דווח על תכנות מחדש ישיר ליצירת מלנוציטים. עם זאת, גורמי שעתוק שונים משמשים במחקרים שונים. בפרוטוקול זה, אימתנו והפחתנו את מספר גורמי השעתוק עדיין עם יעילות תכנות מחדש גבוהה יותר.
הקמנו מערכת תכנות מחדש ישירה כדי ליצור מלנוציטים באמצעות שלושה גורמי שעתוק בלבד, Mitf, Sox10 ו-PAX3, ושינינו את מערכת התרבית כדי להפוך אותה ליציבה וחזקה יותר. כיצד לחדש מלנוציטים תפקודיים היא שאלה משמעותית שעשויה לעזור לטפל במגבלות הטיפול במחלות דפיגמנטציה כמו ויטיליגו. התכנות מחדש הנכון מספק פרוספקטיבי הטכניקה שלנו יש את המאפיינים של נוחות, יכולת פעולה חזקה ויציבות, אשר קל יותר לקדם ולחזור.
כדי להתחיל בייצור של נגיף הלנטי המרוכז, צלחת 1.5 כפול 10 עד 6 תאי HEK-293T לתוך צלחת של 60 מילימטר, ותרבית את התאים עם תווך נורמלי ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות של הדגירה, כאשר תאי HEK-293T הגיעו ל-80 עד 90% מפגש, החליפו את המדיום ב-3.5 מ"ל של DMEM, ואז דגירו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו-חמצני במשך שעתיים. לאחר הסרת התאים מהאינקובטור, החליפו את המדיום ב-DMEM המכיל 2%FBS, והוסיפו את תערובת קומפלקס הטרנספקציה שזה עתה הוכנה לתאים בצורה טיפתית.
מערבבים את התערובת הנוזלית בעדינות. בסיום שמונה שעות, לשנות את מדיום התא עם 3.5 מ"ל של בינוני נורמלי. לאסוף את supernatant וירוס ב 24 ו 48 שעות.
לאחר מכן, ערבבו את הווירוסים שנאספו בשתי נקודות זמן שונות וצנטריפוגות בתערובת ב-200 xg למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן מעבירים את הסופרנטנט שנאסף דרך מסנני 0.45 מיקרון כדי לאסוף את התסיס בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. מרכזים את הווירוס המסונן על ידי צנטריפוגה ב-6, 000 xg בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
לאחר שתסיים, ודא שכדור הנגיף נראה בתחתית הצינור החרוטי. שופכים את ה-supernatant לאט. להמסת גלולת הנגיף במדיום התקין עם נפח אחד על 100*של הווירוס.
השתמשו במיקרופיפט P1000 כדי לטפטף למעלה ולמטה בעדינות עד לקבלת תערובת וירוסים מרוכזת הומוגנית פי 100. מחלקים את הנגיף המרוכז לצינורות המיקרו-צנטריפוג' כדי לאחסן אותם בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. צלחת 1 כפול 10 עד 5 תאי HEK-293T לתוך באר אחת של צלחת שש באר.
תרבית תאים אלה עם המדיום הנורמלי ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, הוסף 0.1 עד 0.2 מיקרוליטרים של הנגיף המרוכז 100x פלואורסצנטי לכל באר. לאחר מכן נוספו ארבעה ננוגרמים לכל מיקרוליטרים של מגיב הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לכל באר.
כשמונה עד שתים עשרה שעות לאחר ההדבקה בנגיף, החליפו את המדיום במדיום הרגיל. בארבעים ושמונה שעות לאחר ההדבקה, שטפו את התבשיל עם 1 מ"ל של PBS סטרילי כדי להסיר את התאים המתים. לאחר מכן נסה את התאים באמצעות 250 מיקרוליטרים של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA לכל באר של צלחת בעלת שש בארות בטמפרטורת החדר.
צנטריפוגה על הלוח ב 200 xg במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את גלולת התא במ"ל אחד של PBS והוסיפו את תרחיף התא לצינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של חמישה מ"ל. לאחר מכן מניחים את הצינור לתוך ציטומטר הזרימה כדי לנתח את הדגימה.
לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים, ציפו באר אחת של צלחת תרבית תאים בת שש בארות עם תמיסת ג'לטין של 1 מ"ל של 0.1% בטמפרטורת החדר. לאחר 15 עד 30 דקות, כאשר הבאר מכוסה לחלוטין בג'לטין, שאפו לתמיסת ג'לטין 0.1%. לאחר מכן, צלחת 5 כפול 10 עד הפיברובלסטים העובריים של העכבר הרביעי, או MEFs, לתוך באר אחת של צלחת בעלת שש בארות המצופה בג'לטין של 0.1%, ותרבית את התאים למשך הלילה עם המדיום הרגיל ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו-חמצני.
לאחר 24 שעות, כאשר ה- MEFs הגיעו למפגש של 40 עד 50%, החלף את המדיום במדיום הרגיל. לאחר מכן, להמיס את הנגיף הקפוא והמרוכז על קרח. חשב את נפח הנגיף שיש להוסיף באמצעות משוואה ולאחר מכן הוסף את הווירוס המרוכז עבור ששת גורמי השעתוק לכל באר, בהתאם לנפח המחושב.
הוסף ארבעה מיקרוגרם לכל מ"ל של חומר הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לבאר. שקול את זה כמו יום אפס של זיהום lentivirus. ביום הראשון, לאחר 8 עד 12 שעות של הדבקה, החליפו את המדיום המכיל את הנגיף במדיום הנורמלי הטרי, תוך הוספת 0.5 מיקרוגרם לפורומיצין מ"ל כדי לסנן קווי תאים נגועים יציבים.
ביום השני, 48 שעות לאחר ההדבקה, החליפו את מדיום העל בהדרגה במדיום התכנות מחדש. שנה רבע מהנפח הבינוני הכולל לפני שתוסיף שלושה מיקרומולרים CHIR99021. מהיום השלישי ועד היום השביעי, בהתאם למצבם של התאים, משנים את המדיום על ידי החלפתו בהדרגה בשיעור גבוה יותר של מדיום תכנות מחדש כדי לעבור למדיום התכנות מחדש המלא תוך חמישה ימים.
לאחר מכן, נתקו את התאים עם 500 מיקרוליטרים של אנזים העיכול 0.05% טריפסין-EDTA למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. כאשר כשישים אחוז מהתאים צפו למעלה, עצרו את העיכול על ידי הוספת המדיום התקין, פי שניים מנפח אנזים העיכול. אספו את מתלי התא בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל לצנטריפוגה ב-200 xg במשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
הסר את ה-supernatant לפני השהייה מחדש של גלולת התא עם מדיום התכנות מחדש. בסיום, צלחת את התאים התלויים מחדש בצלחת סטרילית של 60 מילימטר. תרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו-חמצני.
לאחר ארבעים ושמונה שעות של זיהום lentivirus בתאי HEK-293T, ההצלחה של ייצור לנטיוירוס מרוכז הוערכה על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנציה של GFP או על ידי ציטומטריה של זרימה. נמצא כי הטיטר של הנגיף המרוכז היה גבוה ב-10 עד ה-TU/mL ה-8. במהלך התכנות מחדש הישיר של הפיברובלסטים, המורפולוגיה של התא השתנתה בהדרגה לסינפסה התארית ולגרעיני תאים מוגדלים.
עם זאת, התאים הזדקנו בהדרגה לאחר היום העשרים. הסרת גורמי השעתוק, Mitf, Pax3 או Sox10, הביאה להשתקת הביטוי של גנים מלנוציטיים, Tyr, Tyrp1 ו-Mlana, מה שמעיד על ההשפעה הגדולה ביותר על המרת פיברובלסטים למלנוציטים. לפיכך, הביטוי של גנים מלנוציטיים המושרים על ידי התכנות הישיר עם שלושה גורמי שעתוק היה גבוה יותר בהשוואה לשישה גורמי שעתוק.
כדי לזהות מלנוציטים המושרים על ידי MEF, או iMels, הביטוי של סמנים מלנוציטיים, TYRP1 ו- DCT זוהה באמצעות כתמים אימונופלואורסצנטיים. יתר על כן, שיטות ההכתמה הספציפיות למלנין כגון DOPA וצביעת מאסון-פונטנה הראו תוצאות חיוביות. תאי 293T צריכים להיות מופצים באופן שווה.
כמו כן, התוספת של תערובת טרנספקציה לתאים חייבת להיעשות בעדינות כדי למנוע מהתאים לצוף. הפרוטוקול יציב ומעשי וניתן להשתמש בו כדי לתכנת מחדש סוגים אחרים של תאים. הוא מצפה לספק התייחסות ואסטרטגיה לתכנות מחדש ישיר in vivo בהתחדשות מלנוציטים ברפואה עתידית.
