עבודה זו מומנה על ידי מענקי NSERC לBK וRG. המחברים גם רוצים להודות לKehe שיה וראסל חוסיין למומחיות מכתים Golgi-קוקס.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להחלטת המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי האוניברסיטה של ​​Lethbridge, ועדת טיפול בבעלי חיים. 1. רבייה ומישוש גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין חולדות הרות מהספקים בעלי חיים משותפים או להתרבות גורים בתוך הבית באמצעות נהלי רבייה מעבדה סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית כל בעלי החיים בחדר בטמפרטורה מבוקרת רבייה (21 מעלות צלזיוס), שמרה על אור 12:12 שעה: מחזור כהה ולספק גישה למזון ומים כהרצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר גורים נולדים חולדות נקבות בית, בנפרד עם צאצאיהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע לחץ נוסף הקשורים לטיפול מייד לאחר לידה, להתחיל גירוי חוש המישוש של גורים בP3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירוי חוש המישוש צריך להתבצע שלוש פעמים ביום (9:00 בבוקר, 1:00 PM, ו16:00) מP3-p21 ויש נגמלו גורים מאמותיהם ב p21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש בעיצוב המלטת צלב, מחצית מהגורים frאום כל המלטה תעבור גירוי חוש המישוש עם החצי השני שמש כקבוצת ביקורת. באופן אקראי להקצות מספרים שווים של גורי זכר ונקבה לכל קבוצה. כדי לבדל את הגורים עוברים גירוי ובקרות מישוש, לסמן קבוצה אחת של גורים עם סמן קבע על רגליהם האחוריות וזנב. סימון צריך להיות מיושם מחדש בכל יום אחר. </li></ol> מישוש גירוי <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסכרים מהכלוב בבית שלהם ולמקם אותם בכלוב זמני עם מזון ומים. שמור את הסכר וכלוב זמני בחדר רבייה / דיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל גורי חולדה כקבוצה לפני ישיבת הבוקר גירוי חוש המישוש (9:00). עבור כל פגישה, עכברוש תחבורת גורי כלובים בביתם לחדר בדיקות נפרד לגירוי חוש המישוש. מקם את הכלוב בבית על כרית חימום שמוגדרת 24 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלוח נוקשה לחלק את הכלוב בבית לשני חצאים. הנח גורי חולדה בגורי חצי ושליטה מישוש גירוי קבוצה אחת במחצית השנייה.להגדיר טיימר ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטלית כמו נוצה רכה, מצחצח את כל הגורים בקבוצת גירוי חוש המישוש באותו הזמן ל15 דקות רצופות. גורי החולדה הצעירים (~ P3-P12) ususally להצטופף ביחד ונראים נכנסים למעגל שינה עמוק ולכן קלים מאוד כדי לעורר את כל הגורים בבת אחת. כמו גיל הגורים, הם הופכים להיות יותר פעילים, עם כמה גורים הולכים וחוקרים במהלך הפגישה. הנסיין צריך לעבור ברציפות גורים נודדים לקבוצה כדי להבטיח כל גור מקבל גירוי שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פגישת 15 דקות הושלמה, להעביר את הגורים בחזרה לחדר הגידול ולהחזיר את האמא לכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה שלוש פעמים ביום ל19 ימים של גירוי חוש המישוש. לאחר פגישת גירוי חוש המישוש הסופית ב p21, צריכים להיגמל הגורים מאמותיהם. גורים אמורים להיות שוכנו בכלובים עם 5 או 6 חיות נגמלו אחרות של אותו המין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חולדות עוברות שום בדיקות נוספות, הם צריכים להישאר בלתימופרע, באור הרגיל: מחזור כהה עם גישה למזון ומי libitm מודעה (מלבד ניקוי כלוב וטיפול שוטפים) עד שהם מגיעים כ 100 ימים של גיל. אם עוברים מניפולציות ניסיוניות אחרות, יש להתייחס אל בעלי חיים או נבדקו בהתאם לפרוטוקולי מעבדה אלה. </li></ol> 2. להקריב וGolgi-קוקס מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על כ P100, לנהל ממנת יתר של נתרן pentobarbital באמצעות הזרקת ה-IP לחולדות וינקב intracardially עם כ 100 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח כאשר זלוף הוא מוחלט. הסר את המוח מהגולגולת, חיתוך עצב הראייה מתחת עם מאמץ לשמור על המוח הקטן ללא פגע; חוקרים יכולים לבחור לשמור או להסיר את נורות חוש הריח. הנח מוחות שחולצו בבקבוק Nalgene אטום עם 20 מיליליטר של תמיסת Golgi-קוקס 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את המוח בפתרון Golgi-קוקס ל14 ימים. לאחר 14 ימים, החלף את Golgi-Cפתרון שור עם תמיסת סוכרוז 30%. שמור את המוח בתמיסת סוכרוז ל2-5 ימים לפני חתך. </li></ol> הערה: אם אינו יכולים להיות מחולקים מוחות תוך 14 יום מהעברה לתמיסת סוכרוז, החוקר צריך להחליף את סוכרוז עם מלאי חדש של סוכרוז 30%. החוקר עשוי להחליף את סוכרוז כל שבועיים במשך 4 חודשים ללא השפעות שליליות על מכתים. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת סעיף המוח, המוח צריך להטשטש יבש וקבוע לבמה חתך עם דבק cyanocacrylic. כדי למנוע קריעה או חתך אחיד, החוקר חייב להיות זהיר ולוודא שכל המוח הוא מאובטח היטב לבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר vibratome חייב להיות מלא עם 6% תמיסת סוכרוז לרמה שמכסה את להב חתך. הגדר את הפרמטרים vibratome למהירות ומשרעת עד 5, (נקודת האמצע על שני הסולמות). פורסים את המוח ל200 מיקרומטר חלקים ולמקם את הסעיפים על 2% מייקר gelatinizedשקופיות היקף. הקפד לשמור את החלקים רטובים במהלך חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל החלקים של עניין כבר נאספו, לחץ על החלקים על גבי השקופיות על ידי הפעלה לחץ על השקופיות עם נייר bibulous לח. אחסן את השקופיות במעמד שקופיות בתא הלחות עד שהם מוכנים להיות מוכתמים. הם צריכים להישאר בתא הלחות במשך שעה לפחות 12, אך לא יותר מ -4 ימים. השקופיות צריכה להיות לח ולא צריך להיות מותרות להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הגדוד מכתים לפני תחילת תהליך הצביעה. תווית עשר מנות צביעת זכוכית (10.7 x 8.5 x 6.8 סנטימטר) ואת תהליך באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמוניום הידרוקסיד - 30 דקות (בחושך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קודאק תקן לקולנוע - 30 דקות (בחושך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלכוהול 50% - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלכוהול 70% - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלכוהול 95% - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% Alcohol - 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלכוהול 100% - 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון (כלורופורם 1/3, 1/3 HemoDe, 1/3 100% אלכוהול) - 15 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HemoDe - 15 דקות </li></ol></li></ol> * קסילן ניתן להשתמש בהחלפה של HemoDe. על מנת להבטיח איכות צביעה עקבית, יש להשתמש בפתרונות טריים עבור כל מדף שקופיות מעובד. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות emersion 15 דקות האחרונות בHemoDe, coverslip השקופיות עם Permount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר השקופיות לייבוש באוויר לפני שבודק במיקרוסקופ. </li></ol>

<ol>
	<li>Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+matters:+Brain,+behaviour,+and+the+epigenome+of+prenatally+stressed+rats.">Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats.</a> Neuroscience. 180, 105-110 (2011).</li><li>Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+during+development+alters+dendritic+morphology+in+the+nucleus+accumbens+and+prefrontal+cortex.">Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 216, 103-109 (2012).</li><li>Wiesel, T., Hubel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+visual+deprivation+on+morphology+and+physiology+of+cells+in+the+cat's+lateral+geniculate+body.">Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body.</a> Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).</li><li>Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+effects+of+nicotine+on+the+developing+brain.">The dynamic effects of nicotine on the developing brain.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 122, 125-139 (2009).</li><li>Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+alters+behaviour+and+neuroanatomical+organization+of+normal+rats.">Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats.</a> Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).</li><li>Schanberg, S., Field, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+deprivation+stress+and+supplemental+stimulation+in+the+rat+pup+and+preterm+neonate.">Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate.</a> Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).</li><li>Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care+during+infancy+regulates+the+development+of+neural+systems+mediating+the+expression+of+fearfulness+in+the+rat.">Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).</li><li>Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+tactile+stimulation+reverses+the+effect+of+neonatal+isolation+on+open-field+and+anxiety-like+behavior,+and+pain+sensitivity+in+male+and+female+adult+Sprague-Dawley+rats.">Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats.</a> Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).</li><li>Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+promotes+motor+recovery+following+cortical+injury+in+adult+rats.">Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats.</a> Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).</li><li>Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+and+maternal+separation+prevent+hippocampal+damage+in+rats+submitted+to+neonatal+hypoxia-ischemia.">Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia.</a> Brain Research. 1002, 94-99 (2004).</li><li>Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+after+frontal+or+parietal+cortical+injury+in+infant+rats+facilitates+functional+recovery+and+produces+synaptic+changes+in+adjacent+cortex.">Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex.</a> Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).</li><li>Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+attenuates+amphetamine+sensitization+and+structurally+reorganizes+prefrontal+cortex+and+striatum+in+a+sex-dependent+manner.">Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner.</a> Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).</li><li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+dell+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello.</a> Gaz Med Lomb. 33, 244-246 .</li><li>Glaser, E. M., van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thick+brain+sections+by+obverse-reverse+computer+microscopy:+Application+of+a+new,+high+clarity+Golgi-Nissl+stain.">Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).</li><li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain.">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).</li><li>Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care,+gene+expression,+and+the+transmission+of+individual+differences+in+stress+reactivity+across+generations.">Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).</li><li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse.">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים.

בשל הפלסטיות הגלויה של המוח המתפתח, חשוב שהפרוצדורות הכרוכות בחוויות מוקדמות נבדקות ביסודיות ונעשים ניסיונות לשלוט בכל המשתנים מתערבים. מסיבה זו, עיצוב המלטת צלב מועסק במהלך הליך גירוי חוש המישוש כדי להבטיח שגורים מקבלים חוויות דומות בכל התחומים האחרים של התפתחות. בנוסף, חשוב גם שגורים מרובים מהמלטות מרובות נבחרו לניתוח, כדי למנוע את האפשרות שתופעות נובעות מהטיה בגור או המלטה אחת. הוא האמין גירוי חוש המישוש כדי לחקות את ההתנהגות האימהית הטבעי, מלקק וטיפוח, אשר נחשב כמועיל להתפתחות צאצאים. למרות שהמחקר קודם הדגיש בשבוע הראשון לחייהם (P0-P7) להיות תקופה קריטית לליקוק וטיפוח 16, הגודל העצום של שינוי שזוהה הבא 18 ימים של taגירוי ctile עשוי לרמוז כי למרות שפעמים רגישות קיימות, חשיפה ארוכה יותר היא מעולה. כמו כן, חשוב לציין כי גורים מקבלים גירוי חוש המישוש בפרדיגמה ניסויית זו גם לחוות ללקק וטיפוח על ידי האמהות שלהם, ולכן גירוי חוש המישוש הוא בנוסף לגירוי נורמלי מנוהל על ידי האמא. לבסוף, צריך גם להיות מודע לשינויים באזור תלוי. למרות שגירוי חוש המישוש במהלך התפתחות גידול במורכבות דנדריטים בקליפת מוח הקדם חזיתית, זה לא מבטיח ששינויים מבניים מסוג זה יהיו ברורים בכל אזורי המוח. יתכן שהמורפולוגיה עצבית באזורי מוח אחרים, כגון קליפת המוח הקודקודית, תגיב באופן שונה לחלוטין לאותה החוויה. עם זאת, מאחר שהליך גירוי חוש המישוש מנוהל בקלות ואינו מהווה סיכון לצאצאים או סכרים, יש לו הפוטנציאל לשמש ככלי רב ערך למחקרים רבים שנועדו לשפר את הפיתוחאל תוצאות. עם כל כבוד לצביעת Golgi-קוקס של רקמת המוח, הצעדים הקריטיים להדמיה מוצלחת של תאים עצביים הם כדלקמן: 1) חייבת להיות זלוף נאות של המוח עם תמיסת מלח. זלוף לא נכון או לא מספיק של תוצאות רקמת המוח בחפצי כלי דם זה עושים את זה קשה לדמיין בעצם תאים עצביים במבוך של כלי דם, בעוד שמסבך את היכולת לצלם נוירונים צבעוניים גם. 2) מוח perfused צריך להיות מאוחסן בפתרון Golgi-קוקס ותמיסת סוכרוז בחושך. אחסון רקמת המוח בחושך מפחית את מכתים הרקע של הרקמה, שוב מגדיל את הסיכוי להמחשה בהצלחה תאים עצביים איכות. 3) רקמת המוח מאוחסנת בתמיסת סוכרוז הבאה אחסון 14 היום בפתרון Golgi-קוקס. כאשר הרקמה היא שקועה בפתרון סוכרוז 30% ל2-5 ימים, המוח הוא גמישים יותר המונע מתנפץ וקריעה של חלקים כאשרחיתוך. זה חשוב כדי למנוע מרקמת המוח שנותר בתמיסת סוכרוז לפרקי זמן מוגבר (אלא אם כן פתרון סוכרוז מוחלף ברציפות עם פתרון טרי), כי אחסון ממושך בסוכרוז מפחית את האיכות מכתים. 4) לבסוף, לאחר שקופיות כבר מוכתמות וכיסוי החליק, הם צריכים לתת מספיק זמן לייבוש לפני ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ. אם שקופיות אינן רשאים ישודרו כראוי יבש, הרקמה עלולה להכהות, הפחתת הדמיה מוצלחת של תאי עצב בקליפת המוח. שינויים יציבים בתפקוד פסיכולוגי ותגובות התנהגותיות המתרחשים בתגובה לחוויות הם האמינו להיות בהנחייתם של ארגון מחדש של מורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית 17. שינויים המבניים אלה מספקים משאבים למדידה לפלסטיות חוויה תלויה, השימוש בהליך מכתים אמין הוא חשוב. הליך מכתים Golgi-קוקס מבוסס vibratome זה מספק כתם אמיןing של ענפים דקים וקוצים הדנדריטים שלא יכול להיות ברור עם פרוטוקולים אחרים כגון celloidin-הטבעה. ייחודו של הליך Golgi-קוקס נובע מיכולתה כדי להכתים חלק קטן של אלמנטים עצביים (1-10%), המאפשר איתור של נוירונים בודדים למרחקים ארוכים בלבד. על אף העובדה שרק חלק קטן של הנוירונים ספוגים עם הכתם, תאים הניתנים לעין, לשמור על כל התכונות, כולל גוף תא, דנדריטים, קוצים הדנדריטים ואקסונים. יתר על כן, כאשר ההליך מכתים מתבצע בצורה נכונה, התאים המוכתמים להתבלט באופן ברור ומובהק על רקע שקוף, משום שמבנים בקליפת המוח אחרים יישארו ללא רבב ושקוף. בשל ההבנה ששינויים מתמשכים בתפקוד חיצוני חייבים להיות קשורים לפלסטיות של מערכת העצבים, כלומר היכולת של תאי עצב כדי לשנות את המבנה והקישוריות שלהם, ההליך מכתים Golgi-קוקס מספק לחוקריםטכניקה אמינה לחזות ולכמת פלסטיות זה.

אמנם יש טכניקות רבות דיווחו ומנוצלות לבחינת חוויות שליליות בשלב מוקדם הבשלת המוח, כגון מתח סביב הלידה 1,2, חסך חושי 3, ורעילויות תרופת 4, יש מעט מאוד מתודולוגיות המועסקות כדי לבחון את ההשפעות של חוויות חיוביות ב פרק זמן זה. מלבד העשרה סביבתית, גירוי חוש המישוש הוא אחד מכמה מוח שיפור טיפולים עם אפקטים הפגינו 5. גירוי חוש המישוש הוא שיטה של ​​גירוי חושי לעור המחקה את התנהגות החולדה האימהית, מלקק וטיפוח. הקבלה הכללית שלה כמניפולציה חיובית העולה ממחקרים המראים כי גירוי חוש המישוש השתפר הבשלה של פגים וחולדות שזה עתה נולדו 6. בנוסף, מחקר במעבדה מייני 7 הוכיח כי רמות גבוהות יותר של ליקוק וטיפוח אימהיים צמודות לתוצאות חיוביות בצאצאים. בשל tהשפעות חיוביות hese, גירוי חוש המישוש התפתחו במהירות לתוך אסטרטגיה מתקנת שמטרתה הפחתת חרדה 8, שיפור תוצאות הקשורים לפגיעה מוחית 9-11, והפחתת רגישות לסמים 12. ככזה, גירוי חוש המישוש הוא טכניקה רבת ערך לקידום חוויות מוקדמות חיוביות, עם יכולת מוכחת לארגון מחדש של מורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית של המוח המתפתח באופן דרמטי. על מנת לבחון ולכמת את השינויים במורפולוגיה עצבית, יש צורך לדמיין נוירונים בשלמותה. ההליך מכתים Golgi-קוקס הוא שינוי של הטכניקה של קמילו גולג&#39;י שפורסמה בסוף 1800s המספקת צביעה של מספר קטן של תאי עצב מלאים 13 בדידה. למרות ההליך מופיע להכתים נוירונים באקראי והשחזור מצוטט בכינויו פגם עיקרי, ההדמיה היתרי שיעור הספגה הקטנה של המרכיב העצבי כולה, כוללים לסה&quot;נגופי ll, דנדריטים, קוצים הדנדריטים, ואקסונים. באופן דומה, את הזמן הנדרש כדי להספיג מוח נתון עם פתרון Golgi גם צוטט כנפילה. עם זאת, בהתחשב בכך שפעם אחת הצביעה היא רקמה שלמה יכולה להישמר ללא הגבלת זמן, ואת הזמן בין טפטוף של המוח וההדמיה של הנוירונים במיקרוסקופ ניתן להשלים בתוך פחות מ21 ימים, תקופת הזמן היא לא בלתי סבירה. בנוסף, עם שינויים קלים בפרוטוקול, מכתים Golgi-קוקס ניתן להשתמש ביעילות כדי להספיג מוחם של מכרסמים מכל הגילאים. כמו שינויים ברמה המבנית נמצאו קשורים לשינויים מתמשכים לתפקוד ההתנהגותי ופסיכולוגי, את טכניקת צביעת Golgi-קוקס מספקת חוקרים עם כלי רב ערך כדי למדוד neuroplasticity.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dichromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercuric Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1561</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak Rapid Fix</td>
			<td>Vistek</td>
			<td>Kodak 146 4016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH-95 &amp; Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>No Cat Numbers</td>
			<td>All other Et-OH are dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffers- Soft Feather-Like dusters</td>
			<td>Safeway</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Can be found at most grocery stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemoDe</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>23410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Sp15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-365</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>062011-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining

כדי ליצור שינויים ארוך טווח בהתנהגות, חוויות חייבים להיות הפקת שינויים יציבים במורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה ראשונית חיובית שמחק אימהית ללקק וטיפוח בחולדה. חשיפת גורי חולדה לחוויה חיובית זה יכול להסתיים בקלות וביעילות על ידי שימוש בחומרים נגישים מאוד כגון מטלית משק בית. באמצעות עיצוב המלטה צולבת, גורים הם ליטפו אחד או שמאלה באין מפריע, במשך 15 דקות, שלוש פעמים ביום לאורך כל התקופה סביב הלידה. כדי למדוד את שינויי neuroplastic הקשורים לניסיון המוקדם החיובי הזה, מכתים Golgi-קוקס של רקמת המוח מנוצל. בשל העובדה שהספגת Golgi-קוקס מכתימה מספר בדיד של נוירונים ולא כל התאים, מכתים של המוח המכרסם עם פתרון Golgi-קוקס מאפשר ההדמיה של אלמנטים עצביים כולה, ובכלל זה גוף התא, דנדריטים, אקסונים, ו קוצים הדנדריטים. I ההליך מכתיםים שבוצע על פני כמה ימים ודורש שהחוקר לשים לב לפרטים. עם זאת, ברגע שמכתים הושלם, כולו המוח כבר ספוג ויכול להישמר לזמן בלתי מוגבל לניתוח מתמשך. לכן, מכתים Golgi-קוקס הוא משאב יקר ערך לחקר פלסטיות חוויה תלויה.

כאשר הליך מכתים זה כבר אחרי כראוי, מכתים עקבי ואחיד של דנדריטים וקוצים שנוצר. ראה איור 1 עבור ייצוג של מכתים עצבי Golgi-קוקס. הליך זה מייצר כתמים כי ניתן להשוות להדמיה חדשה שפותחה בשיטות מבחנה ורשאית להתיר השדות דנדריטים שהטבעת הרקמה הבאה רציף. הטכניקה מבוססת vibratome עבור מכתים Golgi-קוקס כבר מצאה לייצר כתמים נרחבים יותר של סניפי מסוף ונוירונים פירמידליים, מאשר צביעה עם או מוטבע celloidin ורקמות מחולקים cryostat, 15. יתר על כן, מכיוון ששיטה זו של מכתים מכניסה את המוח כולו, ניתן לנתח את כל החלקים או מייד או בעתיד. כמיקום של שינוי מורפולוגי הוא שזה לא תמיד מובן מאליו בעת יצירת השערה מקורית, תהליך זה מאפשר הבדיקה של אזורי מוח נוספיםד מונע סילוק של רקמה שעשויה להיות שימושיים בעתיד. שיטת צביעה זו יכולה לשמש עבור מכתים אמין של כל מוחות בני חולדה (גיל P0-ישן). עם זאת, כאשר מכתימים את המוחות צעירים (&lt;1 גרם), המוח צריך להישאר רק בפתרון Golgi-קוקס במשך 6 ימים, ולא 14 הימים מומלצים למוחות בוגרים, כל ההליכים האחרים נשארים קבועים. הקושי העיקרי שעשויות להיות נתקלים במהלך תהליך צביעת Golgi-קוקס הזה הוא חוסר היכולת לייצר צביעה באיכות גבוהה של אזורים במוח מרכזיים, ובם התלמוס. כמו כל המוח הוא ספוג באותו הזמן, אזורים מרכזיים עשויים שלא לקבל ריכוזים אידיאליים של כתם. למרות ממצא זה, טכניקת Golgi-קוקס מייצרת כתמים חריגים של אזורים קורטיקליים כגון ההיפוקמפוס וסטריאטום. מגבלה סופית של ההליך נובעת מהסרת חלקית של דם מהמוח במהלך תהליך זלוף. דם עשוי לייצר חפצים ברקמת המוחזה עושה את זה קשה לצלם ולאתר את תאי העצב. טכניקות צביעת Golgi-קוקס מספקות מדד אמין של מורפולוגיה הדנדריטים וneuroanatomy כי הוא שימושי עבור מגוון רחב של מחקרים שנועדו לבחון את השינויים ברמה העצבית. כאשר בוחנים מבנה עצבי בקליפת מוח הקדם חזיתית בעקבות גירוי מישוש בתקופה המוקדמת שלאחר הלידה, מכתים Golgi-קוקס חשף עלייה דרמטית במורכבות הדנדריטים. שינויים אנטומיים הקשורים לגירוי חוש המישוש המוקדם ניתן להדגים באופן חזותי על ידי השוואת צפיפות עמוד השדרה של נוירונים פירמידליים מעכברוש שליטה לפירמידת נוירונים מעכברים שעברו גירוי חוש המישוש (ראה איור 1). כמו כן, ניתן לחשב פרמטרים כגון arborization הדנדריטים, אורך הדנדריטים, וצפיפות עמוד השדרה וסטטיסטית נותחו כדי להפיק נתונים רציפים הניתנים להשוואה על פני בעלי חיים. כדי להפיק תוצאות אמינות, ניתוח צריכה להתבצע בבוקרinimum של שלושה בעלי חיים לקבוצת טיפול וכחמישה נוירונים לאונה צריך להיות נבחר באופן אקראי לכל אזור במוח מתחת לניתוח. איור 2 מדגים את המורכבות דנדריטים (קוצים / מיקרומטר x מיקרומטר של דנדריט) של חיות שקיבלו גירוי ובעלי חיים שלא מישוש . בשני שדות הפסגה וbasilar של הנוירונים ניתחו מmPFC (CG3), גירוי חוש המישוש הביא לריבוי של פרמטרים עצביים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> איור 1. תמונת א &#39;הנציג של Golgi-קוקס מוכתם נוירון פירמידלי מהשכבה III של אזור CG3 בחולדה שקיבלה גירוי חוש המישוש במהלך פיתוח. ב נציג מוגדל תצלום (1,000 X) של קוצים הדנדריטים על דנדריטים הטרמינל בשדה basilar של CG3 ; התמונה בהירה יותר בצד השמאל היא לעכברים בקבוצת הביקורת ותמונה הכהה יותר על ריght הוא מעכברים שקיבלו גירוי חוש המישוש. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג להמחשה המורכבות הממוצעת הפסגה וbasilar דנדריטים (קוצים / מיקרומטר x מיקרומטר) לנוירונים באזור CG3 מחולדות מבוגרים שגם קיבלו גירוי חוש המישוש במהלך פיתוח או לא (* p &lt;0.01).

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining at JoVE

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

מאמר זה מתאר את הנהלים לגירוי חוש המישוש של גורי חולדה ומכתים Golgi-קוקס הבא של מורפולוגיה עצבית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה חיובית כי הוא מנוהל בתקופה סביב הלידה על ידי מלטף את הגורים עם מטלית משק בית. מכתים Golgi-קוקס הוא הליך אמין המאפשר ההדמיה של כל הנוירונים.

לדמיין את ההשפעות של ניסיון מוקדם חיובי, מישוש גירוי, על דנדריטים מורפולוגיה וSynaptic קישוריות עם Golgi-קוקס מכתים

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

visualizing-effects-positive-early-experience-tactile-stimulation-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K Views.  University of Lethbridge.  מאמר זה מתאר את הנהלים לגירוי חוש המישוש של גורי חולדה ומכתים Golgi-קוקס הבא של מורפולוגיה עצבית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה חיובית כי הוא מנוהל בתקופה סביב הלידה על ידי מלטף את הגורים עם מטלית משק בית. מכתים Golgi-קוקס הוא הליך אמין המאפשר ההדמי?...

Video: Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

המדינה תלות השפעות על TMS: מבט על התנהגות Phosphene מניע

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

ההשפעות של גירוי זרם חילופין טראנס על קליפת המוח המוטורית הראשי על-ידי גישה משולבת מקוון עם גירוי מגנטי טראנס

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &amp;#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...