Nous remercions le Dr Julie K. Horton pour la lecture critique du manuscrit et le Dr Rajendra Prasad des suggestions utiles et des discussions. Des portions de cette recherche ont été publiés à l&#39;origine dans The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., &quot;séquence d&#39;ADN effets de contexte sur l&#39;activité de l&#39;homme Glycosylase ADNglycosylase 8 oxoguanine.&quot; J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Ce travail a été financé, en tout ou en partie, par les National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 dans le programme de recherche intra-muros, NIEHS.

1. Préparation de l&#39;enzyme et substrat d&#39;ADN <ol><li> Surexpriment OGG1 comme une protéine de fusion GST dans E. coli, utilisent la GST-tag pour la purification, puis supprimer la TPS-tag par clivage avec HRV-3C protéase (Figure 1) 6. </li><li> Achetez la synthèse chimique 5&#39;-6-carboxyfluorescéine (6-FAM) oligonucléotide marqué contenant un seul résidu de 8 oxoG et son brin complémentaire d&#39;oligonucléotides non marqués. Les oligonucléotides 34-mères contiennent un 8-oxoG à la position 17 à partir de l&#39;extrémité 5 &#39;. Purifier ces oligonucléotides par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. </li><li> Préparer substrat d&#39;ADN bicaténaire contenant 8-oxoG par mélange de 5&#39;-6-FAM oligonucléotide marqué avec son brin complémentaire dans un rapport molaire de 1:1,2 à tampon d&#39;hybridation (tampon Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 10 mM, 50, 1 mM EDTA) dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. Placer le tube dans un flotteur dans l&#39;eau bouillante pendant 5 min. Laisser le tube en place, puis de laisser l&#39;eau refroidir lentement à rtempérature oom (cela prend environ 2 heures). </li><li> Effectuer la préparation d&#39;échantillon et de l&#39;expérience dans des conditions de lumière faible ou minimal afin de minimiser photoblanchiment du marqueur fluorescent. </li></ol> 2. Mesure de la Course de l&#39;heure Steady-State et Active site titrage de OGG1 2.1. La préparation des échantillons et évolution dans le temps l&#39;état d&#39;équilibre <ol><li> Préparer substrat d&#39;ADN et Ogg1 solutions séparément dans un tampon de réaction (50 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM KCl, 0,5 mM EDTA et 0,1% de sérum albumine bovine) dans des tubes de 1,5 ml microtubes sur la glace. La concentration en ADN est de 400 nM et la concentration apparente de OGG1 est de 30, 60, 90, ou 120 nm comme déterminé par un dosage des protéines de Bradford. Placer les tubes de réaction dans un ensemble de blocs de la chaleur à 37 ° C. Enzyme pré-incuber des solutions de substrat d&#39;ADN séparément à 37 ° C pendant 1 min. </li><li> Démarrer la réaction en mélangeant des volumes égaux des solutions de substrat Ogg1 et de l&#39;ADN par pipetage. Après avoir mélangé ces solutionstions 1:1 (v / v), les concentrations finales sont 200 ADN nM et 15, 30, 45, ou 60 nM OGG1, respectivement. Retirer aliquotes (10 pi) à des intervalles de temps et stopper la réaction en mélangeant avec 1 pi de 1 M NaOH. Comme la commande pour les cours à temps partiel, 10 pl du mélange de réaction sans enzyme est mélangée avec 1 pi de 1 M NaOH. </li><li> Placer les échantillons de réaction dans un bloc ° de chaleur 90 ° C pendant 5 min à cliver le produit résultant AP-site. Après le chauffage, ajouter 1 l de HCl 1 M pour neutraliser chaque échantillon. </li><li> Ajouter un volume égal (12 pi) de tampon de chargement de gel (95% de formamide, 20 mM EDTA, 0,02% bromophénol et 0,02% cyanol de xylène) à chaque échantillon de réaction, puis placez le mélange dans un bloc chauffant réglé à 95 ° C pendant 2 min, puis placez immédiatement le tube sur la glace. </li><li> Charger les échantillons (5 pi) sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 15% contenant 8 M d&#39;urée dans 89 mM Tris-HCl, pH 8,8, acide borique 89 mM et 2 mM EDTA. Le substrat et les produits clivés sont bien séparés aprèsexécuter le gel. </li></ol> 2.2. L&#39;imagerie du gel <ol><li> Scannez le gel en utilisant un imageur qui permet de détecter l&#39;ADN marqué par fluorescence et de visualiser le substrat et les bandes de produit. </li><li> Quantifier les bandes après l&#39;imagerie du gel. Notez que certains clivage de fond peut être observée après traitement du substrat lui-même avec NaOH (figure 2A). Soustraire ce contexte de la quantité mesurée de chaque produit de la réaction. </li></ol> 2.3. L&#39;analyse des données <ol><li> Tracer la quantité du produit formé à chaque temps de réaction (t) (Figure 2B). Analyser les données brutes à l&#39;aide de l&#39;équation 1 pour déterminer l&#39;amplitude de la salve (A 0, ordonnée à l&#39;origine) et de la pente de la phase de régime permanent linéaire (V SS). </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Terrainl&#39;ordonnée à l&#39;origine par rapport à la concentration totale de protéine (par exemple une concentration de l&#39;enzyme apparent, la figure 2C), fournissant une mesure de la fraction active de l&#39;enzyme. Utilisation d&#39;un ajustement linéaire avec une ordonnée à zéro pour fournir le facteur de correction pour la détermination de la fraction d&#39;enzyme active. </li><li> Tracer la vitesse de régime permanent par rapport à la concentration en enzyme active (figure 2D), fournissant la vitesse de dissociation de produit constante (soit la pente de la droite de régression). </li></ol> 3. Mesure de la Course de temps pré-état stationnaire Comme le montre la figure 2, la formation du produit au cours de la phase de la salve est trop rapide pour mesurer par mélange manuel et de trempe. Par conséquent, un instrument trempe écoulement rapide peut fournir une méthode puissante pour mesurer les réactions rapides qui se produisent à l&#39;échelle de la milliseconde (Figure 3) 5. L&#39;appareil utilise un moteur d&#39;entraînement commandé par ordinateur pour mélanger rapidement unnd étancher réactions après le temps de réaction spécifiées. Par exemple, utiliser un RQF-3 Rapid Instrument Quench-Flow Kintek pour mesurer la phase de la salve initiale et ultérieure phase de l&#39;état d&#39;équilibre de formation du produit catalysée par OGG1. Instruments Quench-écoulement rapide sont disponibles auprès de plusieurs fabricants. 3.1. Préparation de l&#39;échantillon Préparez séparément substrat d&#39;ADN et Ogg1 solutions dans des tubes de 1,5 ml comme décrit dans 2-1. Les concentrations d&#39;ADN et OGG1 actifs sont 400 nm et 80 nm, respectivement. Cela se traduit par des concentrations finales de l&#39;ADN de 200 nM et 40 nM de Ogg1 actif après mélange 1:1 (v / v). 3.2. Préparation de l &#39;instrument de trempe à écoulement rapide <ol><li> Connexion d&#39;un bain d&#39;eau en circulation à l&#39;instrument de trempe à écoulement rapide pour le contrôle de la température (37 ° C). </li><li> Réglez les paramètres de l&#39;appareil et sélectionner la boucle de réaction appropriée pour le temps désiré points selon le instructions du fabricanttions. Les boucles de réaction sont de longueurs variables pour fournir d&#39;autres durées de réaction. </li><li> Préparer le tampon de réaction et la soude étancher solutions dans 10 ml luer lock seringues jetables et attacher ces seringues aux ports d&#39;unité et de charger les réservoirs d&#39;entraînement avec un tampon de réaction (seringues B) et 142 mM NaOH (seringue Q) (seringues charge Vannes en position de chargement) . Pour éliminer les bulles d&#39;air de la seringue, fonctionnent de la solution d&#39;avant en arrière plusieurs fois. </li><li> Abaisser le moteur pas à pas jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche le haut de la seringue (vannes de charge de seringues et vannes de charge de l&#39;échantillon dans la position de FEU). </li><li> Rincer les boucles d&#39;échantillonnage, la boucle de réaction et la sortie ligne avec de l&#39;eau et du méthanol. Sécher les zones rougies complètement (soupapes en position affleurante). </li></ol> 3.3. Évolution dans le temps de pré-état stationnaire <ol><li> Faire un trou dans la partie supérieure d&#39;un tube fermé de 1,5 ml à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 16. Fixer un tube à la sortie ligne pour recueillir la réaction trempé. </li><li> Réglez le reactio désirén temps (en secondes) à l&#39;aide du clavier. Le Stepper Motor va sauvegarder pour ajuster le volume de la boucle de manière à maintenir le volume de refroidissement constant. plongeurs de position pour seringue B contre la plate-forme du moteur pas à pas par addition de tampon avec les seringues jetables connectés aux ports d&#39;entraînement. </li><li> Remplir 1 ml luer lock seringues jetables avec substrat d&#39;ADN et Ogg1 solutions, respectivement (valves de l&#39;échantillon en position de charge). Fixez seringues avec le substrat de l&#39;ADN et Ogg1 solutions à chacun des ports de charge de l&#39;échantillon, puis remplissez les boucles d&#39;échantillon avec un substrat d&#39;ADN et Ogg1 solutions, respectivement (exemples charge Vannes en position de charge). </li><li> Réglez tous Charger Vannes seringue et vannes de charge de l&#39;échantillon à la position de FEU. Déclencher la réaction par un coup de clavier (par exemple, appuyez sur la touche &quot;START&quot; &quot;G&quot; ou). substrat d&#39;ADN et Ogg1 solutions (18 pi chacun) sont immédiatement mélangés dans la boucle de réaction. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que la réaction est automatiquement désactivé au moment de réaction souhaitée en mélangeant 36 pl de la rmélange eaction avec 86 pl de 142 mM NaOH. Après arrêt de la réaction, l&#39;échantillon est déchargé de la sortie de ligne. </li><li> Régler la charge Vannes seringue à la position de la charge et les exemples charge Vannes à la position affleurante. Rincer les boucles d&#39;échantillonnage, la boucle de réaction et la sortie ligne avec de l&#39;eau et du méthanol et sécher comme décrit au paragraphe 3.2. Répétez la procédure ci-dessus pour chaque point de temps. </li><li> Effectuer un essai témoin sans enzyme pour déterminer une correction de fond, qui peut être fait manuellement ou avec l&#39;instrument rapide trempe. Pour effectuer un contrôle avec l&#39;instrument rapide trempe, remplissez la boucle d&#39;échantillonnage de l&#39;ADN avec le substrat d&#39;ADN, mais garder la boucle d&#39;échantillonnage pour OGG1 vide. Réglez le temps de réaction, effectuer le mélange et trempe tel que décrit dans 3.3.4-3.3.6. </li><li> Laver les boucles d&#39;échantillonnage et la boucle de réaction avec NaOH 2 M, 2 M HCl, de l&#39;eau et du méthanol, puis sécher les lignes lavés. Après avoir réglé le moteur pas à pas à la position d&#39;origine, commutation de la charge Vannes seringue à la positio LOADn et laver les réservoirs d&#39;entraînement avec l&#39;eau. </li><li> Traiter les échantillons trempés de réaction avec la chaleur, et ensuite substrat séparé et de l&#39;ADN du produit de 15% par électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide, comme décrit en 2.1. </li><li> Visualiser et de quantifier les bandes sur le gel comme décrit au paragraphe 2.2. </li></ol> 3.4. L&#39;analyse des données Monter les durées de la formation du produit par l&#39;analyse de régression non linéaire à une équation à une hausse des termes exponentiels et linéaires (équation 2) qui fournissent la constante de vitesse de premier ordre (Kobs), l&#39;amplitude de la salve (A 0), et une vitesse linéaire (V SS). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. Cours de temps seul chiffre d&#39;affaires <ol><li> Préparer substrat d&#39;ADN et OGG1 dans des tubes de 1,5 ml séparés comme décrit dans 2-1. La concentrationtion de l&#39;ADN et OGG1 actifs sont 100 nm et 500 nm, respectivement, ce qui donne des concentrations finales de 50 d&#39;ADN nM et 250 nM OGG1 après mélange 1:1 (v / v). </li><li> Préparation de l&#39;instrument trempe écoulement rapide et préparer les échantillons de réaction comme décrit dans 3.2 et 3.3. </li><li> Traiter les échantillons de réaction stoppée avec la chaleur et les soumettent à 15% électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide de substrat et de produits séparé comme décrit au paragraphe 2.1. </li><li> Visualiser et de quantifier les bandes sur le gel comme décrit au paragraphe 2.2. </li><li> Monter les durées de formation du produit à une seule exponentielle pour déterminer la constante de vitesse de premier ordre (k obs) comme indiqué dans l&#39;équation 3. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

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R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion.">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li><li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les approches cinétiques décrites ici un aperçu des méthodes pour définir des constantes cinétiques élémentaires. Si une évolution dans le temps de formation du produit est biphasique avec le premier chiffre d&#39;affaires enzymatique produisant rapidement, puis une étape après la chimie est limitante pendant revirements catalytiques ultérieurs. Dans le cas de OGG1, le premier chiffre peut être mesurée à l&#39;aide de fortes concentrations d&#39;enzymes avec soit de limitation (S &lt;E) ou haute (S&gt; E)...

Un milieu aérobie accélère l&#39;instabilité génomique. Une importante lésion de l&#39;ADN promutagène résultant du stress oxydatif est la 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8 oxoG). Cela est dû au potentiel de codage ambigu de 8 oxoG. Human 8 oxoguanine ADN glycosylase (OGG1) est chargé d&#39;initier la réparation par excision de base de 8 oxoG. L&#39;activité glycosylase de OGG1 excise la base de 8 oxoG résultant dans l&#39;ADN de produit avec un site apurinique (AP-site). Une activité de lyase faible de OGG1 peut inciser le site de AP dans certains cas. Caractérisation cinétique des ADN glycosylases trouve généralement qu&#39;ils présentent des cours à temps biphasique. Après une phase initiale rapide de la formation du produit (c.-à-burst), une phase de régime permanent linéaire est observée 3.1. Ce comportement est révélateur d&#39;une étape à la suite chimie (ie changement de conformation ou la libération du produit) étant de limitation de vitesse au cours de la partie linéaire de l&#39;évolution dans le temps, alors que la fraiseère phase, souvent désigné comme la phase transitoire, correspond à la formation du produit sur le site actif de l&#39;enzyme au cours du premier cycle de la réaction. Lorsque la libération du produit est la limitation du débit au cours de la phase stationnaire, mesures d&#39;activité fournissent une mesure qualitative du produit ADN affinité de liaison, mais ne fournissent pas d&#39;informations concernant la cinétique des événements sur le site actif de l&#39;enzyme (c.-à-chimie). En conséquence, les méthodes d&#39;isoler et de mesurer la phase de la salve de pré-état stationnaire exponentielle sont nécessaires pour sonder événements au cours de la première rotation enzymatique au niveau du site actif 4 de l&#39;enzyme. Il existe trois approches cinétiques classiques pour caractériser le comportement catalytique de OGG1, (1) l&#39;état d&#39;équilibre, (2) pré-état stationnaire, et (3) un seul chiffre d&#39;affaires. Ces approches se distinguent les unes des autres par la concentration d&#39;enzyme dans le milieu réactionnel et le rapport enzyme à substrat utilisé dans chaque approche. Dans une approche typique d&#39;équilibre,parfois appelé plusieurs cinétique de rotation, de faibles concentrations d&#39;enzyme sont utilisés pour suivre la formation du produit. La concentration du substrat dépasse largement la concentration de l&#39;enzyme de sorte que plusieurs revirements enzymatiques n&#39;affectent pas significativement la concentration du substrat. Dans cette situation, les temps devraient être linéaire et il est souvent difficile de discerner si une explosion a eu lieu au cours du premier chiffre d&#39;affaires en raison de la faible concentration d&#39;enzyme utilisée dans cette approche; noter que l&#39;amplitude de la rafale est équivalente à la concentration de l&#39;enzyme. Cela peut être surmonté en utilisant une concentration de l&#39;enzyme supérieur et en extrapolant l&#39;évolution temporelle linéaire au temps zéro pour détecter si le premier chiffre d&#39;affaires s&#39;est rapidement enzymatique. L&#39;interception sur l&#39;axe des ordonnées (axe des y) doit être proportionnelle à la concentration de l&#39;enzyme et fournit une mesure de l&#39;enzyme activement engagé avec le substrat. Bien que cette approche ne peut en principe fournir des preuves de l&#39;existence d&#39;une phase de la salve, une difrents approche est nécessaire pour mesurer la cinétique de la phase de la salve. Dans de nombreux cas, la phase d&#39;éclatement est trop rapide pour mesurer par des techniques de mélange et d&#39;extinction manuelles. Dans cette situation, cinétique pré-état stable et unique chiffre d&#39;affaires (c.-à-cinétique transitoire) approches nécessitent souvent un instrument de mélange rapide et la trempe de suivre les points de temps au début d&#39;une réaction 5. Dans une approche pré-état d&#39;équilibre des concentrations élevées d&#39;enzyme sont utilisés de telle sorte qu&#39;une quantité importante de produit est formé au cours de la première rotation. Depuis plusieurs revirements sont suivis pour observer cyclisme catalytique (ie la phase linéaire qui suit l&#39;éclatement), la concentration en substrat est supérieure à la concentration de l&#39;enzyme ([enzyme] &lt;[substrat]). Pour isoler des événements sur le site actif de l&#39;enzyme sans vélo catalytique, conditions unique chiffre d&#39;affaires sont utilisés. Dans ce cas, le substrat est saturé avec l&#39;enzyme (E S &gt;&gt;) de telle sorte que la totalité du substrat participeront in le &#39;chiffre d&#39;affaires unique »et présenteront typiquement un cours à temps simple exponentielle. Comme indiqué ci-dessus pour les enzymes qui présentent une phase d&#39;éclatement, la libération du produit (k off) limite souvent le taux de la phase stationnaire de l&#39;évolution dans le temps. Le taux de libération du produit (. / Heure V SS, conc) peut être déterminée à partir de la pente de la phase stationnaire linéaire. La concentration d&#39;enzyme active (E) est nécessaire pour convertir le taux de libération du produit à un rythme intrinsèque constante k off = v ss / [E]. Fait important, la concentration de l&#39;enzyme active est généralement inférieure à la concentration mesurée en protéines due aux impuretés, enzyme inactive, enzyme non-productive liés au substrat, et la méthode utilisée pour déterminer la concentration en protéines. La concentration de l&#39;enzyme active puisse être déterminée à partir de l&#39;amplitude de salve lorsque la libération du produit est lente. Ainsi, en extrapolant à un cours à temps l&#39;état d&#39;équilibre àtemps zéro fournit une estimation de l&#39;enzyme active nécessaire pour calculer k off (sortie du produit) du taux d&#39;équilibre observé. Pour mesurer la cinétique de l&#39;explosion, une approche pré-état d&#39;équilibre est nécessaire de suivre la formation du produit au cours du premier chiffre d&#39;affaires qui se produit avant la phase stationnaire linéaire. La cinétique d&#39;éclatement suit la formation de l&#39;enzyme produit intermédiaire. Une fois que la réaction est initiée par l&#39;enzyme de mélange avec le substrat, la quantité de l&#39;enzyme produit augmente rapidement jusqu&#39;à ce que la réaction atteigne une phase de régime permanent. Si la catalyse est beaucoup plus rapide que la libération du produit, l&#39;amplitude de la rafale est égale à enzyme engagé activement et de l&#39;approche exponentielle observée à l&#39;équilibre (k obs) correspond à la vitesse de conversion chimique du substrat en produit, en supposant que la vitesse inverse de chimie est négligeable. Dans certains cas, cy catalytiques&#39;accrocher interfère avec une analyse pré-état stationnaire, comme lorsque l&#39;ampleur des taux de la chimie et de la libération du produit ne sont pas significativement différentes. Dans ce cas, employant excès relatif de l&#39;enzyme de substrat empêche les cycles catalytiques et les limites substrat lié avec l&#39;enzyme pour un chiffre d&#39;affaires unique. Par conséquent, la première étape chimique de la réaction peut être isolé et déterminé avec précision que la constante de vitesse de premier ordre (k obs). Cette constante de vitesse devrait être similaire à kobs déterminée à partir de l&#39;approche pré-état stationnaire décrit ci-dessus. Ici, nous décrivons comment ces approches cinétiques peuvent être utilisés pour analyser l&#39;activité glycosylase de OGG1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Human 8-oxoguanine ADN glycosylase (OGG1) excise le mutagène oxydatif lésion de l&#39;ADN 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) à partir de l&#39;ADN. Caractérisation cinétique des OGG1 est entrepris pour mesurer les taux d&#39;excision 8 oxoG et version du produit. Lorsque la concentration est inférieure à OGG1 substrat d&#39;ADN, les temps de formation de produit sont biphasique; une phase exponentielle rapide (c. salve) de formation du produit est suivie par une phase de régime permanent linéaire. La salve initial de la formation du produit correspond à la concentration de l&#39;enzyme correctement en prise sur le substrat, et l&#39;amplitude de rafale dépend de la concentration de l&#39;enzyme. La constante de l&#39;éclatement de vitesse de premier ordre correspond à la fréquence intrinsèque de l&#39;excision 8 oxoG et le taux de régime permanent lent mesure le taux de libération du produit (Product DNA dissociation constante de vitesse, k off). Ici, nous décrivons les approches état d&#39;équilibre, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d&#39;affaires d&#39;isoler et de mesurer spétapes SPÉCIFIQUE pendant OGG1 cyclisme catalytique. A fluorescent oligonucléotide marqué lésion contenant et OGG1 purifiés sont utilisés pour faciliter les mesures cinétiques précises. Depuis faibles concentrations d&#39;enzymes sont utilisés pour effectuer des mesures en régime permanent, le mélange des réactifs manuel et extinction de la réaction peut être effectuée pour déterminer le taux de régime permanent (k off). En outre, l&#39;extrapolation de la vitesse de régime permanent à un point situé sur l&#39;ordonnée à l&#39;instant zéro indique qu&#39;une salve de formation de produit est survenu au cours de la première rotation (c. ordonnée à l&#39;origine est positif). La constante de temps de la phase de salve exponentiel de vitesse de premier ordre peut être mesurée à l&#39;aide d&#39;une technique de mélange et de refroidissement rapide, qui examine la quantité de produit formé à des intervalles de temps courts (&lt;1 s) avant la phase de régime permanent, et correspond à la vitesse de 8 -oxoG excision (c.-à-chimie). L&#39;étape chimique peut également être mesurée en utilisant une approche unique chiffre d&#39;affaires où le cyclisme catalytique estempêché par l&#39;ADN de substrat de saturation avec l&#39;enzyme (E&gt; S). Ces approches permettent de mesurer les constantes de vitesse élémentaires qui influencent l&#39;efficacité d&#39;élimination d&#39;une lésion de l&#39;ADN.

Analyse cinétique état ​​d&#39;équilibre a été effectuée en utilisant 200 substrat d&#39;ADN nM et quatre concentrations apparentes différentes de OGG1 (15, 30, 45, et 60 nM) telle que déterminée par un dosage de protéines Bradford 2. Les cours du temps de la formation du produit ont été ajustées à une équation linéaire pour déterminer l&#39;ordonnée à l&#39;origine, qui étaient de 2,2, 11, 15 et 26 nm, respectivement, par rapport à chaque concentration de la protéine (figure...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

des plages de temps pour l&#39;activité glycosylase de 8-oxoguanine ADN glycosylase sont biphasique présentant une salve de formation de produit et une phase de régime permanent linéaire. Utilisant des techniques de trempe de trésorerie, l&#39;éclatement et les taux de régime permanent peut être mesurée, qui correspondent à l&#39;excision de 8 oxoguanine et la libération de la glycosylase de l&#39;ADN du produit, respectivement.

L&#39;état d&#39;équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d&#39;affaires de l&#39;activité de ADNglycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

19.2K vues.  NIEHS, National Institutes of Health. des plages de temps pour l'activité glycosylase de 8-oxoguanine ADN glycosylase sont biphasique présentant une salve de formation de produit et une phase de régime permanent linéaire. Utilisant des techniques de trempe de trésorerie, l'éclatement et les taux de régime permanent peut être mesurée, qui correspondent à l'excision de 8 oxoguanine et la libération de la glycosylase de l'ADN du produit, respectivement.

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

HPLC: Mesure de l&#39;oxydation des biomarqueurs ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Recherche

Chimie

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Préparation de Mica et Silicon substrats pour l&#39;ADN Origami Analyse et Expérimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Les polymérisations de l&#39;éthylène en utilisant des réacteurs à pression parallèles et une analyse cinétique de polymérisation de transfert de chaîne

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Fabrication et essai de thermomètres photoniques

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Mesure simultanée de HDAC1 et de HDAC6 activité en HeLa cellules utilisant UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Démêler les fibres d’aramide de copolymère haute résistance afin de permettre la détermination de leurs propriétés mécaniques

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Aspect technique de la synthèse automatisée et de l'évaluation cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

Tests d'activité basés sur la RMN pour déterminer l'inhibition des composés, les valeurs IC50, l'activité artifactual et l'activité à cellules entières des ribohydrolases nucléoside

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident high-energy electron beam is rocked with the submicrometric pivot point fixed on a specimen. This method enables us to quantitatively derive the site occupancies and site-dependent chemical information of impurities or intentionally doped functional elements in a specimen, using energy-dispersive X-ray spectroscopy and electron energy-loss spectroscopy attached to a scanning transmission electron microscope, which is of significant interest to current materials science, particularly related to nanotechnologies. This scheme is applicable to any combination of elements even when the conventional Rietveld analysis by X-ray or neutron diffraction occasionally fails to provide the desired results because of limited sample sizes and close scattering factors of neighboring elements in the periodic table. In this methodological article, we demonstrate the basic experimental procedure and analysis method of the present beam-rocking microanalysis.

We provide a general outline of quantitative microanalysis methods for estimating the site occupancies of impurities and their chemical states by taking advantage of electron-channeling phenomena under incident electron beam-rocking conditions, which reliably extract information from minority species, light elements, oxygen vacancies, and other point/line/planar defects.

Analyse quantitative de site atomique de dopants fonctionnels/défauts ponctuels dans des matériaux cristallins par microanalyse améliorée par canalisation électronique