This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer&#8217;s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.

הערה: ניסויים נערכו בהתאם לסטנדרטים האתיים אושרו על ידי הוועדה למחקר בבעלי חיים במערכת הבריאות לענייני יוצאי צבא פאלו אלטו. 1. Golgi-קוקס מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוץ מוח וצביעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 ב, עמוק להרדים עכברים עם 100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine לפני הרדמת החסד באמצעות exsanguination. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את calvarium ולנתח את המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להסיר את העור בחלק העליון של הגולגולת, הצבת מספריים מעוגלים בחלקו העליון של המוח הקטן ובעדינות לחתוך המקביל calvarium למענית המרכזית עם הקצה של המספריים הצביע החוצה, נע בכיוון לכיוון הנורה חוש הריח. חזור על תהליך זה בשני הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pincet כירורגית להרים calvarium תוך הפיכתו לכיוון נורות חוש הריח ולשבור אותו. ואז, להפוך את הגולגולת הפוכה ולהשתמש איסוף לחתוך האופטיעצבים ולשחרר את המוח. לבסוף, השתמש בבחירה להפריד את המוח מחוט השדרה ברמה של מגנום foramen. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לטבול את המוח ב- 15 מיליליטר של תמיסה מסחרית-זמינה, חי Golgi-קוקס. אחסן את המוח בפתרון Golgi ב, בקבוק זכוכית 20 מיליליטר כתרים בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , ביום 2 לשפוך לאט את הפתרון ולהחליף אותו עם 15 מיליליטר פתרון Golgi-קוקס טרי. לסכם את הבקבוק המכיל את המוח ולהשאיר ללא הפרעה לעוד 9 ימים בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך וembedment <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ה -11, מקום המוח בתמיסת סוכרוז 30%, שהוכן DDH 2 O להתייבשות. לשנות את הפתרון עם סוכרוז 30% מוכנים טרי לאחר 12 שעות. דגירה המוח בתמיסת סוכרוז 30% במשך 3 ימים על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ה -14, למלא את המאגר של vibratome עם תמיסת סוכרוז 30% עד שהלהב מכוסה. קבע את המהירות 1 מ &#39;ים עם משרעת של 0.95 מ&quot;מ מ &#39;/. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחוק את המוח עם Kimwipe כדי להסיר לחות עודפת ולהסיר את המוח הקטן באמצעות סכין גילוח לחתוך coronally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף לעלות את המוח כולו על גבי פלטפורמת vibratome באמצעות דבק מגע ולאפשר לו להגדיר במשך 2-4 דקות. הכנס את הפלטפורמה עם המוח דבק לתוך המאגר ולהתאים את הלהב לחלק העליון של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות vibratome, פורס את המוח ל-150 מיקרומטר חלקים עבים בטמפרטורת חדר, לזכור להחליף את הלהב לאחר כל מוח 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את החלקים מהמאגר בעזרת מברשת היטה קטנה ולטבול אותם לתוך צלחת פטרי המכילה ג&#39;לטין 0.3% תוצרת DDH 2 O. בעוד הסעיפים יישארו בצלחת פטרי, להוסיף 0.5 מיליליטר של ג&#39;לטין 0.3% בכל שקופית ולהשתמש במברשת כדי להפיץ ומעיל Superfrost + השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להרים את החלקים שקועים מצלחת פטרי ומניח אותם על גבי שקופיות gelatinized. כוון את החלקים במוח על ידילגעת בם רק על צדם ולא על ראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כעשר דקות, מעיל הקטעים עם סוכרוז 30% לפני הרקמה מתייבשת לגמרי. לאחר מכן אוויר יבש השקופיות מוכנות במקום חשוך במעמד שקופית במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון 10x מסחרי-זמין לפיתוח 1x באמצעות DDH 2 O. לטבול את השקופיות בפיתוח פתרון ל7-10 דקות. יש לשטוף את השקופיות 3 פעמים בDDH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ופתרונות אתנול% 95 באמצעות DDH 2 O. מזוקק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את השקופיות בפתרונות אתנול גבוהים יותר ויותר במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את השקופיות ב 100% פתרון אתנול 3 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את השקופיות ב 100% קסילן 3 פעמים ברציפות במשך 5 דקות כל אחד, שמירה על הסעיפים בפתרון הסופי עד שהם החליקו-כיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמות נדיבה של DPX (phthalate Di-n-בוטיל בקסילן) הרכבה בינונית (ab1-1.5 מתוך מיליליטר) על כל שקופית באמצעות pipet העברת פלסטיק. זהירות במקום coverslips כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי האוויר יבש החליק-מוח סעיפים אופקי במשך 3 ימים. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים (ראה שלב 1.1.1) בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זלוף לב עם paraformaldehyde 4% מוכנים טרי שנעשה בחיץ פוספט 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח (ראה 1.1.2) וחנות ב -45 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב 4 ° C למשך לילה על שייקר נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוח לפתרון סוכרוז 30% ולחכות להתייבשות מלאה במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את המוח מסוכרוז ומניח אותם ישירות על בלוקי נחושת מונחים על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הבלוק עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר) ולסמן את הכיוון של המוח באמצעות הנורה חוש הריח כנקודת ציון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות cryostat, לחתוך 70 סעיפים מיקרון עבים ב -20 ºC ולמקם אותםבפתרון cryoprotectant (25% אתילן גליקול, גליצרול 25%, ב0.05 חיץ פוספט M נתרן, pH 7.4) ולשמור ב -20 ° C עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון של 50% מתנול cryoprotectant ו -50%. לפתרון זה מוסיף 0.5% מי חמצן (כרך / כרך). סעיפי דגירה צף במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטעים חמים ב -37 ºC בTBS (נאגר מלוח טריס) במשך 30-40 דקות על ידי הצבת אותם בתנור היסטולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקטעים עם טריטון 0.3% ו -3% בסרום סוס רגיל במשך 45 דקות בטמפרטורת חדר לפני immunostaining. דגירה הסעיפים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב 3 מיליליטר פתרון של נוגדן DCX בדילול 1: 500 בTBS עם טריטון 0.3% ו -1% בסרום סוס רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לשטוף את הסעיפים 3 פעמים רצופות בTBS (10 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה עם אנטי-עז סוס biotinylated (1: 200 בTBS) לשתי שעות בטמפרטורת חדר. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים רצופות בTBS (10 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה tמכפלת עם ABC לייט (1: 1000) תמורת 1.5 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של H 30% 2 O 2 לטבליה אחת של 10 מ&quot;ג של DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) פתרון המומס ב 15 מיליליטר של 1 M טריס- HCl (pH 7.6). דגירה הסעיפים מייד בפתרון זה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את התגובה על ידי שטיפתם עם כפות קרות כקרח שלוש פעמים ואחרי שטיפה אחת בTBS בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש חלקים באמצעות סדרה של פתרונות אתנול (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 דקות כל אחד), ברורה בקסילן, ואז לכסות להחליק באמצעות DPX כמו בשלב 1.3. </li></ol> 3. ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ייבוש של החלקים שלמים, להסיר DPX העודף על גבי השקופיות עם להב חד, ומניח אותם על הבמה הסריקה של מיקרוסקופ. המערכת מורכבת של מיקרוסקופ מצויד בשלב סריקה, ג&#39;ויסטיק, ומצלמה 12-bit צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התכנית. פתיחת קובץ נתונים חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקוםנקודת התייחסות על המסך על ידי לחיצה עם סמן העכבר בכל מקום. זה יהיה להפעיל את כל הסמלים מהלוח הכלי של חלון תכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הסמל &quot;ג&#39;ויסטיק חינם&quot; בסרגל הכלים ולאחר מכן להשתמש בג&#39;ויסטיק כדי לאתר את gyrus המשונן של ההיפוקמפוס בסעיף הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;כלים&quot; של חלון התכנית, בחר &quot;מנהל מדור סידורי&quot;. לחץ על הסמל &quot;סעיף חדש&quot; בפינה השמאלית התחתונה של החלון. הפעולה זו תפתח את החלון &quot;הגדרת סעיף סידורי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את חלון הגדרת סעיף הסידורי ולאחר מכן להזין את המספר הכולל של קטעים המכילים אזורים בהיפוקמפוס. בחר את מרווח ההערכה. הזן את עובי חתך סעיף (70 מיקרומטר לDCX ו -150 מיקרומטר לחלקים צבעוניים Golgi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל התחקות אזור gyrus המשונן על ידי לחיצה על הסמל &quot;Freehand Contour הציור&quot; בסרגל הכלים. להתוות את שכבת תאים הגרעינית משוננת. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;100X&quot; מתפריט &quot;הגדלה&quot;. להוסיף טיפה של שמן טבילה בסעיף ולעבור למטרת 100X. אתר את הגופים המשונן תא גרגיר ודנדריטים תחת מטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בנוירון שנבחר ולחץ על הסמל &quot;Neuron Tracing&quot; בסרגל הכלים. עקוב אחר ההיקף של גוף תא גרגיר המשונן. בסיום מעקב, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור &quot;תא בגוף סיום&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מעקב דנדריטים ידני בx, y, z וכיוונים ועיקבו אחרי כל ענף באמצעות כפתור הג&#39;ויסטיק וz-מוטורי. בצומת הסתעפות או trifurcation, בחר את האפשרות המתאימה מהתפריט הנפתח על הלחצן ימני של העכבר. עקוב אחר כל אחד מהענפים הנובעים מבלוטות אלה. בסופו של כל סניף קליק ימני ובחר &quot;סיום&quot; מהתפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסמלי מקש החץ בחלון התוכנה יבחר באופן אקראי תא אחר גרגיר המשונן ובצע את אותו הנוהל כמו described בשלב 3.9-3.10. שמור את כל המעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת מעקב העצבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ נתוני NRX הראשון מהעכבר הראשון של קבוצת הניסוי. צרף את קובץ NRX של העכבר השני של קבוצת הניסוי. המשך עד שכל קבצי NRX מקבוצה זו יתווספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת לשונית ניתוח, בחר &quot;מאוורר ב- תרשים&quot;. פעולה זו פותחת את החלון ב- ניתוח המאוורר. בדוק &quot;דנדריטים&quot; סימן ולחץ על תצוגה, המתארת ​​את האורכים ודפוסי הסתעפות של הדנדריטים עבור קבוצה זו של עכברים (איור 1). </li></ol> 4. EDFI הערה: שיטה זו מאפשרת למשתמש להקליט במהירות מספר רב של תמונות דרך Z- הציר של כל שדה וליצור תמונת 2D המכילה את כל הפיקסלים ממוקדים לאורך ציר z. התוצאה תהיה תמונה מורכבת המכילה את כל הפיקסלים ממוקדים מתמונות שנאספו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המיקרוסקופ למצלמת דיגיטליתעידן. מניחים את החלקים הראשונים על הבמה הסריקה המחוברת למיקרוסקופ ולאחר מכן לעבור למטרת 10X. הזז את הבמה לאזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל תכנית לכידת וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור ההקלטה. ברגע שכפתור ההקלטה נלחץ, השתמש בכפתור מאקרו הפוקוס כדי לעבור מהחלק העליון לחלק התחתון של הסעיף עבור הסכום כולל של 4 שניות. שמור את קובץ וידאו וכתוצאה מכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה חופשית ImageJ להמיר קבצי וידאו מסוג AVI לפורמט דחוס על ידי פתיחת הקובץ ולשמור אותם בפורמט קובץ דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תכנית ניתוח תמונה ולפתוח את קובץ AVI. עבור לתפריט &quot;תהליך&quot; ולחץ על &quot;עומק שדה מורחב&quot;. בחר את קובץ וידאו המתאים. באפשרויות &quot;פלט&quot;, בחר &quot;צור תמונה הטובה ביותר-פוקוס Composite&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באפשרויות &quot;פוקוס ניתוח&quot;, בחר &quot;מנורמלת תאורה&quot; ואפשרויות &quot;ניגודיות המקומית מקס&quot;. לאחר מכן, בחר &quot;Creאכל &quot;. התמונה המתקבלת מייצגת את כל הפיקסלים ממוקדים לאורך ציר z (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונה וכתוצאה מכך. </li></ol> 5. יצירת תמונות ברזולוציה מאוד גבוהות הערה: שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור באופן אוטומטי בהגדלה נמוכה ומאוד תמונות ברזולוציה גבוהה מתמונות ברזולוציה גבוהה בהגדלה גבוהה באופנת automatized. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החלקים הראשונים על הבמה הסריקה המחוברת למיקרוסקופ. מיקרוסקופ מחובר למצלמה דיגיטלית. הזז את הבמה לאזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תכנית רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במטרת 10X ולרכוש ולשמור ברזולוציה גבוהה (4076 x 3116) תמונות מהאזור של עניין ולוודא שיש לפחות 10% חפיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה לרוץ Composite עורך לתפור תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל תפריט קובץ, ולחץ על &quot;ניו פנורמה&quot;. בחר את התיקייה שבה התמונות הן stכבדתי. בחר את התמונות ששייכים לאותו האזור ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;יצוא לדיסק&quot; ולשמור את התמונה. תמונה זו מייצגת תמונה ברזולוציה גבוהה מאוד של תחומי עניין של שיכול לשמש לניתוח ו / או הפגנה (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synapse:+center+stage+for+many+brain+diseases.">The synapse: center stage for many brain diseases.</a> The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).</li><li>Sheng, M., Sabatini, B. L., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+and+Alzheimer&#8217;s+disease.">Synapses and Alzheimer&#8217;s disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777 (2012).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li><li>Huttenlocher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+development+in+neocortex+of+children+with+mental+defect+and+infantile+spasms.">Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms.</a> Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).</li><li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+origin+of+the+pericellular+baskets+of+the+pyramidal+cells+of+the+human+motor+cortex:+a+Golgi+study.">Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study.</a> Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).</li><li>Dang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formoterol,+a+long-acting+&#946;2+adrenergic+agonist,+improves+cognitive+function+and+promotes+dendritic+complexity+in+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Formoterol, a long-acting &#946;2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome.</a> Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).</li><li>Dobrovi&#263;, B., Curi&#263;, G., Petanjek, Z., Heffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+morphology+and+spine+density+is+not+altered+in+motor+cortex+and+dentate+granular+cells+in+mice+lacking+the+ganglioside+biosynthetic+gene+B4galnt1+A+quantitative+Golgi+cox+study.">Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study.</a> Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).</li><li>Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+doublecortin+gene+family+and+disorders+of+neuronal+structure.">The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure.</a> Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).</li><li>Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Est&#233;vez, V., Vicario-Abej&#243;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+olfactory+bulb+neurogenesis.">Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis.</a> Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).</li><li>Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+visualization+of+notch+signaling+in+mammalian+neurogenesis.">Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).</li><li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Golgi-Cox+method.">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li><li>Juraska, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+developmental+plasticity+in+the+visual+cortex+and+hippocampal+dentate+gyrus.">Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).</li><li>Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+traumatic+brain+injury+causes+acute+dendritic+and+synaptic+degeneration+in+the+hippocampal+dentate+gyrus.">Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (9), e24566 (2011).</li><li>Zhang, L., Hern&#225;ndez, V. S., Estrada, F. S., Luj&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+CA+field+neurogenesis+after+pilocarpine+insult:+The+hippocampal+fissure+as+a+neurogenic+niche.">Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche.</a> J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).</li><li>Merz, K., Lie, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+Doublecortin+is+dispensable+for+the+development+of+adult+born+neurons+in+mice.">Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice.</a> PLoS One. 8 (5), e62693 (2013).</li><li>Hussaini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis.">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li></ol>

עמלות פרסום לכתבה זו ממומנות על ידי MBF Bioscience.

כאן, שתי שיטות שתוארו לכמת את היקף arborization הדנדריטים בתאים בוגרים וזה עתה נולד בשיטות צביעה קונבנציונליות בשיתוף עם RTI וEDFI. הרכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי עצב מספקת שיטה מאוד שימושית לבדיקת ההשפעות המזיקות של הפרעות ניווניות ו, בתורו, מספקת אמצעי להערכת אסטרט...

שינויים דינמיים במספר ובמבנה של סינפסות הם מסימני היכר של פיתוח, הזדקנות, והפרעות ניווניות רבות 1-3. היכולת של נוירונים לקבל ולשלב מידע הסינפטי תלויה מורפולוגיה הדנדריטים ושינויים דינמיים בקשרים סינפטיים. ואכן, נמצא מתאם חיובי בין עמוד השדרה הדנדריטים ומספר סינפסה, ששניהם משפיעים על תפקוד הקוגניטיבי 4. לפיכך, אין זה מפתיע שdecrements במספר עמוד השדרה דנדריטים נקשר עם תפקוד קוגניטיבי לקוי במספר הפרעות נוירולוגיות 5-7, מה שגרם עניין רב בכימות עמוד השדרה הדנדריטים. אף על פי כן, כימות של צפיפות עמוד השדרה נשארה זמן רב ומשימה מייגעת שלא מצליח לייצר מידע שימושי בנוגע לטופוגרפיה וההפצה של סינפסות על פני העץ הדנדריטי. למרבה המזל, בשיטות צביעה (למשל, Golgi-קוקס וdoublecortin (DCX)) בשיתוףבעזרת שיטות הדמיה מתוחכמות יכול להיות מנוצל כדי להתגבר על מחסומים הנוכחיים ולהפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של arborization הדנדריטים באופן אמין ומהיר. בעוד ששיטת צביעת Golgi-קוקס ניתן לפרוס על מנת להעריך את המצב של arborization הדנדריטים בכל הנוירונים 8, ניתן לפרוס DCX לתייג נוירונים שזה עתה נולד במיוחד ברכס המשונן ואזור subventricular 9, שיקול חשוב בהתחשב בכך שneurogenesis מתרחשת בשני אזורים אלה בתוחלת החיים 10,11. בעקבות צביעה, שתי שיטות הדמיה נפרסו להעריך מאפיינים דנדריטים: i) הדמיה בזמן אמת (RTI) ו- II) עומק מורחב של הדמיה שדה (EDFI). טכניקת RTI מספקת בממוצע לאתר ולכמת את האורך וסדר arborization לאורך המקטעים דנדריטים הפרט וסניפים. כך שהוא מאפשר לאמוד את השטח ונפח שנכבש על ידי כל עץ הדנדריטי הכולל. עוד specifically, בשיטת RTI המשתמש ברציפות מזהה את הקטעים והפניה מחודש איטרטיבי כנוירון התחקות תוכנה אוסף את x, y, z וקואורדינטות של המבנה הדנדריטי ומשחזר את מסלולו של המבנה הדנדריטי ב3D. יחסית, שיטת EDFI מספקת אמצעי פשוט למדי ומזורז להערכת צפיפות דנדריטים בדגימות רקמה עבות למדי על ידי יצירת תמונה מורכבת, מתן מידע על Z- הציר כולו. לשם כך, המשתמש רשומות קבצי וידאו בחדות גבוה בכל העובי של הסעיף ולאחר מכן משתמש בתוכנה כדי לחפש מסגרות וידאו לזהות נקודות בי פיקסל הוא לגמרי בפוקוס. בהמשך לכך, פיקסלים ממוקדים מתמזגים ומשתלבים ברזולוציה גבוהה, תמונת 2D מורכבת. תמונה מורכבת זה מכילה את כל הפיקסלים שהיו בפוקוס, ללא קשר למיקום שלהם בציר z. ניתוח איכותי וכמותי של תמונות 2D אלה יכול לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את הצפיפותשל הדנדריטים הסתעפות בכל תחום. לבסוף, אנו מציגים שיטת פנורמי ליצירת מאוד תמונות ברזולוציה גבוהה לניתוח וההערכה של דנדריטים באזור כולו של עניין. טכניקה זו ניתן לפרוס כדי להתגבר על חוסר הנגישות לרזולוציה גבוהה מאוד ומצלמות דיגיטליות יקרות. באמצעות שיטה זו, אחד לוכד תמונות סידורי במקומות שונים לאורך הקואורדינטות x ו- y צירים ולאחר מכן באופן אוטומטי תפרים אותם יחד באמצעות תוכנה חופשית (למשל, תמונה מורכבת עורך). יש לציין, שיטה זו יכולה לשמש להערכה איכותית וכמותית של arborization הדנדריטים באזור רחב למדי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="960">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Modified Golgi-cox staining solution&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">1x Developing Solution (Stock 10x)</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:272px;">30% Sucrose,</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 57-50-1</td>
			<td style="width:159px;">make fresh &#160;in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">0.3% Gelatin</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 9000-70-8</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:272px;">Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS 603-003-00-5</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Xylene</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 1330-20-7</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DPX Medium</td>
			<td style="width:263px;">EMS&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#13510</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost (+) white</td>
			<td style="width:263px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:267px;">71869-10</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)</td>
			<td style="width:263px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#4811-703</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DCX Antibody</td>
			<td style="width:263px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:267px;">sc-8066</td>
			<td style="width:159px;">4 C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DAB</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 91-95-2 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">-20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">OCT</td>
			<td style="width:263px;">Tissue-tek</td>
			<td style="width:267px;">4583</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Tris</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 77-86-1 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">ABC Lite</td>
			<td style="width:263px;">Vector</td>
			<td style="width:267px;">PK4000</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">DS-Ri1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">12 bit Camera&#160;</td>
			<td style="width:263px;">QImaging&#160;</td>
			<td>01 MBF2000RF-CLR-12</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Neurolucida System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td style="width:267px;">V.10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Composite Editor</td>
			<td style="width:263px;">Microsoft</td>
			<td>1.4.4.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">NIS Elements</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">F 3.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Pro Plus</td>
			<td style="width:263px;">Mediacy</td>
			<td>Versin 7.00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dendritic arborization in the dentate gyrus of the hippocampal region in mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

של arborization הנובע מתאי גרגיר המשונן קיימים ושזה עתה נולדו המידה נותחה בעכברים מסוג בר או באמצעות Golgi-קוקס או הכתמת DCX (איור 1). מגזרי דנדריטים של תאי DCX-חיוביים נמצאו להיות ארוך 13-36 מיקרון. ההתפלגות הנורמלית של אורך דנדריטים נבדקה באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice at JoVE.com

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

assessment-dendritic-arborization-dentate-gyrus-hippocampal-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K Views.  VA Palo Alto Health Care System. We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Video: Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for various neurological and psychiatric disorders. HFS in the deep region of the brain, also named deep-brain stimulation (DBS), is becoming increasingly important in clinical trials. Recent progress in the field of high-frequency DBS (HF-DBS) surgery has begun to spread the possibility of utilizing this invasive technique to other situations, such as treatment for major depression disorder (MDD), obsessive-compulsive disorder (OCD), and so on. 
Despite these expanding indications, the underlying mechanisms of the beneficial effects of HF-DBS remain enigmatic. To address this question, one approach is to use implanted electrodes that sparsely activate distributed subpopulations of neurons by HFS. It has been reported that HFS in the anterior nucleus of the thalamus could be used for the treatment of refractory epilepsy in the clinic. The underlying mechanisms might be related to the increased neurogenesis and altered neuronal activity. Therefore, we are interested in exploring the physiological alterations by the detection of neuronal activity as well as neurogenesis in the mouse dentate gyrus (DG) before and after HFS treatment. 
In this manuscript, we describe methodologies for HFS to target the activation of the DG in mice, directly or indirectly and in an acute or chronic manner. In addition, we describe a detailed protocol for the preparation of brain slices for c-fos and Notch1 immunofluorescent staining to monitor the neuronal activity and signaling activation and for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling to determine the neurogenesis after the HF-DBS induction. The activation of the neuronal activity and neurogenesis after the HF-DBS treatment provides direct neurobiological evidence and potential therapeutic benefits. Particularly, this methodology can be modified and applied to target other interested brain regions such as the basal ganglia and subthalamic regions for specific brain disorders in the clinic.

This protocol shows how to set up a reliable HFS method in mice. Neurons throughout the hippocampal dentate gyrus are electrically stimulated by HFS directly and indirectly in vivo. Neuronal activity and molecular signaling are examined by c-fos and Notch1 immunofluorescent staining, respectively; neurogenesis is quantified by bromodeoxyuridine labeling assay.

שיטה פולשני עבור ההפעלה של הכישור משוננת העכבר על ידי גירוי בתדירות גבוהה

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

הכוח של מרווח Interstimulus להערכה של זמני עיבוד בחולדות

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.