אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ולי ק הורטון לקריאה ביקורתית של כתב היד וRajendra פראסאד ד&quot;ר להצעות ודיונים מועילים. חלקים ממחקר זה פורסמו במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית, סאסא ואחרים. אל., &quot;השפעות רצף ה-DNA הקשר על פעילות Glycosylase של Glycosylase-DNA של 8 Oxoguanine האנושי&quot;. J Biol Chem. 287, 36,702-36,710 (2012) 2. עבודה זו נתמכה, במלואו או בחלקו, על ידי המכונים הלאומי לבריאות מחקר פרויקט גרנט Z01-ES050158 בתכנית המחקר העירוני, NIEHS.

1. הכנה של אנזים ומצע DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעל מפורש OGG1 כחלבון GST-היתוך בE. coli, לנצל GST, התגית לטיהור, ולאחר מכן להסיר את GST-תג על ידי מחשוף עם HRV-3C פרוטאז (איור 1) 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש מסונתז כימי oligonucleotide שכותרת גדיל oligonucleotide ללא תווית משלימה 5&#39;-6-carboxyfluorescein (6-FAM) המכיל שאריות של 8 oxoG אחת ו. את oligonucleotides 34-mer מכיל 8-oxoG במיקום 17 מ5&#39;-end. לטהר oligonucleotides אלה על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מצע גדילי הדנ&quot;א כפול המכיל 8-oxoG ידי oligonucleotide ערבוב 5&#39;-6-FAM שכותרתו עם הגדיל המשלים שלו ביחס טוחנת של 1:1.2 במאגר חישול (10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 50 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge. מניחים את הצינור בלצוף במים רותחים למשך 5 דקות. השאר את הצינור למקום ולאחר מכן לתת את המים קרים באיטיות לימיןטמפרטורת Oom (זה לוקח כ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הכנת מדגם והניסוי בתנאי תאורה נמוכה או מינימאלי כדי למזער photobleaching של תווית הניאון. </li></ol> 2. מדידה כמובן זמן מצב יציב וטיטרציה אתר פעילה של OGG1 2.1. הכנת מדגם וכמובן זמן מצב יציב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 בנפרד במאגר התגובה (50 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5, 20 מ&quot;מ KCl, 0.5 mM EDTA, ו -0.1% אלבומין בסרום שור) ב1.5 צינורות microfuge מ&quot;ל על קרח. הריכוז של ה-DNA של 400 ננומטר והריכוז לכאורה של OGG1 הוא 30, 60, 90, או 120 ננומטר, כפי שנקבעו על ידי assay חלבון ברדפורד. מניחים את צינורות התגובה בסט גוש חום על 37 ° C. אנזים טרום דגירה ופתרונות מצע DNA בנפרד על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל את התגובה על ידי ערבוב כמויות שווה של את פתרונות מצע OGG1 וה-DNA על ידי pipetting. לאחר ערבוב solu אלהtions 1:1 (V / V), את הריכוזים הסופיים הם דנ&quot;א 200 ננומטר ו 15, 30, 45, או 60 ננומטר OGG1, בהתאמה. הסר aliquots (10 μl) במרווחי זמן ולהרוות את התגובה על ידי ערבוב עם μl 1 של 1 M NaOH. כשליטה לקורסים בזמן, 10 μl של תערובת התגובה ללא אנזים הוא מעורבב עם μl 1 של 1 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות תגובה ב90 ° גוש חום צלזיוס למשך 5 דקות לדבוק מוצר הסופי AP באתר. לאחר חימום, להוסיף μl 1 של 1 M HCl לנטרל מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה (12 μl) של חיץ טעינת ג&#39;ל (לפוראמיד 95%, 20 מ&quot;מ EDTA, 0.02% bromophenol, ו0.02% cyanol קסילן) לכל דגימת תגובה, ולאחר מכן הנח את התערובת בגוש חום נקבע על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואז למקם את הצינור מייד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות (5 μl) על גבי 15% ג&#39;ל המכיל אוריאה polyacrylamide denaturing ז 8 ב89 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.8, חומצה בור 89 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ וEDTA. את המוצרים בקעו המצע ומופרדים היטב לאחרפועל ג&#39;ל. </li></ol> 2.2. הדמיה של ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג&#39;ל באמצעות imager שיכול לזהות את ה-DNA שכותרתו fluorescently ולדמיין את המצע ולהקות מוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הלהקות לאחר ההדמיה ג&#39;ל. שים לב שחלק מחשוף רקע אפשר לראות לאחר טיפול של המצע עצמו עם NaOH (איור 2 א). לחסר רקע זה מכמות המדודה של כל מוצר תגובה. </li></ol> 2.3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את כמות המוצר שנוצרה בכל פעם תגובה (t) (איור 2). לנתח את נתוני הגלם באמצעות משוואה 1 כדי לקבוע את המשרעת של פרץ (0, חיתוך-y) והשיפוע של שלב המצב יציב ליניארית (V-SS). </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילהיחסית חיתוך-y לריכוז החלבון הכולל (ריכוז אנזים לכאורה כלומר; איור 2 ג), מתן מידה של החלק הפעיל של אנזים. השתמש בכושר ליניארי עם ליירט אפס לספק גורם התיקון לקביעת החלק של אנזים פעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה שיעור המצב יציב יחסית לריכוז האנזים הפעיל (איור 2 ד), מתן לדרג את מוצר הניתוק קבוע (כלומר שיפוע של הקו המצויד). </li></ol> 3. מדידה כמובן זמן טרום מצב יציב כפי שמוצג באיור 2, היווצרות מוצר בשלב פרץ הוא מהיר מדי למדידה על ידי ערבוב ומרווה ידני. לפיכך, מכשיר להרוות-זרימה מהירה יכול לספק שיטה רב עוצמה כדי למדוד תגובה מהירה המתרחשות בקנה מידת זמן אלפית השנייה (איור 3) 5. המכשיר משתמש במנוע מבוקר מחשב לערבב במהירותND להרוות את התגובות אחרי זמני תגובה מצוינים. כך, למשל, להשתמש באמצעי להרוות-Flow RQF-3 ראפיד Kintek למדוד את השלב הראשוני ושלב פרץ מצב יציב הבא של היווצרות מוצר catalyzed ידי OGG1. מכשירים להרוות-זרימה מהירות זמינים ממספר יצרנים. 3.1. הכנת המדגם בנפרד להכין את מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 בצינורות 1.5 מ&quot;ל כפי שתואר ב2-1. הריכוזים של ה-DNA וOGG1 הפעיל הנן 400 ננומטר ו -80 ננומטר, בהתאמה. כתוצאה מכך ריכוזים סופיים של ה-DNA ו200 ננומטר 40 ננומטר OGG1 הפעיל לאחר ערבוב 1:1 (V / V). 3.2. הכנת המכשיר להרוות-זרימה מהירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אמבט מים במחזור למכשיר להרוות-הזרימה המהיר לבקרת טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הפרמטרים של המכשיר ובחר את לולאת התגובה המתאימה לזמן הרצוי נקודות בהתאם להוראתו של היצרןtions. הלולאות הן התגובה של אורכים משתנים כדי לספק זמני תגובה חלופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ תגובה וNaOH להרוות פתרונות ב10 מ&quot;ל מזרקים luer נעל חד פעמי ולצרף המזרקים האלה ליציאות הכונן ולטעון את מאגרי הכונן עם מאגר התגובה (מזרקים B) ו142 מ&quot;מ NaOH (מזרק ש) (שסתום טען מזרק בעמדת טעינה) . כדי להסיר את בועות אוויר מהמזרק, יעבדו פתרון הלוך ושוב כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את מנוע צעד עד שהוא קשר העליון של המזרקים (שסתומים טען מזרק וטען שסתומים לדוגמה בעמדת אש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לולאות לדוגמה, לולאת התגובה, ושורת סיום במים ומתנול. ייבש את האזורים הסמוקים לחלוטין (שסתומים בעמדת סומק). </li></ol> 3.3. כמובן זמן מראש מצב יציב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חור בחלקו העליון של צינור כתרים 1.5 מ&quot;ל באמצעות מחט 16 מד. צרף צינור בקו היציאה לאסוף את התגובה הרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את reactio הרצויזמן n (בשניות) באמצעות לוח המקשים. מנוע צעד יהיה לגבות להתאים לנפח לולאה כדי לשמור על נפח להרוות מתמיד. בוכנות עמדה עבור B המזרק נגד פלטפורמת מנוע צעד על ידי הוספת חיץ עם המזרקים חד פעמיים המחוברים ליציאות הכונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 1 מ&quot;ל מזרקים luer נעל חד פעמי עם מצע ה-DNA ופתרוני OGG1, בהתאמה (שסתומים לדוגמה בעמדת טעינה). צרף מזרקים עם מצע ה-DNA וOGG1 פתרונות לכל אחת מיציאות טעינת המדגם, ולאחר מכן למלא את לולאות לדוגמה עם מצע ה-DNA ופתרוני OGG1, בהתאמה (לדוגמה טען שסתום בעמדת טעינה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את כל השסתומים טען מזרק וטען שסתומים לדוגמה למצב האש. התחל את התגובה על ידי שבץ לוח מקשים (עיתונות לדוגמה של &quot;G&quot; או על מקש &quot;התחל&quot;). מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 (18 μl כל אחד) מעורבבים באופן מיידי בלופ התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהתגובה הוא רווה באופן אוטומטי בזמן התגובה הרצוי על ידי ערבוב של 36 μl Rתערובת eaction עם 86 μl של 142 מ&quot;מ NaOH. לאחר מרווה התגובה, המדגם ריקה מהקו היציאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סתום טען מזרק לעמדת הטעינה וטען שסתום לדוגמא לעמדת הסומק. לשטוף את לולאות לדוגמה, לולאת התגובה, ושורת סיום במים ומתנול ולייבש כמתואר ב3.2. חזור על התהליך לעיל לכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסוי שליטה ללא אנזים כדי לקבוע תיקון רקע, אשר יכול להיעשות באופן ידני או עם המכשיר מהיר להרוות. כדי לבצע בקרה עם המכשיר מהיר להרוות, למלא את לולאת דגימת DNA עם מצע לדנ&quot;א אבל לשמור לולאת דוגמה עבור OGG1 ריק. הגדר את זמן התגובה, לבצע את התמהיל ולהרוות כפי שמתואר ב3.3.4-3.3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את לולאות לדוגמה ואת לולאת התגובה עם 2 M NaOH, 2 M HCl, מים ומתנול ולאחר מכן לייבש את קווי שטף. לאחר הגדרת מנוע צעד לעמדת הבית, לעבור את סתום טען מזרק כדי positio העומסn ולשטוף את הכונן עם מאגרי מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הדגימות הרווות תגובה עם חום, ולאחר מכן מצע נפרד וה-DNA של המוצר ב -15% denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide כפי שמתואר ב2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזות ולכמת את הלהקות על הג&#39;ל כמתואר ב2.2. </li></ol> 3.4. ניתוח נתונים להתאים את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר על ידי ניתוח רגרסיה ליניארי למשוואה עם עלייה במונחי מעריכי וליניארית (משוואה 2) מספקים שיעור מהסדר הראשון הקבוע (K obs), המשרעת של פרץ (0), ו שיעור ליניארי (V-SS). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. כמובן זמן יחיד מחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA ומצע OGG1 בצינורות 1.5 מ&quot;ל נפרד כמתואר ב2-1. הריכוזtions של ה-DNA וOGG1 הפעיל הנן 100 ננומטר ו 500 ננומטר, בהתאמה; זה מניב ריכוזים סופיים של ה-DNA ננומטר 50 ננומטר ו250 OGG1 לאחר ערבוב 1:1 (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המכשיר להרוות-הזרימה המהירה ולהכין את דגימות התגובה, כמתואר ב3.2 ו -3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את דגימות תגובה הרווות עם חום ולייחד להם עד 15% denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide למוצרי מצע ונפרד כמתואר ב2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזות ולכמת את הלהקות על הג&#39;ל כמתואר ב2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר לאחד מעריכי לקבוע שיעור קבוע מהסדר הראשון (K obs) כנתון במשוואה 3. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

<ol>
	<li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates.">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li><li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li><li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+"pinch-pull-push"+mechanism.">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases.">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li><li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells.">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li><li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease:+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair.">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase.">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li><li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase.">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li><li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome:+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase.">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li><li>Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change.">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li><li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+formamidopyrimidines+by+8-oxoguanine+glycosylases.">Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases.</a> Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).</li><li>Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+hydantoin+products+of+8-oxoguanine+oxidation+by+the+Escherichia+coli+DNA+repair+enzyme,+FPG.">Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG.</a> Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).</li><li>Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+versus+repair:+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded,+bulge,+bubble,+and+duplex+DNA+contexts.">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li><li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1,+yOGG1,+and+yOGG2.">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li><li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+(Ogg)+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination.">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence.">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li><li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY.">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li><li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+(MUTYH)+and+Y165C,+G382D,+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer.">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium(II):+implications+for+cadmium+genotoxicity.">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion.">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li><li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

את הקינטית הגישות מתוארות כאן מתארים שיטות להגדרת קבועים קינטיים יסודיים. אם מהלך זמן של היווצרות המוצר הוא biphasic עם המחזור הראשון האנזימטית מתרחש במהירות, ולאחר מכן צעד אחרי הכימיה הוא שיעור הגבלה במהלך מחזורים קטליטיים שלאחר מכן. במקרה של OGG1, ניתן למדוד את המחזור הראשון באמצעות ריכוזי אנזים גבוהים עם או הגבלה (S &lt;E) או (S&gt; E גבוהה) ריכוזי ה-DNA. במקרה הראשון, התגובה מוגבלת ל &#39;יחיד מחזור&#39; ומספקת מדד של שיעור קטליטי באתר הפעיל של האנזים. במקרה האחרון, מחזורים אנזימטיות מרובים מוערכים. פרץ של היווצרות מוצר המתרחשת במהלך המחזור הראשון מספק מדד של האירוע הכימי באתר הפעיל של האנזים, ואילו מחזורים שלאחר מכן לספק מידה של הצעד שמגביל את רכיבה על אופניים קטליטי. בנוסף, את המשרעת של פרץ של היווצרות המוצר מספקת מידה מסוימת של אנזים מעורב באופן פעיל. זה חייב להיות ידוע על מנת לחשב את השיעור קבוע ממוצר דיסוציאציה מהירות המצב יציב (k = v את ss / E). לOGG1, על שחרורו של ה-DNA של המוצר (כלומר שיעור ה-DNA של מוצר ניתוק קבוע) מגביל את רכיבה על אופניים קטליטי ושיעור המצב היציב שלה 7,8. כפי שניתן לראות באיור 4, מוצר שיעור ה-DNA הניתוק הקבוע (k = 0.0055 שניות את -1) לOGG1 הוא בשני סדרי גודל נמוך יותר מהשיעור שנצפה קטליטי (K obs = 0.75 שניות -1). זוהי תכונה נפוצה הקינטית של glycosylases DNA שבסיסי DNA פגום בלו כדי לאגד את המוצרים שלהם (DNA עם אתר abasic) בחוזקה, כך ששחרורו של המוצר הוא שיעור הגבלה במהלך מדידות מצב יציב 1,8-10. חשוב לציין, מדידות פעילות מצב יציב ובכך מספקות דרך פשוטה וישירה כדי לקבוע זיקה מחייבת DNA מוצר; פעילות נמוכה מרמזת ב מוצר הדוק יותרinding. כמתואר באיור 2 ונציג תוצאות, החלק הפעיל של אנזים נקבע להיות 38%. החלק הפעיל הוא נמוך יותר מזה שנקבע מריכוז החלבון, למרות שהאנזים המוכן הוא&gt; הומוגנית 95% (איור 1). זה יכול להיות בגלל המחייב הלא הספציפי של האנזים על המצע ו / או בשיטה של קביעת חלבון שלא יכול להעריך במדויק את ריכוז החלבון האמיתי (assay החלבון ברדפורד לדוגמה משתמש בדרך כלל בסרום שור אלבומין כסטנדרט שלא יכול להיות טוב לחקות לאנזים של עניין). לחלופין, ניתן לקבוע ריכוז חלבון בשיטות אחרות או מוערך ממקדמי הכחדה טוחנים מחושבים לפי 280 ננומטר כגון שפותח על ידי גיל ופון היפל 11. כפי שניתן לראות באיורים 4 ו 5, את סדר הגודל של K obs נקבעו הלוך ושובמ &#39;כמובן הזמן מראש המצב יציב צריכים להיות בקנה אחד עם שנקבע מניסוי יחיד מחזור. הערך של k את צריך להיות גם בניסוי עקבי בין שיטות הקינטיות חלופיות. אם, לעומת זאת, קבועי קצב האלה הם שונים (לדוגמה: את K הוא שונה בין תנאי מצב יציב ומראש מצב יציב), שלבים שונים ניתן למדוד על ידי כל אחת משיטות ויש לשקול מודל חדש. לחלופין, עיכוב מוצר או דלדול מצע יכול להשפיע על שיעור המצב יציב לכאורה בקורס זמן מראש מצב יציב שמזהם את החלק ליניארי. במצב שבו פרץ ושלבי המצב יציב אינם מופרדים היטב (כלומר K obs ~ k כבוי), את המשרעת של פרץ וקבועי השיעור שנצפו הם מרוכבים של קבועי קצב יסודיים למספר שלבים 12. יתר על כן, שחרורו, אם המוצר הוא מהיר (כלומר K obs את&gt; k), מהלך הזמן של היווצרות המוצר אינו biphasic (המחזור ראשון ומחזורים שלאחר מכן מוגבלים על ידי אותו צעד, כימיה). במקרה זה, ניסוי יחיד מחזור יכול לספק מידה של קטליזה. אם גישה יחידה מחזור נעשית כדי לקבוע שיעור קטליטי מהותי, יש להשתמש באנזים מספיק כדי להבטיח שאינו מחייבות באופן חלקי שיעור מגביל. כמו כן, מצע מחייב גם חייב להיות מהיר כדי ששיעור פרץ אינו מוגבל על ידי קשירת מצע. כדי לוודא שלא מחייב אנזים שער הגבלה במהלך ניסוי יחיד מחזור, כמובן הזמן חוזר על עצמו עם ריכוז אנזים שונה כדי לוודא שמהלך זמן מעריכי לא משתנה. בנוסף, מאז את המשרעת של פרץ כמובן הזמן או חד מחזור היא ביחס ישר לאנזים או ריכוז מצע, בהתאמה, יש לבחור בריכוזים אלה שלo הם ניתנים למדידה באופן מהימן. לבסוף, יש לציין כי כאשר שיעורי הפרץ ומצב יציב אינם מופרדים היטב, משרעת פרץ underestimates ריכוז האנזים הפעיל האמיתי 12. קינטיקה הגישות שתוארו לעיל לספק שיטה אמינה לבודד את השלבים עיקריים בעת רכיבה על אופניים קטליטי של glycosylases DNA. עם קבועים קינטיים התייחסות לאלה, השפעתו של רצף ה-DNA / מבנה 1,13-18 שינה, יכולה כעת להיות מוערכים שאריות פעילה באתר 19,20, 21 יונים מתכת, או חלבון אבזר הסלולר בקטליזה או רכיבה על אופניים אנזים 22-24.

סביבה אירובית ממהרת חוסר יציבות גנומית. נגע DNA promutagenic גדול כתוצאה מלחץ חמצוני הוא 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). זאת בשל פוטנציאל הקידוד המעורפל של 8-oxoG. אדם 8-DNA oxoguanine glycosylase (OGG1) הוא אחראי לייזום תיקון כריתת בסיס של 8-oxoG. פעילות glycosylase של OGG1 בולה בסיס 8-oxoG וכתוצאה מכך ה-DNA של המוצר עם אתר apurinic (AP באתר). פעילות lyase חלשה של OGG1 יכולה לחתוך את AP באתר במקרים מסוימים. אפיון הקינטית של glycosylases DNA בדרך כלל מגלה שהם מפגינים קורסי זמן biphasic. לאחר שלב ראשוני של היווצרות מהירה של מוצר (כלומר פרץ), שלב מצב יציב ליניארי הוא ציין 1-3. התנהגות זו מעידה על צעד בעקבות כימיה (שינוי קונפורמציה כלומר או שחרור מוצר) ששיעור הגבלה במהלך החלק ליניארית של הזמן כמובן, ואילו ספחתרח שלב, המכונה לעתים קרובות את השלב החולף, מתאים להיווצרות מוצר באתר הפעיל אנזים במהלך המחזור של התגובה הראשונה. כאשר שחרור המוצר הוא שיעור הגבלה בשלב המצב יציב, מדידות פעילות לספק מידה איכותית של זיקה המחייבת DNA של מוצר, אך אינו מספקות מידע בנוגע לאירועים בהקינטית אנזים האתר הפעיל (כלומר כימיה). בהתאם לכך, שיטות לבודד ולמדוד את שלב פרץ מראש מצב יציב מעריכי יש צורך לחקור אירועים במהלך המחזור האנזימטית הראשון בשעה 4 האתר הפעיל של האנזים. קיימות שלוש גישות סטנדרטיות להקינטית מאפיינות את ההתנהגות הקטליטית של OGG1, (1) מצב יציב, (2) מראש מצב יציב, וכן (3) חד המחזור. גישות אלה שונות זו מזו על ידי הריכוז של אנזים בתערובת התגובה ואת האנזים ליחס מצע מנוצל בכל גישה. בגישת מצב יציב טיפוסי,מכונה קינטיקה תחלופה מרובות לפעמים, ריכוזים נמוכים של אנזים המשמשים למעקב היווצרות מוצר. ריכוז המצע עולה בהרבה על ריכוז האנזים כך שאיבודים אנזימטיות מרובים אינם משפיעים על ריכוז מצע באופן משמעותי. במצב זה, קורסי זמן צריכים להיות ליניארי, ולעתים קרובות קשה להבחין אם פרץ התרחש במהלך המחזור הראשון בשל ריכוז האנזים הנמוך בשימוש בגישה זו; לב שהמשרעת פרץ היא שווה ערך לריכוז האנזים. זו ניתן להתגבר על ידי שימוש בריכוז גבוה יותר והשערת אנזים כמובן הזמן ליניארי לאפס זמן כדי לזהות אם המחזור האנזימטית הראשון התרחש במהירות. ליירט בordinate (ציר y) צריך להיות פרופורציונלי לריכוז האנזים ומספק מידה מסוימת של האנזים מעורב באופן פעיל עם מצע. למרות שגישה זו יכולה באופן עקרוני לספק ראיות לקיומו של שלב פרץ, אונטערשיידגישה שונה שממפה נדרש למדוד את הקינטיקה של שלב פרץ. במקרים רבים שלב פרץ הוא מהיר מדי למדידה על ידי טכניקות ערבוב ומרווה ידניות. במצב זה, הקינטית מראש מצב יציב וחד מחזור (כלומר הקינטית חולף) מתקרב לעתים קרובות דורש מכשיר ערבוב מהיר ומרווה לעקוב אחרי נקודות זמן מוקדמות של תגובה 5. בגישה מראש מצב יציב ריכוזים גבוהים של אנזים נמצאים בשימוש, כך שכמות משמעותית של מוצר נוצר במהלך המחזור הראשון. מאז מחזורים מרובים ואחרי רכיבה על אופניים כדי לבחון קטליטי (כלומר השלב ליניארי שאחרי פרץ), ריכוז מצע גדול מריכוז האנזים ([אנזים] &lt;[מצע]). לבודד אירועים באתר הפעיל של האנזים ללא רכיבה על אופניים קטליטי, תנאים יחיד מחזור מנוצלים. במקרה זה, מצע רווי באנזים (E &gt;&gt; S) כך שכל המצע ישתתףn &#39;התחלופה היחידה &quot;, ובדרך כלל תפגין כמובן זמן יחיד מעריכים. כפי שצוין לעיל לאנזימים כי תערוכת שלב פרץ, שחרור מוצר (k כבוי) לעתים קרובות מגביל את השיעור של השלב היציב של מהלך הזמן. קצב השחרור של מוצר (. / שעת V ss, קונצרט כלשהו) ניתן לקבוע מן המדרון של שלב המצב יציב ליניארי. ריכוז האנזים הפעיל (ה) יש צורך להמיר את קצב שחרור מוצר לקצב פנימי מתמיד כאשר k = v את ss / [E]. חשוב לציין, ריכוז האנזים הפעיל הוא בדרך כלל נמוך יותר מהריכוז שנמדד החלבון בשל זיהומים, האנזים פעיל, אנזים שאינם פרודוקטיבית חייב מצע, ואת השיטה המשמשת לקביעת ריכוז חלבון. ריכוז האנזים הפעיל ניתן לקבוע ממשרעת פרץ, כאשר שחרורו של המוצר הוא איטי. לפיכך, חיוץ כמובן זמן מצב יציב לזמן אפס מספק אומדן של האנזים הפעיל הדרושים כדי לחשב את K (שחרור מוצר) מהשיעור שנצפה המצב יציב. כדי למדוד את הקינטיקה של פרץ, גישה מראש מצב יציב היא צורך לעקוב אחר היווצרות המוצר במהלך המחזור הראשון המתרחש לפני שלב המצב יציב ליניארי. קינטיקה הפרץ כדלקמן היווצרות אנזימים מוצר ביניים. ברגע שהתגובה היא שיזמה אנזים ערבוב עם מצע, את כמות אנזים התוצר מגבירה במהירות עד שהתגובה מגיעה שלב מצב יציב. אם קטליזה היא הרבה יותר מהיר מאשר שחרור מוצר, את המשרעת של פרץ שווה לאנזים מעורב באופן פעיל וגישת מעריכי שנצפו לשיווי משקל (K obs) מתאימה לשיעור ההמרה כימית של מצע למוצר, בהנחת שהשיעור ההפוך של כימיה היא זניחה. בכמה מקרים CY קטליטינאחזים מפריע לניתוח מראש מצב יציב, כגון כאשר הבהירויות של שיעורי כימיה ושחרור המוצר אינן שונות באופן משמעותי. במקרה זה, העסקת קרוב משפחה אנזים עודף לרכיבה על אופניים מונעת מצע הקטליטי ומצע מגבלות כרוכות באנזים למחזור אחד. בהתאם לכך, הצעד הכימי הראשון של התגובה יכול להיות מבודד ונקבע במדויק כקבוע קצב מהסדר ראשון (k תצפיות). שיעור זה קבוע צריך להיות דומה לK obs נקבע מהגישה מראש המצב יציב שתוארה לעיל. כאן אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בגישות אלה הקינטית לנתח את פעילות glycosylase של OGG1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

אדם 8-DNA oxoguanine glycosylase (OGG1) בולה נגע DNA חמצוני מוטגניות 8-אוקסו 7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) מ-DNA. אפיון הקינטית של OGG1 נעשה כדי למדוד את שיעורי הכריתה 8-oxoG ושחרור מוצר. כאשר ריכוז OGG1 הוא נמוך יותר מאשר ה-DNA המצע, קורסים בזמן של היווצרות המוצר הם biphasic; שלב מעריכי מהיר (כלומר פרץ) של היווצרות מוצר ואחריו שלב מצב יציב ליניארי. פרץ הראשוני של היווצרות המוצר מתאים לריכוז של אנזים עוסק כראוי על המצע, ואת המשרעת פרץ תלויה בריכוזו של אנזים. השיעור ראשון הסדר הקבוע של פרץ מתאים לקצב הפנימי של כריתת 8-oxoG וקצב איטי יותר מצב יציב מודד את קצב שחרור מוצר (מוצר ה-DNA שיעור קבוע דיסוציאציה, K כבוי). כאן, אנו מתארים מצב יציב, מראש מצב יציב, ואחת גישות מחזור לבודד ולמדוד SPצעדי ecific במהלך רכיבה על אופניים OGG1 קטליטיים. Oligonucleotide המכיל נגע שכותרת ניאון וOGG1 מטוהרים משמשים כדי להקל על מדידות מדויקות הקינטית. מאז ריכוזי אנזים נמוכים משמשים לביצוע מדידות מצב יציב, הוראות ערבוב של חומרים כימיים ומרווה של התגובה ניתן לבצע כדי לברר את שיעור המצב יציב (k כבוי). בנוסף, ניפוח של שיעור המצב יציב לנקודה על ordinate בזמן אפס מציין כי פרץ של היווצרות מוצר התרחש במהלך המחזור הראשון (כלומר חיתוך-y הוא חיובי). ניתן למדידה בשיעור הקבוע מהסדר הראשון של שלב פרץ מעריכי בטכניקת ערבוב ומרווה מהירה הבוחנת את כמות המוצר שנוצר במרווחי זמן קצרים (&lt;1 שניות) לפני שלב המצב יציב ומתאים לשיעור של 8 oxoG-כריתה (כלומר כימיה). הצעד הכימי גם ניתן למדוד באמצעות גישה יחידה שבו רכיבה על אופניים מחזור הקטליטי הואלמנוע על ידי דנ&quot;א מצע להרוות עם אנזים (E&gt; S). גישות אלו יכולות למדוד את קבועי קצב יסודיים המשפיעים על היעילות של הסרת נגע ה-DNA.

ניתוח הקינטית מצב יציב בוצע על ידי שימוש במצע DNA ננומטר 200 וארבעה ריכוזים שונים של OGG1 לכאורה (15, 30, 45, ו -60 ננומטר), כפי שנקבע על ידי רדפורד assay חלבון 2. את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר שיתאימו למשוואה ליניארית כדי לקבוע 26 ננומטר, בהתאמה, ביחס לכל ריכוז חלבון (איור 2) החיתוך-y, שהיו 2.2, 11, 15, ו. ה-Y מיירט נוסף היו זמם ביחס לכל ריכוז חלבון בפועל (איור 2 ג). החלק של אנזים פעיל נקבע להיות 38% מהשיפוע של הקו באיור 2 ג. כדי לקבוע את שיעור המצב יציב, שנקבע מהתקפי יניארי באיור 2 ב V ss היו זמם ביחס ל-y מיירט (איור 2 ד). השיפוע של הקו באיור 2D היה 0.0028 שניות -1, שהוא שווה ערך לשיעור קבוע דיסוציאציהלמוצר AP אתר וחרות באתר שהוקם על ידי AP-DNA glycosylase פעילויות / lyase. כמובן זמן מראש מצב יציב בעקבות שימוש במצע DNA ננומטר 200 ננומטר פעילים ו40 OGG1. את הקורסים בזמן של היווצרות המוצר ניתן להתאים למשוואה עם תנאי מעריכי וליניארי עולים. כפי שניתן לראות באיור 4, K ו-K את התצפיות היו נחוש להיות 0.75 שניות -1 ו0.0055 שניות -1, בהתאמה 2. המשרעת לשלב פרץ (33 ננומטר) הייתה מעט נמוכה מצפוי מהריכוז של OGG1 הפעיל הוסיף (40 ננומטר). זה יכול להיות בגלל כריכה ספציפיות של OGG1 למצע ה-DNA המפחית את המספרים הזמינים של מולקולות אנזים. בתנאים יחיד מחזור, תגובת כריתת 8-oxoG הסתיימה בתוך 6 שניות (איור 5) 2. מהלך הזמן של היווצרות מוצר יכול להיות כשיר לאחד מעריכימשוואה והניב K obs של 0.74 שניות -1. יש לציין, משרעת להיווצרות המוצר היה נמוך מהצפויים 50 ננומטר הוסיפו מצע ה-DNA. זה היה יכול להיות בין שאר כתוצאה מחשוף רקע של ה-DNA על ידי NaOH טיפול (איור 2 א) או הנוכחות של oligonucleotides מצע unannealed בתערובת התגובה. <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695fig1.jpg" /> איור 1. טיהור של OGG1 אדם מא coli. OGG1 הגן האנושי היה משובטים לpGEX-6P-1 וביטוי יתר בBL21 (DE3) תאים. ליין 1; תאי uninduced, ליין 2; תאים המושרה IPTG, מסלול 3; שברים חלבון מסיסים, מסלול 4; גלוטתיון Sepharose 4B לאחר דגירה עם שבריר חלבון מסיס, מסלול 5; לזרום דרך שבריר לאחר דגירה של גלוטתיון Sepharose 4B עם HRV 3זרימה דרך שבריר לאחר הסרת מזהמים לפי עמודת Q מונו; C פרוטאז, 6 נתיבים. תצלום של ג&#39;ל הצבעוני הכחול Coomassie מוצג. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695fig2.jpg" /> איור 2. קינטיקה מצב יציב וטיטרציה אתר פעילה של מטוהרים OGG1 2 OGG1 (15 ננומטר, ○, 30 ננומטר, 45 ננומטר, □, ◊; או 60 ננומטר, ×). הודגר עם 200 מצע DNA ננומטר (5&#39;-X CTGCAGCTGATGCGCC TACGGATCCCCGGGTAC -3 &#39;, כאשר X הוא 8-oxoG יחד עם C) על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-30 דקות כפי שצוין. ריכוזי אנזימים אלה מייצגים ריכוזי חלבון לכאורה המבוססים על assay החלבון ברדפורד, נבדקים ומעקומת סטנדרט BSA., Denaturing ג&#39;ל polyacrylamide מראה מצעים מופרדים (S) ומוצרים (P). OGG1 (30 ננומטר) ו200 ננומטר D<html> מצע NA שימש לתגובה. ב &#39;, קורסים בזמן של היווצרות מוצר. הנתונים שיתאימו למשוואה ליניארית כדי לקבוע את המשרעת של שלב פרץ (חיתוך-y) ושיעור ניכר של שחרור מוצר (שיפוע). C, עלילה של מיירט נקבע מהתקפי יניארי בלוח ב &#39;ביחס לזה שנקבע על ידי assay ברדפורד. השיפוע של הקו מתאים לכל החלק של אנזים פעיל. בר השגיאה מציין את השגיאה במשרעת המשתמעות מהתקפי יניארי להיווצרות המוצר בלוח ב &#39;. ד&#39;, עלילה של המדרונות נקבעו מהתקפי יניארי בלוח ב &#39;ביחס לריכוז האנזים הפעיל. בר השגיאה מציין את השגיאה בשיפוע המשתמע מהתקפי יניארי להיווצרות המוצר בלוח ב &#39;. השיפוע של הקו מקביל לשיעור המצב יציב (k כבוי), 0.0028 שניות -1. jove_content &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695fig3.jpg" /> איור 3. סקירה כללית של מכשיר להרוות-זרימה מהירה. <img alt="איור 4" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695fig4.jpg" /> איור 4. קינטיקה טרום יציב של כריתת 8-oxoG ידי OGG1 2. OGG1 (40 ננומטר אנזים פעיל) הודגר עם 200 מצע DNA ננומטר (5&#39;-X CATGGGCGGCATGAACC GAGGCCCATCCTCACC-3 &quot;, כאשר X הוא 8-oxoG יחד עם C) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 0-100 שניות. הקו המקווקו מציין ניפוח של שלב המצב יציב. הנתונים שיתאימו למשוואת פרץ עם המשרעת שווה 33 ± 0.89 ננומטר, K תצפיות שווה ל -0.75 ± 0.083שנייה -1, V S S שווה ל -0.18 ± 0.018 שניות ננומטר -1 ואת k שווה ל 0.0055 ± 0.020 שניות -1. <img alt="איור 5" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695fig5.jpg" /> איור 5. קינטיקה מחזור אחד של כריתת 8-oxoG ידי OGG1 2. OGG1 (אנזים 250 ננומטר פעילים) הודגר עם 50 מצע DNA ננומטר (5&#39;-X CTGCAGCTGATGCGCC TACGGATCCCCGGGTAC-3 &quot;, כאשר X הוא 8-oxoG יחד עם C) על 37 מעלות צלזיוס למשך 0-60 שניות. הנתונים שיתאימו למשוואה מעריכית היחידה עם K obs שווה 0.74 ± 0.015 שניות -1. הקו המקווקו מציין את המשרעת אקסטרפולציה (כלומר מוצר בזמן אינסופי).

Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Google

Research

JoVE Journal

Chemistry

19.2K Views.  NIEHS, National Institutes of Health. קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.

Video: Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

הכנת מצעים נציץ והסיליקון לDNA אוריגמי ניתוח וניסויים

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Polymerizations אתילן באמצעות כורי לחץ מקבילים וניתוח קינטי של העברת פלמור שרשרת

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

ייצור ובדיקה של מדי חום פוטוני

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Disentangling חוזק גבוה קופולימר ארמיד סיבים כדי לאפשר קביעת תכונות מכניות שלהם

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

היבט טכני של סינתזה אוטומטי הערכה בזמן אמת קינטי של [11ג] הצמד-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident high-energy electron beam is rocked with the submicrometric pivot point fixed on a specimen. This method enables us to quantitatively derive the site occupancies and site-dependent chemical information of impurities or intentionally doped functional elements in a specimen, using energy-dispersive X-ray spectroscopy and electron energy-loss spectroscopy attached to a scanning transmission electron microscope, which is of significant interest to current materials science, particularly related to nanotechnologies. This scheme is applicable to any combination of elements even when the conventional Rietveld analysis by X-ray or neutron diffraction occasionally fails to provide the desired results because of limited sample sizes and close scattering factors of neighboring elements in the periodic table. In this methodological article, we demonstrate the basic experimental procedure and analysis method of the present beam-rocking microanalysis.

We provide a general outline of quantitative microanalysis methods for estimating the site occupancies of impurities and their chemical states by taking advantage of electron-channeling phenomena under incident electron beam-rocking conditions, which reliably extract information from minority species, light elements, oxygen vacancies, and other point/line/planar defects.