכיל transgenes משולב ביציבות לתייג fluorescently הנוירונים מוטוריים וסוגי תאי גלייה של עניין. איסוף עובר דג הזברה במי ביצה ומניחה ב28.5 מעלות צלזיוס חממה להיערכות נכונה בהמשך 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכ 24 שעות לאחר הפריה (hpf), להסיר את המים ביצה ולהוסיף 0.002% 1-2-פניל thiourea (PTU) במי ביצה. להחזיר עוברים לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 24 ו 96 hpf, עוברים צריכים להיות מוקרנים לנוכחות של transgenes הרצוי בהיקף ניתוחים ניאון. הנח עוברים שנבחרו במי ביצת PTU טריים ולחזור לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר זחלים הגיעו לאחר הפריה 6 ימים (DPF) (או גיל רצוי), להסיר אותם מהחממה, בחר כמה זחלים להרכבה, ולהעביר אותם לצלחת קטנה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים מהקערה ולהחליף באופן מיידי לכ 0.02% Tricane במי ביצת PTU. לאפשר זחלים לשבת בהרדמה כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח aliquot של 0.8% הנמוך להמיס agarose בכוס עם מי ברז ומיקרוגל למשך 30 שניות, או עד שהוא נמס agarose. לאפשר את הכוס כדי לקרר עד agarose בצינור התרבות מרגיש פושר למגע (לא חם מדי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זחל מורדם ולהעביר אותו לצלחת תחתית זכוכית 35 מ&quot;מ בודד או רב כן. הסר את כל מים שהועברו לפגייה, ואז לכסות באופן מיידי את הזחל עם agarose החם מספיק כדי למלא את חלק זכוכית בעל תחתית של המנה, אבל לא ליצור כיפה גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כagarose מתקשה, להשתמש באיזמל מנתחים כדי למקם את הזחל על צידו בתחתית הצלחת, ואז להטות את הזחל רק מעט על הגב שלה. זה הכרחי לפציעה והדמיה שלאחר מכן, כיהזחל רכוב להיות נוגע ללב את הכוס על תחתית הצלחת. השתמש באיזמל המנתחים כדי לשמור את הזחל בתפקיד זה עד agarose הוא הגדילו והזחל הוא משותק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose הוא התקשה באופן מלא, פיפטה לאט מים Tricane מספיק (זה יכול להיות אותו הדבר Tricane משמש להרדמה) לתוך הצלחת כדי לכסות את agarose וזחל לחלוטין. </li></ol> 2. כיול ובדיקת לייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל מכשור confocal מיקרוסקופ, לייזרי דיודה מתאימות לtransgenes דג הזברה מרגש, וחנקן נשאב לייזר הצבע. הקפד קרן &quot;הריקה&quot; מפצל הוא במקום, מחליש לייזר הוא פתוח באופן מלא, ותא צבע coumarin ננומטר 435 נמצא במקום. במחשב, לפתוח את תוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז מטרת טבילה במי 1.2NA 63x למקום ולהחיל טיפה קטנה של מדיום טבילה למטרות מים על המטרה. מטרת 63x תאפשר לדיוק טוב לייזר אבלציה, ומימייmmersion מאפשר מרחק עבודה גדול יותר, שיש צורך בעבודה עם זחלי דג הזברה DPF 6-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג שקופיות זכוכית עם צד אחד שיקוף לשימוש עבור כיול של לייזר. הנח את השקף, צד המראה, על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעינית תחת תאורת brightfield, למצוא ולהתמקד בשריטה או לחרוט במראה. אור brightfield יהיה נוצץ במורד לשקופית הזכוכית, אבל יעבור רק דרך למטרה במקומות שבם המראה כבר שרוט או חרוטים משם, וגורם למראה כדי להסתכל דרך העינית שחור, ואת התחריטים נראים כמו כתמים או קווים של אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה ולמקד את התחריטים על מסך המחשב באמצעות תוכנת הדמיה. פתח את החלון ששולט כיול לייזר והגדרות צריכת חשמל. הגדר את מספר הפעימות ל &quot;1&quot; וצלחת להנחתת% הולכה &quot;3&quot;. מספר פולסים מייצג את מספר הפעמים שהליזר יהיה אש בתוך כל אזור של עניין (ROאני) ו% העברת מייצג את כוח לייזר. הקפד הגדרת הכיול הנכונה נבחרה למטרת הטבילה במי 1.2NA 63x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכלי האליפסה בסרגל הכלים הראשי, ולחץ על התמונה על מסך מחשב כדי ליצור את ההחזר על ההשקעה חוזר אחד. לעשות את זה 3 פעמים נוספות עד שיש 4 ROIs המעגלי מחולקת באופן אקראי על גבי תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכות מסוימות עשויות לכלול תכונת בטיחות שלא יאפשר לירות לייזר אם נתיב האור לoculars פתוח. אם זה המקרה, באופן ידני לסגור את נתיב האור לoculars בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לירות לייזר. הפעולה זו תיצור 4 תחריטי נקודה קטנים, 1 בתוך כל החזר על השקעה חוזר. אם לייזר לא לירות, לבדוק כדי להיות בטוח שהליזר מופעל ומחובר כראוי, וכי נתיב האור לoculars סגור. אם את שריפות לייזר אך לא תחריט נראית, לבדוק כדי להיות בטוח &quot;הריק&quot; קרן המפצל נמצא במקום. אם הכל נמצא במקומו, להגדיל את כוח לייזר ו&quot; FRAP &quot;עד AR התחריטיםדואר גלוי. אם כוח לייזר הגדרה גדולה מ 10 יש צורך לחרוט את הכוס, זה עשוי להצביע על לייזר הפלזמה המחסנית צריכה להיות מוחלפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הכתמים מופיעים במרכז חרוט בתוך ROIs שנבחר, לא כיול הוא הכרחי (המשך 2.12). אם הכתמים לא מרוכזים, הגדרת הכיול צריכה להיות מעודכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל, לחץ על עדכון הגדרת הכיול. לייזר יירה ותמונה תופיע המכילה נקודה אחת חרוטה. אם הנקודה לא מופיעה, לבטל את הכיול, להגדיל את כוח לייזר, ולהתחיל את הכיול מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ במרכזו במקום. לייזר יהיה לירות שוב, ונקודה נוספת תופיע. לחץ על נקודה זו, ולחזור על תהליך זה עד שהכיול הושלם ו9 נקודות מופיעות בצורה רשת. חזור על שלבים 2.6-2.9 כדי לבדוק שהכיול היה מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שקופיות זכוכית מבמת מיקרוסקופ ולנקות אובייקטיביים. פתח את נתיב האור לOCUלארס, ולהחליף את מפצל האלומה &quot;הריק&quot; עם מפצל האלומה &quot;100% החולה&quot;. </li></ol> 3. חיתוך רוחב עצב באמצעות אבלציה לייזר והדמיה Confocal זמן לשגות של התנהגויות תא גלייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבמה משמשת כדי להחזיק את שקופית הזכוכית ולהחליף עם במה מתאימה לקיום 35 מנות תחתיות מ&quot;מ זכוכית. תמשיך להשתמש במטרת הטבילה במי 1.2NA 63x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול ירידה קטנה של מדיום טבילה במים למטרה, ומניח את הצלחת עם זחל רכוב על הבמה. לייצב את המנה עם קליפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעינית ותאורת widefield, להתמקד הזחל ולאתר את העצבים המוטוריים. סרוק את העצבים בhemisegments 10-20 ובחר עצב מוטורי לחיתוך רוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את תצוגה חי של העצב על מסך המחשב באמצעות תוכנת הדמיה. בחר Z-מטוסים ולרכוש תמונה של אקסונים ותאי גלייה של העצב לא נפגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הגדרות זמן לשגות הדמיה בתוכנת ההדמיה כדי ללכודZ-תחזיות של כל סוגי התאים במרווחי דקות 5-30, בהתאם לניסוי. הדרך הטובה ביותר הוא ליצור את כל ההגדרות הנחוצות לזמן לשגות לפני ביצוע אבלציה, כך שאין עיכוב בהתחלת הזמן לשגות פעם אחת הפגיעה היא מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מפצל האלומה &quot;100% החולה&quot; ולהחליפו &quot;הריק&quot;. לסגור את נתיב האור לoculars. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור לתצוגה חי של העצב. השתמש בערוץ הניאון המתאים כדי להציג את האקסונים שיהיה transected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי האליפסה, ליצור החזר על השקעה אליפטי דקה באזור לablated, ולאחר מכן ליצור ROIs הקטן בתוך האזור שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון ששולט בהגדרות לייזר, להגדיר את מספר הפעימות ל&quot; 2 &quot;ואת הצלחת להנחתת% הולכה&quot; 18 &quot;. לירות לייזר בתוך ROIs נבחר. אם שרידי הקרינה בתוך ROIs, להגדיל את כוח לייזר, לחכות כ -10 שניות, ולירות לייזר שוב. לעשות את זה עד שתגיע להגדרה שגורמת fluorescence להיעלם בתוך ROIs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחכות 10 שניות או יותר ולבדוק את שטח ablated שוב לקרינה. היזהר שהחזר על השקעה עשויה בתחילה יופיע ablated, כאשר הוא בעצם photobleached. אם מחזיר הקרינה, להגדיל את כוח לייזר ולירות לייזר שוב. חזור על פעולה זו עד שתפרחת נעלמה בתוך ROIs ואינו חוזרת בתוך 10 שניות. עדיף להתחיל עם כוח לייזר פחותים ולהגדיל את כוח הדרוש ל. כוח לייזר הדרוש עשוי להשתנות בהתאם למערכות שונות מיקרוסקופיה, גיל של צבע coumarin, דגימת הרכבה, גיל הזחלים, ועובי של הרקמה. ברגע שכוח לייזר אידיאלי כבר נקבע, הגדרת כוח זה עלול לשמש שוב על עצבים שלאחר מכן באותו הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אבלציה הושלמה, תתחיל הדמיה זמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהזמן לשגות הוא מוחלט, להשתמש בתוכנת הדמיה כדי לאסוף נתונים וליצור צבע משולב Z-תחזיות עבור כל נקודת זמן. ליצור סרט QuickTime כדי לנתח את ההתנהגותשל אקסונים ותאי גלייה בו זמנית. </li></ol>

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השלבים הקריטיים ביותר של עיצוב ניסיוני זה הם: 1) כמו שצריך זחלים גובר על פגיעה ולאחר מכן in vivo הדמיה ו2) כיול לייזר ובחירת הגדרות צריכת החשמל הנכונה על מנת ליצור חיתוך רוחב עצב נקי שגורם לנזק נוסף רקמות מינימאלית . כדי להבטיח axotomy מוצלח בתחום ההדמיה vivo ונית?...

דג הזברה נעשתה שימוש נרחב ללמוד פיתוח של מערכת העצבים בגלל השקיפות האופטית שלהם וקלות transgenesis, שכאשר יחד, לאפשר הדמיה מרהיבה של התנהגויות תא דינמיות בעובר חי. בנוסף, משום שדג זברה ויונקים חולקים כמעט את כל הגנים הדרושים להיווצרות מערכת עצבים, מידע תאי ומולקולרי שנאסף באורגניזם המודל הזה הוא שאפשר להתייחס באופן ישיר לבעלי חוליות אחרים. אמנם רב עוצמה למחקרים התפתחותיים עצביים, דג הזברה והתכונות הייחודיות שלה יש פוטנציאל גם להבהיר את המנגנונים ששומרים ולבנות מחדש את מערכת העצבים לאחר פציעה. זחלי דג הזברה לשמור על השקיפות שלהם לשלבים מאוחרים של זחל ופיגמנטציה ניתן לחסום ביעילות גם עם השימוש במעכבים פרמקולוגיים של ייצור המלנין או מוטציות גנטיות שאין תאי פיגמנט. כך, באמצעות אורגניזם מודל זה ללמוד פציעה וregeneratיון בבעלי חיים מבוגרים יותר אפשרי ומציע הזדמנות הייחודית לחקור ישירות את המנגנונים התאיים ומולקולריים שלשקם את מערכת העצבים. בכתב יד זה, אנו מתארים כיצד ביעילות ובreproducibly לפגוע בעצבים בPNS של זחלי דג הזברה. הפרדיגמה פגיעה זו משאיל את עצמו ללימוד לא רק התנוונות, אלא גם את התגובות של גליה היקפית ותאים של מערכת חיסון, כמו גם את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה במהלך התחדשות. את PNS הוא רשת מורכבת של עצבים תחושתיים ומוטורי שיש צורך להעביר מידע בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) ואת העור, איברים והשרירים בגוף, המאפשר לאורגניזם כדי אינטראקציה עם סביבתו ולשרוד. לאורך העצבים האלה, גליה היקפית, כולל תאי myelinating ולא myelinating-שוואן וגליה perineurial, כמו גם רקמות חיבור, לשים בארגז את האקסונים והסוף של דבר יוצר את העצב הבוגר. פציעה של עצבים אלה יוזמת תהליך kNown כWallerian ניוון 10. מנגנון זה של פיצול axonal, גיוס חיסונית, שחרור מפסולת והתחדשות הוא מאוד סטריאוטיפי וגנטי מוסדר 1. מחקרים קודמים במערכות יונקים שתיארתי את התפקידים של תאי שווא במהלך הניוון עצבי ו1 ההתחדשות, 2, 6, 8. במחקרים של רקמות קבועה או תרבית תאים הללו, תאי שוואן גויסו לא רק מקרופאגים לאתר פציעה כדי לסייע בפינוי פסולת, אלא גם סייעו במיאלין phagocytosis עצמם. בעוד שמחקרים אלה היו אינפורמטיבי מאוד, יש לנו שלא היו מעולם תגובות גליה מדמיינים לפציעת האקסון ההיקפית in vivo בזמן אמת, ולא מחקרים אחרים בדקו את הקשר בין המעמדות של גליה היקפית השונות במהלך אירועים אלה. לאחרונה, מספר מעבדות חקרו ניוון Wallerian באמצעות דג הזברה ופציעת האקסון לייזר בתיווך דומה למה שאנו מתארים כאן <sup&gt; 4, 5, 7, 9. בחלק מהמחקרים אלה, האקסונים חושיים שטחיים היו axotomized בזחלים צעירים באמצעות מובנה מותאם אישית, מיקרוסקופ 4 שני הפוטונים confocal, 5, 9. במחקר אחר, שהוא מאוד דומה לשלנו, האקסונים עמוקים בתוך העצב המוטורי הגחון היו transected בזחלים בן 5 יום באמצעות מערכת אבלציה לייזר זמינה מסחרי 7. בשתי להגדיר קופצים הניסיוניים הללו, הדגש היה על ניוון Wallerian ושני האקסונים ותאים חיסוניים הם צלמו. להרחבה על מחקרים אלה, שאנו מתארים פציעת אקסונים מוטוריים בזחלים מבוגרים עם, עצבי myelinated בוגרים יותר וassay התגובה של כל גליה עצבים ההיקפית הקשורים בניוון והתחדשות. כדי לעשות זאת, אנחנו transect עצבים מוטוריים ב6 ולאחר הפריה 7 יום (DPF) זחלים ולדמיין את התגובות של אוכלוסיות גליה בודדות, כמו גם לחקור את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה לאורך אקסונים פגועים. באמצעות טרה כפולה ומשולשתקווי nsgenic שגליה היקפית תווית, כולל תאי שוואן וגליה perineurial, כמו גם כסמן לאקסונים, אנו משתמשים במערכת אבלציה לייזר זמינה מסחרי בהיקף של חנקן נשאב צבע לייזר (אורך הגל nm 435) המחובר למערכת confocal דיסק ספינינג כדי ליצור transections האקסון. זה מאפשר ניסיוני הגדרתנו לדמיין חיה דג הזברה, הזחל, לפגוע בשטחים ספציפיים היקפיים מוטוריים האקסון וזמן לשגות תמונה את התגובות של אוכלוסיות שונות גלייה לפציעת האקסון ומערכת היחסים שלהם אחד לשנייה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם יותר ליצירת פציעות עצב בדג זברה בגילים שונים, עם קווים מהונדסים שונים או מוטציות גנטיות כדי לענות על שאלות מדעיות שונות.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

מערכת העצבים מתוארת לעתים קרובות כמרכיב ומקודד היטב בגוף גם אם היא מערכת איברים במידה ניכרת נוזל שמגיבה לגירויים חיצוניים, באופן עקבי, סטריאוטיפי, תוך שמירה על גמישות ופלסטיות מדהימה. בניגוד למערכת העצבים המרכזי (CNS), מערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי, אבל אנחנו רק עכשיו התחלנו להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש בדג זברה כמערכת מודל, יש לנו הזדמנות חסרת תקדים לכמה מחקרי משובי עם in vivo הדמיה ומניפולציה גנטית. עצבים היקפיים מורכבים מהאקסונים מוקפים בשכבות של גליה ורקמות חיבור. אקסונים הensheathed ידי myelinating או אי myelinating-תאי שוואן, שהם בתורם עטוף לתוך fascicle ידי נדן סלולרי נקרא perineurium. בעקבות פציעה, יש עצבים היקפיים למבוגרים יכולת יוצאת דופן לרמהפגום יש פסולת axonal ומטרות מחדש innervate. כדי לחקור את התפקידים של כל גליה ההיקפית בהתחדשות PNS, אנו מתארים כאן assay חיתוך רוחב האקסון המשתמש בליזר צבע זמין מסחרי חנקן נשאב לaxotomize עצבים מוטוריים בדג זברה מהונדס חי. בנוסף, אנו מתארים את השיטות לכמה ניסויים אלה לזמן לשגות הדמיה של עצבים פגועים ושליטה. פרדיגמה ניסויית זה יכול לשמש לא רק כדי להעריך את התפקיד שמחזה גליה בהתחדשות עצב, אבל יכול להיות גם הפלטפורמה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים תיקון מערכת עצבים.

Assay המתואר כאן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את התגובה של תאי גלייה ואוכלוסיות תאי עצב אחרים הקשורים לפציעת axonal in vivo. סרט 1 מציג דוגמה לפגיעה בעצב שנוצר באמצעות שיטה זו והתגובה של סביבת תאי גלייה. ניסוי זה בוצע ב Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (olig2: DsRed) דג הזברה, שבו גליה perin...

Watch this Scientific Journal Video about Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish at JoVE.com

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Views.  University of Virginia. למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשו...

Video: Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...