Yazarlar üstün teknik destek için değerli tartışmalar ve Nisabı Technologies, Inc için Kucenas Lab teşekkür etmek istiyorum. Çalışma Bilim ve Teknoloji Mükemmellik için UVa Fonu (FEST) (SK) tarafından desteklenmiştir.

1. Ablasyon ve Canlı Görüntüleme Hazırlık ve Zebra balığı Embriyolar montajı <ol><li> Yumurta suda% 0.8 düşük erime agaroz bir stok hazırlayın. Gerekli ° C kadar 4 de 13X 100 mm tek kültür tüpleri ve mağaza içine kısım. </li><li> Floresan motor nöronlar ve ilgi glial hücre tipleri etiketlemek için istikrarlı bir şekilde entegre transgenlerin içeren çapraz yetişkin zebrafish. Doğru evreleme için ° C inkübatör sonra 3 28.5 yumurta su ve yerde Zebra balığı embriyolarının toplayın. </li><li> Yaklaşık 24 saat sonra döllenme (hpf) de, yumurta su çıkarmak ve yumurta suda 1-fenil 2-tiyoüre (PTU) 0.002% ekleyin. Inkübatör embriyolar dönün. </li><li> 24 ve 96 hpf arasında, embriyo bir floresan diseksiyon kapsamı istenilen transgenlerin varlığı için taranmalıdır. Tatlı PTU yumurta su seçilen embriyolar yerleştirin ve inkübatör dönmek. </li><li> Larva 6 gün sonra döllenme (DPF) (veya istenilen yaş) ulaştığınızda, inkübatör kaldırmak, Montaj için birkaç larva seçin ve daha küçük çanak aktarabilirsiniz. </li><li> Çanak su çıkarmak ve hemen PTU yumurta su yaklaşık 0.02% Tricane ile değiştirin. Larva yaklaşık 5 dakika anestezi oturmak için izin verin. </li><li> 30 sn için musluk suyu ve mikrodalga ile bir beher% 0.8 düşük erime agaroz bir kısım yerleştirin veya agaroz eriyene kadar. Kültür tüp agaroz dokunmatik (sıcak değil) için ılık hissediyor kadar beher soğumasını bekleyin. </li><li> Bir anestezi larva seçin ve tek veya çok iyi 35 mm cam alt çanak aktarın. Larva ile transfer edildi herhangi bir su çıkarın, sonra hemen yemeğin altı cam bölümü doldurmak için yeterince sıcak agaroz ile larva kapağı ama büyük bir kubbe oluşturmaz. </li><li> Agaroz sertleşir gibi, çanak altındaki yan larva konumlandırmak için bir diseksiyon iğne kullanın, sonra sırtında sadece biraz larva yatırın. Bu, yaralanma ve sonraki görüntüleme için bir şart olduğumonte larva çanak altındaki cam dokunmadan. Agaroz katılaşmış ve larva hareketsiz kadar bu pozisyonda larva korumak için diseksiyon iğne kullanın. </li><li> Agaroz tamamen sertleştikten sonra, yavaş yavaş tamamen agaroz ve larva kapsayacak şekilde çanak yeterli miktarda Tricane su (bu anestezi için kullanılan aynı Tricane olabilir) pipetle. </li></ol> 2. Lazer Kalibrasyon ve Test <ol><li> Tüm konfokal mikroskop enstrümantasyon, heyecan verici Zebra balığı transgenlerin için uygun diyot lazerler, ve azot pompalı boya lazer açın. &quot;Boş&quot; ışın ayırıcı yerinde olduğundan emin olun, lazer zayıflatıcı tamamen açık olan ve 435 nm Kumarin boya hücre sırada yer alıyor. Bilgisayarda, görüntüleme yazılımını açın. </li><li> Yerine bir 63x 1.2NA suya daldırma hedefi hareket ve amaç üzerine su hedefleri için daldırma orta küçük bir damla uygulayın. Bir 63x objektif iyi lazer ablasyon doğruluğu ve su sağlayacak immersion 6-7 dpf&#39;e Zebra balığı larvaları ile çalışırken gereklidir daha büyük bir çalışma mesafesi, sağlar. </li><li> Lazer kalibrasyon için kullanılacak bir aynalı tarafı ile bir cam slayt edinin. Mikroskop sahneye, slayt, ayna tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirin. </li><li> Aydınlık aydınlatma altında mercek kullanarak, bulmak ve aynada bir çizik ya da aşındırma odaklanın. Aydınlık ışık cam slayt üzerine aşağı parlayan olacak, ancak sadece ayna çizik ya da uzakta kazınmış olan yerlerde hedefi geçecek, mercek ile siyah bakmak için ayna neden ve gravürler noktalar gibi ya da ışık çizgileri. </li><li> Görüntüleme yazılımı kullanarak bilgisayar ekranında gravür bilgileri ve odaklanır. Lazer kalibrasyon ve güç ayarlarını kontrol penceresini açın. &quot;1&quot; darbe sayısı ve &quot;3&quot;% iletim için zayıflatma plakası olarak ayarlayın. Darbe sayısı lazer ilgi her bölge (RO içinde yangın sayısını temsilI) ve% iletim lazer gücünü temsil eder. Doğru kalibrasyon ayarı 63x 1.2NA suya daldırma hedefi için seçili olduğundan emin olun. </li><li> Ana araç çubuğundan elips aracını seçin ve tek bir dairesel ROI oluşturmak için bilgisayar ekranında resmi tıklatın. Resmin üzerine rastgele aralıklı 4 dairesel ROI kalmayıncaya kadar bu 3 kez yapın. </li><li> Bazı sistemler Okülerin için ışık yolu açıksa lazer ateş izin vermez bir güvenlik özelliği içerebilir. Bu durumda, el ile şu anda Okülerin için ışık yolunu kapatmak. </li><li> Lazer ateş. Bu, her dairesel ROI içinde 4 küçük nokta gravür, 1 yaratacaktır. Lazer ateş yoksa, lazer açık ve doğru bağlandığından ve Okülerin için ışık yolu kapalı olduğundan emin olmak için kontrol edin. Lazer yangınlar ancak gravür görülürse, &quot;boş&quot; ışın ayırıcı yerinde olduğundan emin olmak için kontrol edin. Her şey yerinde ise, gravür ar kadar lazer gücü ve &quot;sıkı bağlamak&quot; artışgörebilir örn. 10&#39;dan büyük ayarı bir lazer güç aşındırma cam için gerekli ise, bu lazer plazma kartuşunun değiştirilmesi gerekiyor gösterebilir. </li><li> Kazınmış noktalar seçilen ROI içinde merkezli görünüyorsa, hiçbir kalibrasyon (2.12 devam) gereklidir. Noktalar merkezli değilseniz, kalibrasyon ayarı güncelleştirilmesi gerekiyor. </li><li> Kalibre etmek için, güncelleştirme kalibrasyon ayarı tıklatın. Lazer ateş ve bir görüntü tek kazınmış noktası içeren görünür. Noktası görünmüyorsa, kalibrasyon iptal lazer gücünü artırmak ve tekrar kalibrasyonu başlatın. </li><li> Nokta ortasına tıklayın. Lazer yine ateş edecek, ve başka bir nokta belirir. Bu noktada tıklatın ve kalibrasyon tamamlandığında ve 9 noktalar bir tablo şekilde görünür kadar bu işlemi tekrarlayın. Kalibrasyon başarılı olduğunu kontrol etmek için adımları 2.6-2.9 tekrarlayın. </li><li> Mikroskop aşamasından cam slayt çıkarın ve objektif temizleyin. Ocu için ışık yolu açınlars ve &quot;% 100 ILL&quot; ışın ayırıcı ile &quot;boş&quot; ışın ayırıcı değiştirin. </li></ol> 3. Lazer Ablasyon ve glial hücre Davranışların Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Sinir transeksiyonu <ol><li> Cam slayt tutun ve 35 mm cam dipli yemekleri tutmak için uygun bir sahne ile değiştirmek için kullanılan sahne çıkarın. 63x 1.2NA suya daldırma hedefi kullanmaya devam edin. </li><li> Hedefi suya daldırma orta küçük bir damla uygulayın ve sahne üzerine monte larva ile çanak yerleştirin. Klipler ile çanak stabilize. </li><li> Mercek ve geniş açılı aydınlatma kullanarak, larva odak ve motor sinirleri bulun. Hemisegments 10-20 sinirler tarama ve kesisi için bir motor sinir seçin. </li><li> Görüntüleme yazılımı kullanarak bilgisayar ekranında sinir bir canlı görünümü getirin. Z-uçakları seçin ve akson ve zarar görmemiş sinir glial hücreler bir görüntü kazanır. </li><li> Yakalamak için görüntüleme yazılımı zaman atlamalı görüntüleme ayarları hazırlayınDeneye bağlı olarak 5-30 dakika aralıklarla tüm hücre türlerinin Z-projeksiyonları. Bu ablasyon yapmadan önce geçen zaman için gerekli tüm ayarlarını oluşturmak için iyi, bu nedenle yaralanma tamamlandıktan sonra geçen zaman başlangıç ​​herhangi bir gecikme yoktur. </li><li> &quot;% 100 ILL&quot; ışın ayırıcı çıkarın ve &quot;boş&quot; ile değiştirin. Okülerin için ışık yolu kapatın. </li><li> Sinirin canlı görünümüne dönmek. Transeksiyon olacak akson görmek için uygun floresan kanal kullanın. </li><li> Elips aracını kullanarak, ablasyon için bölgede ince bir eliptik ROI oluşturmak, daha sonra seçilen bölge içinde küçük ROI oluşturun. </li><li> Lazer ayarları kontrol penceresinde, &quot;2&quot; için darbe sayısını ayarlamak ve zayıflama plaka &quot;18&quot;% iletim. Seçilen ROI içindeki lazer ateş. ROI içinde floresan kalıntıları, lazer gücünü artırmak ise, yaklaşık 10 saniye bekleyin ve tekrar lazer ateş. Eğer flüoresan neden olan bir ayara ulaşana kadar bunu yapınce ROI içinde kaybolur için. </li><li> 10 veya daha fazla saniye bekleyin ve floresan için tekrar ablasyon alanını kontrol edin. Aslında photobleached olduğunda bir yatırım getirisi başlangıçta, ablasyon görünebilir dikkat edin. Floresan dönerse, lazer gücünü artırmak ve tekrar lazer ateş. Çiçek açma ROI içinde kaybolur ve 10 saniye içinde geri dönmez kadar bu işlemi tekrarlayın. Bu daha az lazer gücü ile başlar ve gerekli gücü artırmak için en iyisidir. Gerekli lazer gücü bireysel mikroskopi sistemleri, Kumarin boya yaş, örnek montaj, larva yaşı ve doku kalınlığına göre değişebilir. Ideal bir lazer gücü bir kez kurulduktan sonra, bu güç ayarı aynı deneyi daha sonra sinirler üzerinde yeniden kullanılabilmektedir. </li><li> Ablasyon tamamlandığında, zaman atlamalı görüntüleme başlar. </li><li> Geçen zaman tamamlandığında, verileri derlemek ve Z-projeksiyonları her noktası için renk kompozit oluşturmak için görüntüleme yazılımı kullanın. Davranışını analiz etmek için bir QuickTime film oluşturuneş zamanlı olarak akson ve glial hücreler. </li></ol>

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu deneysel tasarım en kritik adımlar şunlardır: 1) in vivo görüntüleme ve 2 yaralanma ve sonraki için uygun montaj larva) temiz bir sinir kesisi oluşturmak için lazer kalibrasyon ve doğru güç ayarlarını seçerek bu minimal ekstra doku hasarı ile sonuçlanır . In vivo görüntüleme ve sonraki analiz için başarılı axotomy sağlamak için, tek tek cam alt yemekleri ya ya da bölücüler ile bir cam alt tabak birden fazla larva monte. Lazer kalibrasyon sonra, sinir ...

Zebra balığı nedeniyle optik şeffaflık sinir sisteminin geliştirilmesi çalışma ve transgenesis kolaylığı, hangi birleştiğinde, bir canlı embriyo dinamik hücre davranışları muhteşem görüntüleme sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebrabalıkları ve hemen hemen her memeli sinir sisteminin oluşumu, bu model organizma toplanan hücresel ve moleküler bilgileri için gerekli olan genleri paylaştığından Buna ek olarak, başka bir omurgalı türünün ile doğrudan ilişkilendirilebilir. Nöral gelişim çalışmaları için inanılmaz güçlü olsa da, Zebra balığı ve eşsiz özellikler de yaralanma sonrası sinir sistemi korumak ve yeniden mekanizmaları aydınlatmak için potansiyel var. Zebra balığı larvaları geç larva dönemlerinde onların translusensi korumak ve pigmentasyon etkili melanin üretimini veya pigment hücreleri eksikliği genetik mutantlar farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı ya ile bloke edilebilir. Bu nedenle, bu model organizma kullanarak yaralanma ve rejenerasyon çalışmayaşlı hayvanlarda iyon mevcuttur ve doğrudan sinir sistemini yeniden hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için benzersiz bir fırsat sunuyor. Bu yazıda, verimli ve tekrarlanabilir Zebra balığı larvalarının PNS içinde sinirler zarar nasıl açıklar. Bu yaralanma paradigma periferik glia ve bağışıklık hücrelerinin yanıtları yanı sıra rejenerasyon sırasında bu nüfus arasındaki etkileşimleri de dejenerasyon sadece eğitim için oldukça rahat, ancak. PNS bir organizma çevre ile etkileşim ve hayatta kalmak için izin, merkezi sinir sistemi (MSS) ve cilt, organlar ve vücudun kas arasında bilgi aktarmak için gerekli olan motor ve duyu sinirleri karmaşık bir ağdır. Bu sinirler birlikte, Myelinating ve non-myelinating Schwann hücreleri ve perineurial Glia, yanı sıra bağ dokusu, aksonların örten ve sonuçta sinir olgun formu dahil olmak üzere çevresel glia. Bu sinirlerin yaralanması süreci k başlatırWallerian dejenerasyon 10 olarak nown. Aksonal parçalanma, bağışıklık işe alım, enkaz temizleme ve yenilenme Bu mekanizma çok kalıplaşmış ve genetik 1. düzenlenir. Memeli sistemlerde önceki çalışmalarda sinir dejenerasyonu ve rejenerasyon, 1, 2, 6, 8 sırasında Schwann hücrelerinin rolleri tanımlamışlardır. Sabit doku ya da hücre kültürü bu çalışmalarda, Schwann hücreleri sadece enkaz temizleme yardımcı olmak için yaralanma siteye makrofajlar işe değil, aynı zamanda miyelin fagositoz kendilerini destekli. Bu çalışmaların son derece bilgilendirici olmuştur, biz gerçek zamanlı olarak in vivo periferik akson hasarına görsel glial tepkiler daha önce hiç var ve başka çalışmalar bu olaylar sırasında çevre glia farklı sınıflar arasındaki ilişkiyi araştırdık. Son zamanlarda, çeşitli laboratuarları biz burada açıklamak ne benzer Zebra balığı ve lazer aracılı akson hasarı kullanarak Wallerian dejenerasyon araştırdık <sup&gt; 4, 5, 7, 9. Bu çalışmaların bazılarında, yüzeysel duyu sinir özel bir yerleşik, iki foton konfokal mikroskop 4, 5, 9 ile genç larvaları axotomized edildi. Başka bir çalışmada, hangi bizimkine çok benzer, ventral motor sinir içinde derin akson bir ticari lazer ablasyon sistemi 7 ile 5 günlük larvaları transeksiyon edildi. Bu deneysel set-up her ikisinde de, odak Wallerian dejenerasyon ve hem de akson ve bağışıklık hücreleri görüntülenmiştir vardı. Bu çalışmalar genişletmek için, daha olgun, miyelinli sinir ve tahlil dejenerasyon ve rejenerasyon sırasında tüm sinir ile ilişkili çevresel glia tepki ile eski larva motor aksonlar yaralanmasına açıklar. Bunu yapmak için, biz de yaralı akson birlikte bu nüfus arasındaki etkileşimleri araştırmak üzere 6 motor sinirler ve 7 gün sonra döllenme (DPF) larva transect ve bireysel glial nüfus yanıtları görselleştirmek. Çift ve üçlü tra kullanarakbu Schwann hücrelerinin ve perineurial glia yanı sıra, aksonlar için bir gösterge de dahil olmak üzere çevresel etiket glia nsgenic hatları, böylece oluşan bir ticari olarak temin edilebilen lazer ablasyon sistemi kullanmak bir azot pompalanmış dönen bir disk konfokal sisteme bağlı boya lazeri (dalga boyu 435 nm) akson kesilerde oluşturmak için. Bu deneysel kurulum bize birbirine akson yaralanma ve ilişkileri özgü periferik motor akson yolları ve zaman atlamalı görüntü farklı glial nüfus yanıtları zarar, canlı, larva Zebra balığı görüntülemenizi sağlar. Bu protokol daha farklı bilimsel soruları için farklı transgenik çizgiler veya genetik mutantlar ile, farklı yaşlardaki Zebra balığı sinir yaralanmaları oluşturmak için adapte edilebilir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

Inanılmaz esneklik ve plastisite korurken, tutarlı, kalıplaşmış bir şekilde dış uyaranlara tepki oldukça akışkan organ olmasına rağmen sinir sistemi genellikle vücudun bir kablolu bileşeni olarak tanımlanmaktadır. Merkezi sinir sistemi farklı (MSS), periferik sinir sistemi (PNS) önemli tamir yeteneğine sahiptir, ama biz sadece bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamaya başladı. Bir model sistem olarak Zebra balığı kullanarak, in vivo görüntüleme ve genetik manipülasyon ile çift rejeneratif çalışmalara benzersiz bir fırsat var. Periferik sinir glia ve bağ doku tabakaları ile çevrili akson oluşmaktadır. Aksonlar perinöriyum adlı bir cep kılıf ile bir fasikül içine sarılmış da olan Schwann hücreleri, myelinating veya olmayan myelinating tarafından ensheathed edilir. Bir yaralanma sonrasında, yetişkin periferik sinir remo için muazzam bir kapasite varve aksonal enkaz ve yeniden innerve hedefleri zarar. PNS rejenerasyon tüm periferik glia rollerini araştırmak için, burada canlı transgenik zebrafish motor sinirleri axotomize ticari olarak satılan azot pompalı dye lazer kullanan bir akson transection tahlil açıklar. Biz daha fazla yaralı ve kontrol sinirlerin zaman atlamalı görüntüleme için bu deneyleri birkaç yöntemleri açıklar. Bu deneysel paradigma sadece glia sinir rejenerasyonu oyun değil, aynı zamanda sinir sistemi onarım yöneten moleküler mekanizmaların tanıtılması için bir platform olabilir rolünü değerlendirmek değil kullanılabilir.

Burada tarif edilen tahlil, in vivo olarak aksonal yaralanma gliyal hücreleri ve diğer sinir-ilişkili hücre popülasyonlarının tepkisini tayin etmek için kullanılabilir. Film 1 bu yöntem ve glial hücreleri çevreleyen yanıtı kullanılarak oluşturulan bir sinir hasarının bir örneği gösterilmektedir. Bu deney (nkx2.2a: megfp) Tg uygulandı; Tg (olig2: DsRed) Zebra balığı, perineurial glia EGFP ve motor nöronlar ifade sitozolik DsRed hedefleyen bir zar ifade edildiğ...

Watch this Scientific Journal Video about Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish at JoVE.com

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Görüntüleme.  University of Virginia. Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Video: Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optik Sinir transeksiyonu: Santral Sinir Sistemi Yetişkin Nöron Apoptoz Bir Model

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Nörobilim

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Methods Article

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme