שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה

הפרוטוקול חוקר נוירונים גרגיריים צרבלריים לאורך שלבי התפתחות שונים על מנת לדמיין צמיחה מורפולוגית מרכזית. יתרונות הטכניקה כוללים מיקוד ספציפי לתא, ביטוי מהיר של מבנים נגועים, ותיוג דליל של תאים המאפשר לחקור השפעות אוטונומיות של תאים. התחל בחיתוך קטע של 11.2 מ"מ מקצה פיפטת העמסה והנח את החלק החתוך מעל קצה מזרק המילטון כמרווח כדי להגביל את עומק ההזרקה ל -1.5 מילימטר.

אבטחו את הספייסר על קצה המזרק בעזרת דבק או פרפילם. כדי לחקור את המורפולוגיה של CGNs מחושמלים בודדים מחלקי מוח של גור הניסוי, צלמו תמונות מחסנית Z במהירות של 0.5 מיקרומטר לערימה במיקרוסקופ קונפוקלי. תמונה תא אחד לכל חלון תמונה כדי לאפשר ניתוח תמונה קל ושחזור תלת-ממדי.

נתח את אורך הנוירוט ואת היווצרות הטופר הדנדריטי באופן עיוור באמצעות נותב נוריט פשוט. העלה תמונות Z-stack חד-ערוציות של CGNs מחושמלים לפיג'י ולחץ על תוספים"סגמנטציה" ו- Simple Neurite Tracer"בחר צור מציג תלת מימד חדש"מהתפריט הנפתח. גלול לבסיס של דנדריט המתחבר לסומה התא והתחל נתיב על ידי לחיצה על הצומת.

עקוב ידנית אחר הנתיב על-ידי לחיצה בין המקטעים שבהם אות מילוי התא בהיר ביותר והקשה על Y כדי לשמור על המעקב. עקבו עד סוף הדנדריט ואשרו את הנתיב על ידי לחיצה על F.לחלופין, עקבו עד לבסיס הטופר. לאחר מכן, עקוב אחר הטופר מבסיס המבנה עד סוף הנוריץ הארוך ביותר.

עקבו אחר ענפים משניים ושלישוניים על-ידי לחיצה ממושכת על Control בחלונות או ALT ב-macOS ולחיצה על הנתיב. אשר את הנתיב על-ידי הקשה על F.שים לב שהמדידות עבור העקבות גלויות בחלון נפרד. הוסף את כל הגדלים של ענפי הטופר כדי לקבל את האורך הכולל של כל טופר.

בניתוח המייצג, תמונות הקרנה של CGNs מחושמלים בין 3 ל -14 ימים לאחר ההזרקה הראו ירידה הדרגתית במספר הדנדריטים. CGNs עברו שלב של צמיחה דנדריטית ואחריה עידון מ 3 DPI ל 7 DPI שהביא לגיזום של יותר מ -50% של דנדריטים עודפים. אירוע זה עולה בקנה אחד עם התארכות הדרגתית של הסוכות הנותרות בהיווצרות מבנים דמויי טפרים בקצה כל דנדריט, דבר המצביע על כך שתהליכים התפתחותיים אלה מתרחשים במקביל.

על ידי 7 DPI, טפרים נמצאו על בערך 75% של דנדריטים. כל CGN שכותרתו שוחזר ב-NMRS כדי לכמת את שטח הפנים והנפח הסומטו-דנדריטי הכולל. לא נצפה הבדל משמעותי בגודל ה-CGN לאורך הפיתוח.

למרות שב-7 DPI, CGNs הציגו ירידה משמעותית של 20% בנפח בהשוואה ל-3, 5 ו-10 DPI. הדבר החשוב ביותר בהליך הוא לאתר במדויק את המוח הקטן לפני ההזרקה. השיטה יכולה להיות מותאמת למניפולציה גנטית של גנים in vivo כדי לחקור את תפקידם בהתפתחות נוירונים גרגיריים על ידי טרנספקציה של shRNAs, siRNAs, או Cre Recombinase.