저자는 뛰어난 기술 지원을위한 귀중한 토론과 정원 테크놀로지에 대한 Kucenas 연구소에 감사드립니다. 작품은 과학 기술 우수 UVA 기금 (FEST) (SK)에 의해 지원되었다.

1. 절제와 라이브 영상을위한 준비 및 제브라 피쉬 배아의 설치 <ol><li> 계란 물에 0.8 % 낮은 용융 아가로 오스의 주식을 준비한다. 필요한 ° C까지 4에서 13X 100mm 처분 할 수있는 문화 튜브 및 저장소로 나누어지는. </li><li> 찬란 모터 뉴런과 관심의 아교 세포 유형 레이블을 안정적으로 통합 된 형질 전환 유전자를 포함하는 크로스 성인 zebrafish의. 올바른 준비를위한 ° C 배양기 3 이후 28.5 달걀 물과 장소에 제브라 피쉬 배아를 수집합니다. </li><li> 약 24 시간 포스트 수정 (HPF)에서 계란 물을 제거하고 계란 물에 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU) 0.002 %를 추가합니다. 인큐베이터에 배아를 반환합니다. </li><li> 24 96 HPF 사이에, 배아는 형광 해부 범위에서 원하는 형질 전환 유전자의 존재에 대한 검사를해야한다. 신선한 PTU 계란 물에 선택된 배아를 놓고 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 유충 6 일 게시물 수정 (DPF) (또는 원하는 나이)에 도달하면, 인큐베이터에서 제거, 설치에 대한 몇 가지 유충을 선택하고, 작은 접시로 전송할 수 있습니다. </li><li> 접시에서 물을 제거하고 즉시 PTU 달걀 물에 약 0.02 % Tricane로 교체합니다. 유충은 약 5 분 마취에 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 30 초 동안 수돗물 전자 레인지 비커에 0.8 % 낮은 용융 아가로 오스의 나누어지는을 배치하거나,​​ 아가가 녹을 때까지. 문화 관 아가로 오스가 터치 (뜨겁지 않은)에 미지근한 느낌까지 비커를 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 마취 유충을 선택하고 단일 또는 다중 아니라 35mm 유리 바닥 접시에 전송할 수 있습니다. 애벌레로 전송 된 모든 물을 제거 후 즉시 요리의 유리 바닥 부분을 채우기에 충분한 따뜻한 아가로 오스와 유충을 커버하지만, 큰 돔을 만들 수 없습니다. </li><li> 아가로 오스는 견고으로 접시의 바닥에 옆으로 애벌레의 위치를​​ 해부 바늘을 사용하여, 다음의 뒷면에 단지 약간 애벌레를 기울이십시오. 그것은 부상 이후 이미징을위한 필수적입니다마운트 된 유충은 접시의 바닥에 유리를 터치 할. 아가로 오스가 응고되어 유충이 고정 될 때까지이 위치에 유충을 유지하기 위해 해부 바늘을 사용합니다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 경화되면, 천천히 완전히 아가로 오스와 유충을 커버하는 접시에 충분히 Tricane 물 (이것은 마취에 사용되는 것과 동일한 Tricane 될 수 있습니다) 피펫. </li></ol> 2. 레이저 교정 및 테스트 <ol><li> 모든 공 촛점 현미경 계측, 흥미 진진한 제브라 피쉬의 도입 유전자에 적합한 다이오드 레이저, 및 질소 펌프 색소 레이저를 켭니다. &quot;빈&quot;빔 스플리터가 제자리에 있는지 확인합니다, 레이저 감쇠기는 완전히 개방하고, 435 nm의 쿠마린 염료 셀 위치에 있습니다. 컴퓨터에서 이미징 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 위치에 63X 1.2NA 물 침수 목표를 이동하고 객관적 위에 물이 목적을 침수 매체의 작은 방울을 적용합니다. 63X 목표는 좋은 레이저 절제 정확도 및 물 수 전mmersion 6-7 DPF의 zebrafish의 애벌레로 작업 할 때 필요한 큰 작업 거리를 허용합니다. </li><li> 레이저의 교정을 위해 사용하는 하나의 미러면 유리 슬라이드를 얻습니다. 현미경 스테이지로, 슬라이드, 거울면을 아래로 놓습니다. </li><li> 브라이트 조명 아래 접안 렌즈를 사용하여, 찾아 거울에 흠집이나 에칭에 초점을 맞 춥니 다. 브라이트 빛은 유리 슬라이드에 아래로 빛나는 수 있지만 미러가 긁히거나 에칭 된 장소에서 목적에 통과하고, 접안 렌즈를 통해 검은보고 거울을 유발하고, 에칭은 반점 같이하거나 빛의 라인. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에 에칭을보고 초점을 맞 춥니 다. 레이저 캘리브레이션 및 전원 설정을 제어 창을 엽니 다. &quot;1&quot;펄스의 수와 &quot;3&quot;%의 전송에 감쇠 플레이트를 설정합니다. 펄스의 수는 레이저 각 관심 영역 (RO 내에 발생하는 횟수를 나타냅니다I)와 % 전송은 레이저 출력을 나타냅니다. 정확한 보정 설정은 63X 1.2NA 침수 목적으로 선택되어 있는지 확인합니다. </li><li> 기본 도구 모음에서 타원 도구를 선택하고 하나의 원형 ROI를 생성하는 컴퓨터 화면의 이미지를 클릭합니다. 이미지 위에 무작위로 간격을 4 원형 로아가 될 때까지이에게 3 번 이상을 수행합니다. </li><li> 일부 시스템은 접안에 빛의 경로가 열려있는 경우 레이저가 발사하는 것을 허용하지 않습니다 안전 기능을 포함 할 수 있습니다. 이 경우 수동으로 시간 접안에 빛의 경로를 닫습니다. </li><li> 레이저를 발사. 이것은 각 원형 ROI 내 4 작은 반점 에칭, 1을 생성합니다. 레이저가 발생하지 않는 경우, 레이저가 켜져 있고 제대로 연결되어 있고, 접안에 빛의 경로가 닫혀 있는지 확인 할 수 확인하십시오. 레이저 발생하지만 에칭을 볼 경우, &quot;빈&quot;빔 스플리터가 제자리에 있는지 확인합니다 확인하십시오. 모든 장소에있는 경우, 에칭 아칸소 때 레이저 파워와 &quot;FRAP을&quot;증가가시 마. 10보다 큰 설정 레이저 전원 에칭 유리 필요한 경우,이 레이저 플라즈마 카트리지를 교체해야합니다 나타낼 수 있습니다. </li><li> 에칭 반점 선택한 ROI를 가운데에 나타나는 경우, 보정 (2.12로 진행) 필요가 없습니다. 반점이 중앙에 있지 않은 경우, 보정 설정을 업데이트해야합니다. </li><li> 보정하려면 업데이트에게 보정 설정을 클릭합니다. 레이저 발사하고 이미지는 하나의 에칭 포인트를 포함한 나타납니다. 지점이 표시되지 않는 경우, 보정을 취소 레이저 출력을 증가하고, 다시 교정을 시작합니다. </li><li> 현장의 중심을 클릭합니다. 레이저가 다시 발생하고, 다른 지점이 표시됩니다. 그 점을 클릭하고 교정이 완료되고 9 반점 그리드 방식으로 표시 될 때까지이 과정을 반복합니다. 보정이 성공적으로 완료되었는지 확인하는 단계 2.6-2.9를 반복합니다. </li><li> 현미경 스테이지에서 유리 슬라이드를 제거하고 목표를 청소합니다. OCU에 빛의 경로를 엽니 다라스, 및 &quot;100 % ILL&quot;빔 스플리터 &quot;빈&quot;빔 스플리터를 교체합니다. </li></ol> 3. 레이저 어블 레이션 및 아교 세포 행동의 경과 공 촛점 이미징을 사용하여 신경 절개 <ol><li> 유리 슬라이드를 보유하고 35mm 유리 바닥 요리를 유지하기위한 적절한 단계로 교체하는 데 사용되는 단계를 제거합니다. 63X 1.2NA 물 침지 목표를 계속 사용합니다. </li><li> 목적에 침수 매체의 작은 방울을 적용하고 무대에 탑재 된 유충과 접시를 놓습니다. 클립 접시를 안정. </li><li> 접안 렌즈와 위드 조명을 사용하여 유충을 집중하고 운동 신경을 찾습니다. hemisegments 10-20에 신경을 검사하고 절개를위한 모터 신경을 선택합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에 신경의 라이브 뷰를 엽니 다. Z-평면을 선택하고 축삭 손상되지 않은 신경 glial 세포의 이미지를 획득. </li><li> 캡처 이미지 소프트웨어에서 시간 경과 영상 설정을 준비합니다실험에 따라 5-30 분 간격의 모든 세포 유형의 Z-전망. 그것은 절제를 수행하기 전에 시간 경과에 필요한 모든 설정을 만드는 것이 좋습니다, 그래서 부상이 완료되면 시간이 경과 시작의 지연이 없습니다. </li><li> &quot;100 % ILL&quot;빔 스플리터를 제거하고 &quot;빈&quot;로 바꿉니다. 접안하는 광경을 닫습니다. </li><li> 신경의 라이브 뷰로 돌아갑니다. 그었 될 축삭을 보려면 적절한 형광 채널을 사용합니다. </li><li> 타원 도구를 사용하여 소작 할 영역의 얇은 타원형 ROI를 만든 다음 선택한 지역 내 작은 ROI를 만듭니다. </li><li> 레이저 설정을 제어 창에서 &quot;2&quot;로 펄스 수를 설정하고 감쇠 판 &quot;18&quot;% 전송합니다. 선택한 로아에서 레이저를 발사. ROI를 내 형광 유물은 레이저 출력을 증가 시키면 약 10 초 정도 기다린 다음 다시 레이저를 발사. 당신이 fluorescen을 일으키는 설정에 도달 할 때까지이 작업을 수행세륨은 ROI를 내 사라질 수 있습니다. </li><li> 10 초 이상 기다린 후 형광 다시 소작 영역을 확인합니다. 실제로 photobleached 때 ROI가 처음 소작 나타날 수 조심. 형광 반환하면 레이저 출력을 증가시키고 다시 레이저를 발사. 개화는 ROI를 내 사라지고 10 초 내에 반환되지 않을 때까지이 과정을 반복합니다. 그것은 낮은 레이저 출력을 시작하고 필요한 전력을 증가하는 것이 가장 좋습니다. 필요한 레이저 파워는 개별 현미경 시스템, 쿠마린 염료의 나이, 시편 장착, 유충의 연령, 조직의 두께에 따라 달라질 수 있습니다. 이상적인 레이저 전원이 설정되면,이 전원 설정은 동일한 실험에서 다음 신경에 다시 사용할 수 있습니다. </li><li> 제거가 완료되면, 시간 경과 영상을 시작합니다. </li><li> 시간 경과가 완료되면 데이터를 컴파일하고 Z-투상 각 시점의 컬러 복합 만들 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 동작을 분석하는 QuickTime 동영상을 만들동시에 축삭과 glial 세포의. </li></ol>

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 실험 설계의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 생체 내 이미징 및 2 부상 이후 제대로 설치 유충) 깨끗한 신경 절개를 만들기 위해 레이저를 교정하고 올바른 전원 설정을 선택하는 최소한의 추가 조직 손상의 결과 . 생체 내 이미징 및 이후의 분석을위한 성공 axotomy을 보장하기 위해, 각각의 유리 바닥 요리 중 하나 또는 칸막이 유리 바닥 접시에 여러 유충을 ?...

제브라 피쉬 때문에 그들의 광학 투명 신경계의 발달을 연구하고 transgenesis의 용이성, 그 결합 할 때, 생활 배아에서 동적 세포 행동의 멋진 영상을 허용하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 제브라 피쉬와 포유류는 거의 모든 신경계 형성이 모델 생물에서 수집 한 세포 및 분자 정보에 필요한 유전자 공유하기 때문에 또한, 다른 척추 동물 종에 직접 논리적 인 사람이어야합니다. 신경 발달 연구를위한 매우 강력한 있지만, 제브라 피쉬와 독특한 속성은 또한 손상 후 신경 시스템을 유지하고 다시 메커니즘을 규명 할 수있는 잠재력이있다. Zebrafish의 유충 늦은 애벌레 단계로 자신의 반투명을 유지하고 색소 침착을 효과적으로 멜라닌 생산 또는 색소 세포가 부족한 유전자 돌연변이의 약물 억제제의 사용도 함께 차단 될 수 있습니다. 따라서,이 모델 생물을 사용하면 부상 및 regenerat을 연구하는세 동물의 이온이 가능하고, 직접 신경 시스템을 다시 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 독특한 기회를 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 효율적이고 재현성 zebrafish의 애벌레의 PNS의 신경을 손상하는 방법에 대해 설명합니다. 이 부상 패러다임은 주변 glia의 면역 세포의 반응뿐만 아니라, 재생하는 동안이 인구 사이의 상호 작용도 변성뿐만 아니라 공부에 자신을 준다, 그러나. PNS는 유기체가 환경과 상호 작용하고 생존 할 수 있도록, 중추 신경계 (CNS)와 피부, 장기와 신체의 근육 사이에 정보를 전달하는 데 필요한 운동 및 감각 신경의 복잡한 네트워크입니다. 이 신경을 따라 수초가 아닌 수초 슈반 세포와 perineurial 아교뿐만 아니라, 결합 조직, 축삭 넣다 궁극적으로 성숙한 신경을 형성하는 등 주변의 glia. 이러한 신경의 손상이 프로​​세스 K를 시작Wallerian 변성 10 nown. 축삭 분열, 면역 채용, 파편 통관 및 재생이 메커니즘은 매우 틀에 박힌 및 유전자 1 규제이다. 포유류 시스템의 이전 연구는 신경 변성 및 재생 1, 2, 6, 8시 슈반 세포의 역할을 설명했습니다. 고정 된 조직 또는 세포 배양의 이러한 연구에서는 슈반 세포뿐만 아니라 파편 정리에 도움이 상해 사이트에 대식 세포를 모집뿐만 아니라, 수초의 식균 작용 자체 주었. 이러한 연구는 매우 유익하고 있지만, 우리는 실시간으로 생체 내 말초 축삭 손상에 대한 시각 신경교 반응하기 전에 적이없는, 그리고 다른 연구는 이러한 이벤트 기간 동안 주변 교세포의 다른 클래스 사이의 관계를 조사 없다. 최근, 여러 실험실 우리가 여기서 설명하는 것과 유사한 제브라 피쉬와 레이저 매개 축삭 손상을 사용 Wallerian 변성을 조사했습니다 <sup&gt; 4, 5, 7, 9. 이러한 연구의 일부, 피상적 인 감각 축삭은 사용자 지정 내장, 두 광자 공 초점 현미경 4, 5, 9를 사용하여 어린 유충에 axotomized 하였다. 또 다른 연구에서, 이는 우리 자신과 매우 유사하다, 복부 운동 신경에서 깊은 축삭은 상업적으로 이용 가능한 레이저 제거 시스템 7을 사용 오일 오래된 유충에 그었 하였다. 이러한 실험 셋업 모두에 초점을 Wallerian 변성 두 축삭과 면역 세포 군데 있었다있었습니다. 이러한 연구를 확장하기 위해, 우리는 더 성숙한, 유수 신경 및 분석 변성과 재생 동안 모든 신경 관련 주변 교세포의 반응을 함께 오래된 애벌레의 모터 축삭 손상 대해 설명합니다. 이렇게하려면, 우리는뿐만 아니라 손상된 축삭을 따라 이러한 집단 간의 상호 작용을 조사하기로 6 운동 신경, 7 일 게시물 수정 (DPF) 유충을 절개 개별 교세포 집단의 반응을 시각화. 더블, 트리플 TRA를 사용하여그 슈반 세포와 perineurial 아교뿐만 아니라 축삭을위한 마커 등의 라벨 주변 아교, nsgenic 라인, 우리는 구성된 시판 레이저 제거 시스템을 사용 질소 펌프 회전 디스크 공 촛점 시스템에 부착 된 염료 레이저 (파장 435 nm의) 축삭 transections을 만들 수 있습니다. 이 실험 셋업 우리가 서로 축삭 손상과의 관계에 특정 주변 장치 모터 축삭 책자 및 시간 경과 이미지 별개의 폐해 인구의 반응을 손상, 라이브, 애벌레 zebrafish의를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 과학적 문제를 해결하기 위해 서로 다른 유전자 변형 라인이나 유전 적 돌연변이로, 다른 나이의 제브라 피쉬의 신경 부상을 만들기 위해 적용 할 수 있습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

놀라운 유연성과 가소성을 유지하면서, 일관성, 틀에 박힌 방식으로 외부 자극에 반응 상당히 유동성 장기 시스템에도 신경 시스템은 종종 신체의 하드 와이어드 구성 요소로 설명되어 있습니다. 중추 신경계와는 달리 (CNS), 말초 신경계 (PNS)는 중요한 수리를 할 수있다, 그러나 우리는 단지이 현상을 제어하는​​ 세포와 분자 메커니즘을 이해하기 시작했다. 모델 시스템으로 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 생체 내 이미징 및 유전자 조작에 함께 부부 재생 연구에 전례없는 기회를 가질 수있다. 말초 신경은 아교 세포와 결합 조직의 층에 의해 둘러싸인 축삭으로 구성되어 있습니다. 축삭은 perineurium라는 세포 칼집에 의해 다발에 싸여 차례에 슈반 세포를 수초 또는 비 수초에 의해 ensheathed 있습니다. 부상 다음, 성인 말초 신경 레모 놀라운 능력을 가지고적 축삭 파편과 다시 신경을 분포시키다 목표를 손상. PNS 재생에있는 모든 주변 교세포의 역할을 조사하기 위해, 우리는 여기에 살고 형질 전환 제브라 피쉬의 운동 신경을 axotomize하기 위해 상업적으로 이용 가능한 질소 펌프 색소 레이저를 사용하는 축삭 절개 분석을 설명합니다. 우리는 더 이상 부상 및 제어 신경의 시간 경과 영상에이 실험 커플 방법을 설명합니다. 이 실험 패러다임은 아교 세포의 신경 재생에 재생, 그러나 또한 신경계 복구를 제어하는​​ 분자 메커니즘을 해명을위한 플랫폼이 될 수있는 역할을 평가하지하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에 설명 된 분석은 생체 내에서 축삭 손상에 glial 세포와 다른 신경 관련 세포 집단의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 영화 1이 방법과 glial 세포를 둘러싼의 응답을 사용하여 만든 신경 손상의 예를 보여줍니다. 이 실험은 (nkx2.2a : megfp) 전이에서 수행되었다 전이 (olig2 :는 DsRed) 제브라 피쉬, perineurial의 glia은 EGFP와 모터 뉴런 표현 세포질이 DsRed를 대상으로 ?...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K 조회수.  University of Virginia. 말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

비디오: Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

연구

신경과학

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...