המחברים מבקשים להודות מלינדה קל תנועה לקבלת סיוע טכני. אנחנו גם מכירים מקורות מימון העבר ובהווה: המכון הלאומי לסרטן (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), וונדי וויל מקרה הקרן לחקר הסרטן, מרקי קרן הסרטן, נס הרשת של הילדים וג&#39;ניפר ודיוויד דיקנס מלנומה קרן מחקר.

1. הכנת Forskolin למקומי מנהל מתמצית שורש גולמי של צמח Plectranthus barbatus (forskohlii Cohleus) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקולים לניסויים עכבריים בעקבות ההנחיות להתנהגות אתית בטיפול ושימוש בבעלי החיים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קנטאקי (פרוטוקול # 00768M2004). תמצית השורש מורכבת ב40% במשקל / נפח בבסיס סטנדרטי דרמטולוגיים של 70% אתנול, 30% פרופילן גליקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 200 גרם של תמצית שורש forskolin הגולמי ולהעביר אותו לכוס. כדי להפוך 500 מיליליטר של 40% (w / v) פתרון, resuspend 200 גרם של תמצית שורש forskolin הגולמי על ידי הוספה ביותר, אבל לא כל הנפח של הרכב (70% אתנול, פרופילן גליקול 30%) ולהביא הפתרון ל בערך 450 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך שעה בטמפרטורת חדר. הפתרון יהיה צמיג במידה מסוימת והן עשוי לחייב תסיסה ידנית כדי &quot;להרים&quot; את התמצית לפתרון לפניבר והמערבב הוא מסוגל להשתלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , אחרי שעה של ערבוב יוצק את התערובת לתוך גליל סיים ולהביא את הנפח 500 מיליליטר שימוש ברכב שבו נעשה שימוש כדי &quot;לשטוף את&quot; הכוס ששימשה לעורר את התרחיף (על מנת למקסם את ההתאוששות של forskolin מהכוס) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התרחיף ל50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר פוליפרופילן. צנטריפוגה (1,500 XG, טמפרטורת חדר, 15 דקות) באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה. בשלב זה, את החומר מסיס יהיה די דחוס, המאפשר את supernatant למזוג לכוס בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון דרך קרום אצטט תאית 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל חומר מסיס שיורי מהתמצית. אנו משתמשים במערכת בקבוק העליונה המיועדת לתרבית תאים, יחד עם השימוש בטרום מסננים שמגיעים עם היחידה למניעת סתימה מוקדמת של הקרום ממרכיבים מסיסים של תמצית השורש. בעת ביצוע כמויות גדולות של התמצית, לסנן בערך 100 מיליליטר בכל פעם, שינוי ההימור לסנן מראשWeen כל כרך הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת חדר, התמצית שומרת את פעילות ביולוגית לעד שנה. </li></ol> 2. הכנת C57Bl / 6 העכברים K14-SCF לטיפולים מקומיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת פרווה גב מבעלי החיים על ידי גז חשמלי. בקצרה להרדים את החיות עם isoflurane שהאיפה להקל על מריחה של פרווה הגבי עם מזמרה חשמלית לבוש עם ראש 0.25 מ&quot;מ כירורגית הכנה (פישר סיינטיפיק). רצוי להשתמש רק בסוג אחד של הרדמה (למשל קטמין / xylazine) כדי למזער את הסיכון של מנת יתר של חומר הרדמה. קאמרי משאיפת רוויה נושא בעיסוק סיכון בעת ​​שימוש מחוץ למכסה המנוע קטר ומספק כמויות לא ידועות של חומר הרדמה לבעלי חיים. באופן אידיאלי יש להשתמש במכשיר אדי דיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר שיער זיפי שייר, טיפול בבעלי החיים עם מקריח כימי. לנהל הרדמה לבעלי החיים עם הזרקת ה-IP של קטמין 40 מ&quot;ג / קילוגרם ו xylazine 4 מ&quot;ג / קילוגרם </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחיות מורדמים כראוי (כפי שנשפט על ידי קמצוץ הבוהן), להחיל כמות אצבע בגודל של קרם מקריח לעור גב טעון באמצעות אצבע עטויה בכפפה. למרוח את הקרם לתוך העור ל30-60 שניות או עד שניתן לראות בבירור שערות בקרם בזמן שהוא עבר בסביבה. השאר את הקרם על רק לכמות המינימלית של זמן הדרוש להסרת שיער כמו חשיפה ממושכת גורמת לצריבה כימית של העור, התמוטטות אפידרמיס ומוות מאובדן השלמות באפידרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את עור הגב עם פדה גזה ספוגה במים שוב ושוב עד שכל השמנת הוסרה. חיות יבשים באמצעות מגבות נייר רכות, ולאפשר להם להתאושש במיקום מבודד חם (למשל כלובים נקיים הונחו על כרית חימום). להשיר שער חיות אחד על אחד ולעקוב מקרוב לאורך כל ההליך. </li></ol> 3. מנהל אקטואלי של Forskolin או רכב בקרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להתייחס לבעלי חיים אחד בכל פעם. בקצרה להרדים עם שאיפהisoflurane ד על ידי הצבת העכבר על החלק העליון של מסנן אוויר חדיר ניילון מצויד טופס לפיו הושם מגבת נייר רווי isoflurane בצנצנת רווי isoflurane עפעפיים ברורה זכוכית במנדף. לחשוף את העכבר כדי isoflurane למספיק זמן כדי לדכא את תנועות שרירים מרצון, אבל כדי לשמור על נשימה ספונטנית (בדרך כלל 10-20 שניות). השארת בעלי החיים בisoflurane ארוכה מדי תגרום לדיכוי ומוות בדרכי הנשימה. עדיף לטעות בצד של &quot;הולך אור&quot; ויש להם מחדש לחשוף את העכבר לזמן קצר ליותר isoflurane ולא אל מעל לחשוף את בעלי החיים למוות הסמים וסיכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מבית הבליעה isoflurane ומניח על משטח ספסל סופג נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micropipette 1,000 μl לבוש עם טיפ פוליפרופילן חד פעמי, להכין 400 μl 40% תמצית forskolin הגולמי (בעלי חיים שליטה ברכב יקבלו 70% אתנול, 30% פרופילן גליקול לבד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התמצית עלאחורי של בעלי החיים על ידי מטפטף אותו על העור ולאחר מכן, תוך שימוש בצד של קצה פיפטה, מורח את התמצית על עור הגב עד שכל העור כבר מכוסה. אין צורך למחוק את העור לאחר יישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את העכבר לכלוב שלה, ולבחון בזהירות עד שהוא מתאושש מהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת שתופעות cAMP אינו פיגמנט לא צריכה לבלבל את ניסויי רגישות UV, להפסיק את כל הטיפולים אקטואליים 2 ימים לפני חשיפה לקרינת UV (אפקט הפיגמנט נמשך כמה ימים מעבר לטיפול מקומי שעבר). </li></ol> 4. צבע עור מדידה על ידי רפלקטיבית colorimetry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להרדים את העכבר עם isoflurane בשאיפה (ראה לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל קולורימטר Minolta ידי הנחת הראש הנייד על המשטח הלבן האחידים מסופק עם קולורימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ראש המדידה הנייד של סומק קולורימטר עם עור הגב של בעלי החיים על מנת להבטיח כי apertur העגול 1 סנטימטר 2דואר נלחץ לחלוטין על גבי העור. קח לפחות שלוש מדידות נפרדות באזורים שונים של עור גב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ציון * L ממוצע ± SD לכל בעלי חיים וכל קבוצת טיפול. colorimetry רפלקטיבית יכולה להיעשות בכל נקודה בניסוי. </li></ol> 5. קביעת UV הרגישות על ידי חישוב של &quot;מינימל erythematous המנה&quot; (MED) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בבעלי חיים, כי כבר מראש שטופלו גם עם רכב או forskolin כפי שתואר לעיל. הרדימי חיות עם זריקת intraperitoneal של תערובת סטנדרטית של קטמין ו xylazine (ראה לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את נייר דבק UV-אוטם לבדיקת MED. כדי ליצור חורים בקלטת, להשתמש בניקוב חורים כבד עם 1 סנטימטר 2 מעגלי מגזרת (2A דמויות ו-B). יש חורים בגודל מוגדר וסידור סימטרי בקלטת מאפשר זיהוי של שינויים בעור לאחר הקרנה. על כל חור בקלטת, להחיל חתיכה קטנה אבל בקלות להסרה<html> מקלטת שניתן להסיר בזמנים מוגדרים במהלך חשיפה לקרינת UV כדי לאפשר לממשל של מינוני UV שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שבעלי חיים הם מסוממים כראוי, הניחו את הקלטת על פני השטח הגבי. חומר הסיכה העין תמיד צריכה להיות מנוצל בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור UV המורכב משני Westinghouse F15T8UV-B מנורות עם תפוקת שיא של 313 ננומטר ומגוון של 280-370 ננומטר. לאפשר את המנורה לאזן לפלט UV קבוע כפי שהיא נמדדת על ידי פוטומטר UV עם חיישן UVB (בדרך כלל לוקח כמה דקות למנורות להתחמם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על קצב שידור UV כפי שהיא נמדדת על ידי פוטומטר UV, לחשב UV זמן חשיפה לכל מינון רצוי. לדוגמא, אמצעי פלט UVB של מנורתנו 2.4 mW / 2 סנטימטר. לכן, כדי לנהל 5 kJ / מ 2, העור היה צריך להיות חשוף ל208 שניות (שהוא 3 דקות ושניות 28) של קרינת UVB, כפי שמחושב שלהלן: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חיות המסוממות (כל אחד עם קלטת אוטמת במקום) הגחון פני השטח למטה כדי להבטיח חשיפה אפילו UV. כדי לנהל את המנות הנבחרות של קרינת UV, ברצף להסיר את הקלטות אוטמות קטנות המכסות את החורים לחשוף סנטימטר 1 2 אזורים של עור למינונים הנכונים של קרינה. לכן, שימוש בדוגמא לעיל, אם 40 kJ / m 2 הוא המנה הגדולה ביותר בניסוי, ולאחר מכן בעלי החיים יהיו תחת המנורה ל27 דקות ו47 כולל שניות והעור במצב 40 kJ / m 2 לא יהיו כל שמעליה קלטת כל הזמן. עם זאת, סרט שכיסה את מצב 5 kJ / m 2 יוסר כאשר יש 208 שניות שנותרו בחשיפה. תזמון של הסרת קלטת צריך להיעשות כך שכל מצב מסתיים בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חשיפה לקרינת UV, לקלף את הסרט מעור הגב בזהירות, נזהר שלא לקרוע את העור בתנועות פתאומיות או יתר על המידה, בכוח. הנח בעלי חיים במקום שקט חם כדי לאפשרהתאוששות מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על עכברים ל24-48 שעה לחפש אזורים דיסקרטיים של אריתמה (אדמומיות) או בצקת (נפיחות) מתאים לאתרים אנטומיים נחשפו למינון המסוים של קרינת UV. לתעד את ממצאי עור photographically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערך MED תואם את המינון המינימאלי של UV שגורם לדלקת כפי שהוגדר על ידי אודם ו / או בצקת של המעגל נחשף כולו של עור. שימו לב כי פיגמנטציה של העור יכולה לאתגר את הנחישות של MED, לעומת זאת, אודם ובצקת עדיין יכולים בדרך כלל להעריך במדויק, בין שאר הודות לצורה מוגדרת של הפתחים בקלטת במהלך חשיפה לקרינת UV. </li></ol> 6. ניתוח סטטיסטי לנתח נתונים בין קבוצות של עכברים בדרך ANOVA אחד עם מבחן Bonferroni הודעה (גרף Pad PRISM). ערכי p &lt;0.05 נחשבים משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שימוש במודל חיה של האדם בהיר עור, אנו מוצאים כי יישום מקומי של תמצית שורש הגולמי forskolin עשיר וחסונה מכהה את העור על ידי המרצת ייצור המלנין בעור. melanization עוריות תלוי בביטוי של גורם בתאי גזע בעור הבסיסי, כפי שקורה בעור אדם, אך לא בעור עכבר גנטי ללא שינוי. עור הגב של עכברים גנ...

השכיחות של מלנומה, הצורה הקטלנית ביותר של סרטן העור, גדלה באופן דרמטי בעשורים האחרונים בארצות הברית, במיוחד בקרב אנשים בהירי עור. ראיות מולקולריות ואפידמיולוגיים חזקות מפלילות קרינת UV כגורם סביבתי עיקרי סיבתי 2-5. חשיפת UV מוגברת בצורה של חשיפה לשמש ושימוש במיטת השיזוף עשויה להיות אחראי לחלק גדול מעלייה בשכיחות מלנומה 6-7. הסיכון למלנומה נראית קשור במיוחד עם כוויות שמש 8, במיוחד אלה בשלב מוקדם בחיי 9-10. סיכון לכוויות השמש קשורה לא רק למינון ועוצמה של חשיפה לקרינת UV, אלא גם על ידי גורמים תורשתיים המשפיעים על תגובה עורית לקרינת UV. פיגמנטציה של עור היא אחד הגורמים החשובים ביותר של רגישות UV, סיכון לכוויות שמש וסיכון לסרטן. מלנומה מתרחש בערך עשרים פעמים בתדירות גבוהה יותר באנשים בהירים עור בהשוואה לindividua כהה עורls 11-13. המלנין, הפיגמנט המיוצר על ידי מלנוציטים באפידרמיס, הוא הקובע העיקרי של גוון עור. המלנין מגיע בשני סוגים עיקריים: (1) אומלנין, פיגמנט חום / שחור כהה יעיל בספיגת האנרגיה של קרינת UV, ו (2) pheomelanin, אדמדם / פיגמנט בלונדינית פחות יעיל במניעת חדירה של פוטונים UV אל העור. צבע עור, רגישות UV והסיכון למלנומה נקבעים בעיקר על ידי תוכן אומלנין אפידרמיס 14-15. יותר אומלנין באפידרמיס, הפוטונים UV פחות יכול לחדור לתוך העור. בגלל הרמות נמוכות של אומלנין מולדים, אנשים בהירי עור הם הרבה יותר פגיע להשפעות אקוטיות וכרוניות של קרינת UV 16-18. פיגמנטציה של עור, סיכון למלנומה והיכולת &quot;שיזוף&quot; לאחר חשיפה לקרינת UV כל לתאם עם יכולת האיתות של הקולטן melanocortin 1 (MC1R), הטרנסממברני של מצמידים-S G שבעקולט urface על המלנוציטים 19-22. כאשר MC1R נקשר ליגנד מאותו המקור גבוהה זיקה, הורמון מגרה α-מלנוציט (α-MSH), יש הפעלה של cyclase adenylyl וייצור של cAMP השליח השני 23. התגובה הפיזיולוגית הנורמלית של העור לאחר חשיפה לקרינת UV כוללת ייצור אפידרמיס של α-MSH ידי קרטינוציטים 24-29. אנו ואחרים משערים כי מקורם בkeratinocyte α-MSH נקשר MC1R במלנוציטים באפידרמיס, ייזום ייצור במורד הזרם של השליח השני המחנה דרך הפעלה של cyclase adenylyl 30. רמות cAMP לשלוט בהיבטים רבים של בידול מלנוציט, כוללים מסלולי הישרדות, תיקון DNA וסינתזת הפיגמנט. איתות MC1R וcAMP בבירור לגרום לרמות אנזים פיגמנט וייצור אומלנין. כאשר איתות MC1R היא שלמה ורמות cAMP melanocytic הם חזקות, אומלנין מופק והעור מתכהה. עם זאת, אם איתות MC1R היא פגומה ורמות cAMP cytoplasmic יישארו נמוכות, pheomelanin מיוצר במקום 1. סינתזת eumelanin יכולה להיות מגורה פרמקולוגית על ידי סוכנים שמעלים את רמות cAMP 1,14,31-35. מאז חלבון MC1R הוא וסת עיקרי לסיכון למלנומה בבני אדם 36-46, אנו מעוניינים במנגנונים שבאמצעותם MC1R מגן מלנוציטים נגד היווצרות הסרטן ע&quot;י-UV. כבסיס למחקרים שלנו, אנחנו שנוצרנו מודל עכברי MC1R-גרסה מהונדס על רקע 1 טהור C57BL / 6 גנטי. במודל זה, נובע גורם תא (SCF) בא לידי ביטוי constitutively באפידרמיס הבסיסי ומלנוציטים interfollicular אפידרמיס נשמרים בעור לאורך כל חיים 47, בניגוד לעכברים שאינם מהונדסים שבו מלנוציטים בתרגום לדרמיס בזקיקי שיער. עם transgene K14-SCF משולב, האפידרמיס הופך פיגמנט עם מאפיין פיגמנטים המלנין המסוים של פיגמנטזן של בעלי החיים 1. עכברי K14-SCF על הרקע הגנטי C57BL / 6 עם איתות MC1R סוג בר שהעור שחור משחור מתאפיינים ברמות גבוהות מאוד של הפיגמנט אומלנין. באופן לא מפתיע, בעלי החיים אלה הם מאוד UV עמיד. לעומת זאת, יש לי C57BL / 6 בעלי החיים K14-SCF התאמה גנטית כי נמל MC1R פעיל מוטציה כמעט שלא אומלנין באפידרמיס. במקום זאת, יש בעלי החיים אלה &quot;הסיומת&quot; (ה MC1R / ה) גוון עור בהיר הנגרם על ידי בתצהיר של פיגמנט pheomelanin (איור 1 א) והם הרבה יותר רגיש לקרינה UV 48-49. תרכובות תרופתיות עם תכונות כימיות שמאפשרות חדירה לתוך העור הוכחו לגרום potently אומלנין בהארכה (ה MC1R / ה) מודל החיה K14-SCF ישירות על ידי המניפולציה רמות cAMP במלנוציטים באפידרמיס בעור. גברת ביטוי מלנין במודל זה כבר reported ידי הפעלת cyclase adenylyl 1, כמו גם phosphodiesterase 4 עיכוב 35. במאמר זה, אנחנו מדגימים את ההכנה והיישום מקומי של forskolin בהארכה (ה MC1R / ה) בעלי החיים K14-SCF איזה דגם האנושי UV רגיש בהירת עור. אנו מראים כי יישום פעמיים ביום של התרופה מקדם melanization המואץ, שמחשיך העור בשל תצהיר אפידרמיס של פיגמנט המלנין, וכי מלנין אפידרמיס המושרה מגן מפני כוויות שמש נגרם UV באמצעות מדידה של &quot;מינון המינימלי erythematous&quot; (MED) 48.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coleus Forskoli extract 20%</td>
			<td>Buckton Scott USA Inc. </td>
			<td>n/a</td>
			<td>Princeton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isothesia, Isoflurane , USP</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>NCD 11695-6776-1</td>
			<td>Dublin, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased Injection</td>
			<td>LA04612</td>
			<td>Shenandoah, Iowa, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl, USP</td>
			<td>Putney</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>St. Joseph, MO, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs.</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Adesco</td>
			<td>05751L</td>
			<td>Solon, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream, Nair</td>
			<td>Church &amp; Dwight</td>
			<td>JF-11 4381322</td>
			<td>Priceton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Germicidal Hg Lamp UV-B</td>
			<td>Westinghouse</td>
			<td>F15T8UV-B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Radiometer photometer</td>
			<td>International light</td>
			<td>1LT400A</td>
			<td>Peabody, MA,USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chromameter</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>CR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data Processor for 	Chromameter CR-400</td>
			<td>Konica Monilta</td>
			<td>DR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

pharmacologic induction of epidermal melanin and protection against sunburn in a humanized mouse model

הגינות של עור, רגישות UV וסיכון לסרטן העור בכל לתאם עם הפונקציה הפיזיולוגית של הקולטן melanocortin 1, חלבון איתות יחד-S G נמצא על פני השטח של מלנוציטים. MC1R מגרה cyclase adenylyl וייצור cAMP אשר, בתורו, מעלה מווסת את ייצור melanocytic של מלנין בעור. על מנת ללמוד את המנגנונים שבאמצעותם איתות MC1R מגנה על העור מפני פגיעת UV, מחקר זה מסתמך על מודל של עכברים עם &quot;עור אנושי&quot;, המבוסס על ביטוי אפידרמיס של גורם בתאי גזע (SCF). עכברים הטרנסגניים K14-SCF לשמור מלנוציטים ב יש לי האפידרמיס ולכן היכולת להפקיד המלנין באפידרמיס. במודל חיה זו, תוצאות מצב MC1R סוג בר בתצהיר חזק של פיגמנט אומלנין השחור ופנוטיפ מוגן UV. לעומת זאת, בעלי החיים K14-SCF עם תערוכה פגומה MC1R איתות יכולת פיגמנטציה אדומה / בלונדינית, אומלנין מעט מאוד בעור ופנוטיפ UV-רגיש. הנמקה כי בתצהיר אומלנין עלול להיות מוגבר על ידי סוכנים מקומיים המחקים איתות MC1R, מצאנו כי יישום ישיר של תמצית forskolin לעור של עכברים בהירי עור MC1R פגומים גרם לאינדוקצית אומלנין החזקה והגנת UV 1. כאן אנו מתארים את השיטה להכנה ויישום תמצית שורש טבעית המכיל forskolin לעכברים בהירי עור K14-SCF ומדווח על שיטה למדידת רגישות UV על ידי קביעת מינון erythematous מינימאלי (MED). שימוש במודל זה חי, זה אפשרי ללמוד איך האינדוקציה cAMP אפידרמיס וmelanization של העור משפיעים על תגובות פיזיולוגיות לחשיפה לקרינת UV.

C57BL / 6 עכברים שנוצרו על רקע eumelanotic, pheomelanotic או amelanotic שילוב transgene K14-SCF כ( איור 1 א) תאר. קבוצות של הארכה בהירת עור (ה MC1R / e, + / + Tyr) טופלו עכברים למריחה עם מינונים של פעמיים ביום או ברכב (70% אתנול, 30% פרופילן גליקול) או 40% תמצית שורש forskohlii Coleus הגולמי (...

Watch this Scientific Journal Video about Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model at JoVE.com

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

המלנין עוריות הוא מושרה על ידי יישום מקומי של forskolin במודל עכברי של אדם UV רגיש בהיר עור. מניפולציה תרופתי של רמות cAMP בעור ואפידרמיס המחשיכים מאוד להגן מפני דלקות בתיווך UV (כוויות שמש), כפי שנמדד על ידי מינון erythematous מינימום assay (MED).

אינדוקציה תרופתי של עוריות מלנין והגנה מפני כוויות שמש בדגם מואנש מאוס

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K Views.  University of Kentucky College of Medicine.  המלנין עוריות הוא מושרה על ידי יישום מקומי של forskolin במודל עכברי של אדם UV רגיש בהיר עור. מניפולציה תרופתי של רמות cAMP בעור ואפידרמיס המחשיכים מאוד להגן מפני דלקות בתיווך UV (כוויות שמש), כפי שנמדד על ידי מינון erythematous מינימום assay (MED). 

Video: Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

אימונותרפיה תת לשונית כחלופה ללהשרות הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה חריפים

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

ההקמה ואפיון של UTI וCAUTI במודל עכבר

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic differentiation and immune function of the genetically modified cells. The humanized Bone-marrow/Liver/Thymus (BLT) mouse model allows for full reconstitution of a human immune system in the periphery, which includes T cells, B cells, NK cells and monocytes. The human thymic implant also allows for thymic selection of T cells in autologous thymic tissue. In addition to the study of HIV infection, the model stands as a powerful tool to study differentiation, development and functionality of cells derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Here we outline the construction of humanized non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (SCID)-common gamma chain knockout (c&#947;-/-)-Bone-marrow/Liver/Thymus (NSG-BLT) mice with HSCs transduced with CD4 chimeric antigen receptor (CD4CAR) lentivirus vector. We show that the CD4CAR HSCs can successfully differentiate into multiple lineages and have anti-HIV activity. The goal of the study is to demonstrate the use of NSG-BLT mouse model as an in vivo model for engineered immunity against HIV. It is worth noting that, because lentivirus and human tissue is used, experiments and surgeries should be performed in a Class II biosafety cabinet in a Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+) facility.

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

אינדוקציה של טרשת עורקים מואצת בעכברים: מודל "פגיעת חוט"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

מיקרוסקופית Intravital ו אינדוקציה פקיק ב התנוך של עכבר חסר שיער

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של המוח מומים חלול במודל עכבר

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...