Biz yararlı öneriler ve tartışmalar için el yazması ve Dr Rajendra Prasad eleştirel okuma Dr Julie K. Horton teşekkür ederim. Bu araştırmanın bazı bölümleri ilk Biyolojik Kimya, Sassa A et Dergisi yayımlandı. al., &quot;İnsan 8-Oxoguanine DNA glikosilaz en glikosilaz Aktivitesi Üzerine DNA Dizi Bağlam Etkileri.&quot; Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Bu çalışma İntramural Araştırma Programı Sağlık Araştırma Projeleri Z01-ES050158 Ulusal Enstitüleri, NIEHS tarafından, tamamen veya kısmen, desteklenmiştir.

1. Enzim ve DNA Yüzey hazırlanması <ol><li> E. bir GST-füzyon proteini olarak aşırı ifade OGG1 coli, saflaştırma için GST-tag, uygulanması ve daha sonra, HRV-3C proteaz (Şekil 1) 6 ile bölünme ile GST-tag çıkarın. </li><li> Tek 8-oxoG kalıntı içeren kimyasal olarak sentezlenmiş 5&#39;-6-carboxyfluorescein (6-FAM) etiketli oligonükleotid ve tamamlayıcı etiketsiz oligonükleotid iplikçik satın alın. 34-mer oligonükleotid 5&#39;-ucundan 17 pozisyonunda bir 8-oxoG içerir. Poliakrilamid jel elektroforezi ile, bu oligonükleotitler arındırın. </li><li> Tavlama tamponu 1:1.2 arasında bir mol oranında (10 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI, 1 onun tamamlayıcı dizi karıştırma 5&#39;-6-FAM etiketli oligonükleotid tarafından yapılmış 8-oxoG içeren çift-sarmallı DNA substrat hazırlama 1.5 ml mikrofüj tüpüne mM EDTA). 5 dakika için kaynayan su içinde yüzen ise tüp yerleştirin. R yavaş yavaş su soğumasını bekleyin sonra yerde tüp bırakın veoom sıcaklığı (bu yaklaşık 2 saat sürer). </li><li> Floresan etiket Photobleaching en aza indirmek için çok düşük ya da çok az ışık koşulları altında numune hazırlama ve deney yapın. </li></ol> 2. Durağan Durum gün Dersin ve OGG1 Aktif Sitesi titrasyonu ölçümü 2.1. Örnek hazırlama ve kararlı durum zamanlı kurs <ol><li> Buz üzerinde 1.5 ml mikrofüj tüplerine (50 mM HEPES, pH 7.5, 20 mM KCI, 0.5 mM EDTA ve% 0.1 sığır serum albümini), reaksiyon tamponu içinde ayrı ayrı DNA alt tabaka ve OGG1 çözümler hazırlayın. DNA konsantrasyonu 400 nM ve OGG1 belirgin konsantrasyonu, 60 30 olan, 90 ya da 120 nM bir Bradford protein deneyi ile tayin edilmiştir. 37, bir ısıtma bloğu grubu olarak reaksiyon tüpleri ° C 37 ile ön inkübe, enzim ve alt tabaka ayrı ayrı DNA çözümler ° C 1 dakika boyunca kurutuldu. </li><li> Pipetleme OGG1 ve DNA substrat çözeltileri, eşit hacimlerde karıştırılarak reaksiyon başlar. Bu çözüm karıştırma sonrasılar 1:1 (h / h), son konsantrasyon 200 nM DNA ve 15, 30, 45 ya da 60 nM OGG1, sırasıyla. Zaman aralıklarında alikotları (10 ul) çıkarın ve 1 M NaOH, 1 ul ile karıştırılarak reaksiyon soğutun. Zaman içerisinde, enzim olmadan reaksiyon karışımı, 10 ul için bir kontrol 1 M NaOH, 1 ul ile karıştırılır gibi. </li><li> Yanlması için 5 dakika elde edilen ürün, AP-sitesi için bir 90 ° C ısıya blok içindeki reaksiyon örnekleri yerleştirin. Isıtmadan sonra, her bir numune nötralize etmek için 1 M HCl 1 ul. </li><li> Her reaksiyon için örnek jel yükleme tamponu eşit bir hacmi (12 ul) (% 95 formamid, 20 mM EDTA,% 0.02 bromofenol, ve% 0.02 ksilen cyanol) ekleyin ve daha sonra 95 ° C&#39;de ayarlanmış bir ısıtma bloğu karışım yerleştirmek 2 dakika boyunca, daha sonra buz üzerinde hemen tüp yerleştirin. </li><li> 89 mM Tris-HCI, pH 8.8, 89 mM borik asit, 2 mM EDTA, 8 M üre içeren% 15&#39;lik bir denatüre edici poliakrilamid jel üzerine numuneleri (5 ul) yükleyin. Yüzey ve bölünmüş ürünleri de sonra ayrılırjel çalışıyor. </li></ol> 2.2. Jelin Görüntüleme <ol><li> Floresan etiketli DNA tespit ve yüzey ve ürün grupları oluşturulabiliyor bir kamera kullanarak jel tarayın. </li><li> Görüntüleme jel sonra bantları sayısal. Bazı arka plan bölünme NaOH (Şekil 2A) ile yüzeye kendisinin tedaviden sonra görülebilir unutmayın. Her bir reaksiyon ürününün ölçülen miktarından Bu arka plana çıkartır. </li></ol> 2.3. Veri analizi <ol><li> Her reaksiyon süresi (T) (Şekil 2B) oluşan ürün miktarı çizilir. Patlama (A 0, y-kesişim) ve doğrusal kararlı durum faz (v ss) eğimi genliği belirlemek için Denklem 1 kullanarak ham veri analiz edin. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Arsa, enzimin aktif fraksiyonu bir ölçü temin edilmesi; y kesişim toplam protein yoğunluklarının (Şekil 2C, yani belirgin Enzim konsantrasyonu) göre. Aktif enzim fraksiyonu için düzeltme faktörü sağlamak için bir sıfır kesme ile doğrusal bir uyum kullanın. </li><li> Ürün ayrılma oranı sabitesi sağlayan, aktif enzim konsantrasyonu (Şekil 2B) göre sabit durum oranı alanı (takılmış hattı yani eğim). </li></ol> 3. Ön kararlı durum gün Dersin ölçümü Şekil 2&#39;den görüleceği gibi, kayma aşamasında ürün oluşumu gösterilmektedir Elle karıştırma ve soğutma ile ölçmek için çok hızlıdır. Bu nedenle, hızlı bir söndürme-akış alet milisaniye zaman ölçeği (Şekil 3) 5 meydana hızlı reaksiyonlar ölçmek için güçlü bir yöntem sağlayabilir. Cihaz hızla karıştırmak için bir bilgisayar kontrollü tahrik motoru kullanırnd belirtilen reaksiyon süreleri sonra reaksiyonlar gidermek. Örneğin, ilk patlama faz ve OGG1 tarafından katalize ürün oluşum sonraki kararlı durum faz ölçmek için bir KinTek RQF-3 Hızlı Soğutma-Akış Enstrüman kullanın. Hızlı Soğutma-Akış Instruments çeşitli üreticilerin mevcuttur. 3.1. Örnek hazırlanması Ayrı 2-1 açıklandığı gibi 1,5 ml tüpler DNA substrat ve OGG1 çözümler hazırlar. DNA ve aktif OGG1 konsantrasyonları, sırasıyla, 400 nM ve 80 nM. 200 nM son DNA konsantrasyonu ve 40 nM karıştırma 01:01 (v / v) sonrasında aktif OGG1 ile sonuçlanır. 3.2. Hızlı söndürme akış alet hazırlanması <ol><li> Sıcaklık kontrolü için hızlı söndürme akış Aracı (37 ° C) bir dolaşan su banyosu bağlayın. </li><li> Cihaz parametrelerini ayarlamak ve istenilen zaman için uygun reaksiyon döngü seçin üreticinin talimatlarına göre işaretlar. Reaksiyon döngüler alternatif reaksiyon süreleri sağlamak için değişken uzunlukları vardır. </li><li> Reaksiyon tamponu hazırlayın ve NaOH 10 ml Luer Lock tek kullanımlık enjektör çözümler gidermek ve Sürücü Limanlar bu şırınga takın ve reaksiyon tamponu (şırınga B) ve 142 mM NaOH (şırınga Q) (YÜK konumda Şırınga Yük Vanalar) ile Sürücü Rezervuarlar yük . şırınga gelen hava kabarcıklarını çıkarmak için, birkaç kez ileri geri çözüm çalışır. </li><li> Step motor indirin temas şırınga üst (YANGIN konumda Şırınga Yük vana ve örnek Yük vanalar) kadar. </li><li> Örnek Döngüler, Reaksiyon Döngü, ve su ve metanol ile Çıkışı Hat yıkayın. Tamamen kızarmış alanlar (FLUSH konumunda vanalar) kurutun. </li></ol> 3.3. Ön kararlı durum zamanlı kurs <ol><li> 16 ölçek iğne kullanılarak bir şapkalı 1.5 ml tüp üst kısmında bir delik açın. Söndürülen reaksiyon toplamak için Çıkışı Hat bir tüp takın. </li><li> İstenen reactio ayarlamatakımını kullanarak N süre (saniye olarak). Sabit söndürme hacmi korumak olarak Step Motor çok döngü ses ayarlamak için yedekler. Sürücü Limanlar bağlı tek şırınga ile tampon ekleyerek Step Motor platformu karşı şırınga B için pozisyon pistonları. </li><li> DNA substrat ile 1 ml Luer Lock tek kullanımlık enjektör ve OGG1 çözümleri, sırasıyla (YÜK konumda örnek vanalar) doldurun. Örnek Yük Limanlar her birine DNA substrat ve OGG1 çözümleri ile şırınga takın, ve sonra (YÜK konumda örnek Yük Vanalar) sırasıyla, DNA substrat ve OGG1 çözümleri ile örnek Döngüler doldurun. </li><li> YANGIN konumuna tüm Şırınga Yük Vanalar ve örnek Yük Vanalar ayarlayın. Bir tuş takımı inme (&quot;G&quot; veya &quot;START&quot; tuşuna basın örneğin) ile reaksiyon başlar. DNA yüzey ve OGG1 çözümleri (18 ul her biri) hemen Reaksiyon döngü karıştırılır. </li><li> Reaksiyon otomatik olarak R 36 ul karıştırılarak istenen reaksiyon zamanında söndürülmüş kadar bekleyin142 mM NaOH ile 86 ul eaction bir karışım. Söndürme Reaksiyon sonra, numune çıkış hattına boşaltılır. </li><li> YÜK konumu ve FLUSH konumuna Örnek Yük Vanalar için Şırınga Yük Vanalar ayarlayın. Örnek Döngüler, reaksiyon döngü ve su ve metanol ile çıkış hattına yıkayın ve 3.2 &#39;de tarif edildiği gibi kurutun. Her noktası için yukarıdaki işlemi tekrarlayın. </li><li> Elle ya da hızlı söndürme aleti ile yapılabilir bir arka plan düzeltmesi belirlemek için enzim olmayan bir kontrol deneyi gerçekleştirin. Hızlı söndürme aleti ile bir kontrol gerçekleştirmek için, DNA substrat ile DNA için örnek döngü doldurmak ama OGG1 boş için örnek döngü tutun. Reaksiyon süresi ayarlamak, karışım yapmak ve gibi 3.3.4-3.3.6 açıklandığı quench. </li><li> 2 M NaOH, 2 M HCI, su ve metanol ile birlikte Örnek Döngüler ve reaksiyon döngü yıkayın ve daha sonra yıkanmış hatları kurutun. Başlangıç ​​konumuna Step Motor ayarladıktan sonra, YÜK positio için Şırınga Yük Vanalar geçişn ve su ile Sürücü Rezervuarlar yıkayın. </li><li> Daha sonra, söndürülen reaksiyon ısı örnekler ve 2.1 &#39;de tarif edildiği gibi poliakrilamid jel elektroforezi, denatüre edici% 15 oranında ayrı bir substrat ve ürün DNA tedavi edin. </li><li> Görselleştirmek ve 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi, jel üzerindeki bant miktarı belirlenir. </li></ol> 3.4. Veri analizi Sürekli birinci dereceden (k atıl), patlama (A 0) genliği sağlayan yükselen bir üstel ve doğrusal açısından (Eşitlik 2) ile bir denkleme doğrusal olmayan regresyon analizi ile ürün oluşum zamanlı kurslar Fit ve doğrusal bir oranı (v ss). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. Tek cirosu gün Dersin <ol><li> 2-1 de tarif edildiği gibi ayrı bir 1.5 ml tüpler DNA alt tabaka ve OGG1 hazırlayın. KonsantrasyonDNA ve aktif OGG1 lar, sırasıyla, 100 nM ve 500 nM; verimi bu karışım 01:01 (v / v) sonra en az 50 nM ve 250 nM DNA OGG1 son konsantrasyonları. </li><li> Hızlı söndürme akış alet hazırlamak ve 3.2 ve 3.3 &#39;de tarif edildiği gibi reaksiyon, numunelerin hazırlanması. </li><li> Isı ile Söndürülmüş tepkime örnekleri tedavi ve 2.1 &#39;de tarif edildiği gibi% 15 ayrı substrat ve ürünler denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile karşı karşıya bırakmaktadır. </li><li> Görselleştirmek ve 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi, jel üzerindeki bant miktarı belirlenir. </li><li> Denklem 3&#39;te verilen birinci dereceden hız sabiti (k atıl) belirlemek için tek bir üstel ürün oluşumu zamanlı kurslar takın. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

<ol>
	<li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates.">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li><li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li><li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+"pinch-pull-push"+mechanism.">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases.">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li><li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells.">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li><li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease:+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair.">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase.">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li><li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase.">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li><li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome:+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase.">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li><li>Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change.">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li><li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+formamidopyrimidines+by+8-oxoguanine+glycosylases.">Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases.</a> Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).</li><li>Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+hydantoin+products+of+8-oxoguanine+oxidation+by+the+Escherichia+coli+DNA+repair+enzyme,+FPG.">Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG.</a> Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).</li><li>Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+versus+repair:+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded,+bulge,+bubble,+and+duplex+DNA+contexts.">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li><li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1,+yOGG1,+and+yOGG2.">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li><li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+(Ogg)+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination.">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence.">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li><li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY.">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li><li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+(MUTYH)+and+Y165C,+G382D,+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer.">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li><li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium(II):+implications+for+cadmium+genotoxicity.">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li><li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion.">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li><li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kinetik yaklaşımlar temel kinetik sabitleri tanımlamak için yöntemler ana hatlarıyla burada açıklanan. Ürün oluşumu, bir zaman süreci ilk enzimatik devir hızla meydana gelen iki fazlı ise, kimya sonra bir adım daha sonra katalitik devirleri sırasında oran-sınırlayıcı. OGG1 durumunda, birinci devir ya da (S &lt;E) veya (S&gt; e yüksek) DNA konsantrasyonları sınırlayıcı yüksek enzim konsantrasyonu kullanılarak ölçülebilir. İlk durumda, reaksiyon, bir &#39;tek-ciro&#39; sınırlıdır ve en...

Aerobik ortam genomik istikrarsızlık hızlandırır. Oksidatif stresten kaynaklanan önemli bir promutagenic DNA lezyon 7,8-dihidro-8-oxoguanine (8-oxoG) &#39;dir. Bu 8-oxoG en belirsiz kodlama potansiyelinin kaynaklanmaktadır. İnsan 8-oxoguanine DNA glikozilaz (OGG1) 8-oxoG baz eksizyon onarımı başlatmak için sorumludur. OGG1 glikozilaz aktivitesi apurinic sitesi (AP-sitesi) ile ürün DNA ile sonuçlanan 8-oxoG tabanı özel tüketim vergilerine. OGG1 Zayıf bir liyaz aktivite bazı durumlarda AP-sitesi insizyon olabilir. DNA glikolazdan kinetik karakterizasyonu genelde bifazik zamanlı kurslar sergi bulur. Ürün oluşumu bir ilk hızlı faz (yani patlama) sonra, doğrusal kararlı durum faz 1-3 görülmektedir. Bu davranış, bur ise, kimya (yani yapısal bir değişiklik veya ürün ayırma) arasında, zaman akışının lineer kısmı boyunca oran-sınırlayıcı olma aşağıdaki bir aşama göstergesidirgenellikle geçiş fazı olarak adlandırılan faz st, birinci reaksiyon döngüsü sırasında, enzim aktif bölgesinde ürün oluşumuna tekabül eder. Ürün sürümü kararlı durum aşamasında sınırlama oranı olduğunda, aktivite ölçümleri ürün DNA bağlanma afinitesi niteliksel bir ölçü sağlar, ancak enzim aktif bölge (yani kimya) de olaylarla ilgili kinetik bilgi vermemektedir. Buna göre, üstel öncesi kararlı durum patlama faz izole etmek ve ölçmek için yöntemler enzimin aktif bölge 4 ilk enzimatik devir sırasında olayları araştırmak için gereklidir. (1) kararlı durum, (2) öncesi kararlı durum ve (3) tek cirosu OGG1 katalitik davranışını karakterize etmek için üç standart kinetik yaklaşım vardır. Bu yaklaşımlar, reaksiyon karışımı içinde enzim konsantrasyonu ve her bir yaklaşımda kullanılan substrat oranı için enzim tarafından birbirinden farklıdır. Tipik bir kararlı durum yaklaşımda,bazen birden devir kinetik olarak adlandırılan, enzimin düşük konsantrasyonlarda ürün formasyonu takip etmek için kullanılır. Birden fazla enzimatik kaybı önemli alt tabaka konsantrasyonu etkilemez böylece substrat konsantrasyonu büyük ölçüde Enzim konsantrasyonu aşmaktadır. Bu durumda, zaman içerisinde doğrusal olmalıdır ve bir patlama bu yaklaşımda kullanılan düşük enzim konsantrasyonu nedeniyle ilk devir sırasında meydana gelen olmadığını ayırt etmek zordur; not genlik kayma Enzim konsantrasyonu eşdeğer olduğunu. Bu daha yüksek bir enzim konsantrasyonu kullanılarak ve ilk enzimatik cirosu hızla oluştu olup olmadığını tespit etmek için sıfır zaman doğrusal zaman ders extrapolating aşılabilir. Ordinat üzerinde kesişim noktası (y-ekseni), enzim konsantrasyonu ile orantılı olması ve aktif alt-tabaka ile enzimin yapan bir ölçüsünü sağlar gerekir. Bu yaklaşım, ilke olarak, bir kayma fazı varlığı için kanıt, dif sağlayabilir rağmenlara yaklaşım kayma fazı kinetiğini ölçmek için gereklidir. Birçok durumda patlama aşamasında el karıştırma ve soğutma teknikleri ile ölçmek için çok hızlı. Bu durumda, ön-kararlı durum ve tek cirosu kinetik (yani geçici kinetik) genellikle reaksiyon 5 erken zaman noktalarında takip etmek bir hızlı karıştırma ve soğutma cihazı gerektirir yaklaşır. Bir ön-kararlı durum yaklaşımda enzimin yüksek konsantrasyonlarda ürünün önemli bir miktarı, ilk devir sırasında oluşacak şekilde kullanılır. Birden fazla cirolar katalitik bisiklet (yani patlama aşağıdaki doğrusal faz) gözlemlemek için takip olduğundan, substrat konsantrasyonu enzim konsantrasyonu ([enzim] &lt;[yüzey]) daha büyüktür. Katalitik binme olmadan, enzimin aktif bölgesinde olayları izole etmek için, tek devir koşulları kullanılmaktadır. Bu durumda, alt-tabaka alt-tabakanın tüm i katılacak şekilde (E &gt;&gt; S) enzimi ile doymuşn &#39;tek cirosu&#39; ve genellikle tek üstel zaman tabii sergileyecek. Bir kayma fazı, ürün serbest (k off) sergileyen enzimler için yukarıda belirtildiği gibi çoğu zaman akışının kararlı durum faz hızını sınırlar. Ürün sürümü (v ss, kons. / Saat) oranı doğrusal kararlı durum faz eğimi tespit edilebilir. Aktif enzim konsantrasyonu (E) sabit bir iç Oranı ürün sürümü oranını dönüştürmek için gerekli olduğu k off = v ss / [E]. En önemlisi, aktif enzim konsantrasyonu kirleri nedeniyle ölçülen protein konsantrasyonu, etkin enzim, enzim olmayan üretken bir substrata bağlı ve protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılan yöntem, genellikle daha düşüktür. Ürün serbest yavaş olduğunda, aktif enzim konsantrasyonu patlama genlik belirlenebilir. Böylece, bir kararlı durum zaman tabii extrapolatingsıfır zaman gözlenen kararlı durum oranı k off (ürün sürümü) hesaplamak için gerekli aktif enzim bir tahmin sağlar. Kaymasının kinetiği ölçmek için, bir ön-kararlı durum yaklaşım doğrusal kararlı-durum faz önce meydana gelen ilk devir esnasında ürün oluşumunu takip etmek gereklidir. Patlama kinetik enzim ara ürünün oluşumu izler. Reaksiyon alt-tabaka ile enzimin karıştırma başlatılır Reaksiyon tamamlandıktan sonra sabit bir durum faz ulaşana kadar, enzim-ürününün miktarı hızla artmaktadır. Kataliz çok daha hızlı bir ürün serbest fazla ise, kayma genliği varsayarak, ürün substratm kimyasal dönüştürme hızına karşılık gelen denge aktif yapan enzim ve gözlemlenen üslü yaklaşım (k OBS) eşit olan bir tam tersi oranı kimya ihmal edilebilir düzeydedir. Bazı durumlarda katalitik cysarılmak gibi kimya ve ürün sürümü için oranları büyüklükleri önemli ölçüde farklı değil olduğu gibi bir ön-kararlı durum analizi, müdahale. Bu durumda, yüzeye aşırı enzim göre istihdam tek bir ciroya enzim ile bağlı katalitik bisiklet ve sınırları yüzey önler. Birinci derece hız sabiti (K OBS) Buna göre, birinci reaksiyon kimyasal adım izole edilebilir ve daha doğru bir şekilde tespit edilmiştir. Bu oran sabit bir atıl k benzer yukarıda tarif edilen ön kararlı hal yaklaşımdan belirlenmelidir. Burada bu kinetik yaklaşımlar OGG1 glikozilaz etkinliği analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

İnsan 8-oxoguanine DNA glikosilaz (OGG1) DNA mutajenik oksidatif DNA lezyon 8-okso-7 ,8-dihidroguanin (8-oxoG) excises. OGG1 kinetik karakterizasyonu 8-oxoG eksizyon ve ürün sürümü oranları ölçmek için yapılmaktadır. OGG1 konsantrasyonu yüzey DNA daha az olması durumunda, ürün oluşum zamanlı kurslar bifaziktir, ürün oluşumunun hızlı bir üstel faz (yani patlama) doğrusal kararlı durum faz takip eder. Ürün oluşumunun ilk patlama alt tabaka üzerinde düzgün bir şekilde yapan enzim konsantrasyonu karşılık gelir ve patlama genlik enzim konsantrasyonuna bağlıdır. Patlama sürekli birinci dereceden 8-oxoG eksizyon içsel oranı karşılık gelir ve yavaş kararlı durum oranı ürün sürümü (sürekli ürün DNA ayrışma oranı, k kapalı) oranını ölçer. Burada, kararlı durum, öncesi kararlı durum ve tek cirosu yaklaşımlar sp izole etmek ve ölçmek için tarifOGG1 katalitik devir esnasında ecific adımları. Bir floresan etiketli lezyon içeren bir oligonükleotit ve saflaştırılmış OGG1 hassas Kinetik ölçümleri kolaylaştırmak için kullanılır. Düşük enzim konsantrasyonları kararlı durum ölçümleri, reaksiyon reaktiflerin karıştırma manuel ve soğutma yapmak için kullanılan bu yana kararlı durum oranı (k off) tespit etmek için yapılabilir. Ayrıca, sıfır zamanda ordinat üzerinde bir noktaya kararlı durum oranı ekstrapolasyon ürün oluşumu bir patlama ilk sermaye (yani y-kesişim pozitif) sırasında oluştuğunu gösterir. Üslü kayma fazı sürekli birinci dereceden kararlı durum faz önce kısa zaman aralıklarında (&lt;1 saniye) de elde edilen ürünün miktarını inceler ve 8 hızına karşılık gelen bir hızlı karıştırma ve soğutma tekniği kullanılarak ölçülebilir -oxoG eksizyon (yani kimya). Katalitik bisiklet olduğu kimyasal adım, aynı zamanda, bir tek ciro yaklaşım kullanılarak ölçülebilirenzim (E&gt; S) ile doyurarak substrat DNA ile önlenebilir. Bu yaklaşımlar bir DNA lezyonun çıkarılması verimliliğini etkileyen temel hız sabitleri ölçebilirsiniz.

Kararlı durum kinetik analizi, bir Bradford protein deneyi 2 ile belirlenen 200 nM DNA alt tabaka ve OGG1 dört farklı görünen konsantrasyonları (15, 30, 45 ve 60 nM) kullanılarak gerçekleştirildi. Ürün oluşumu süresi içerisinde 2.2 idi y kesişim noktası, 11, 15, ve her bir protein konsantrasyonuna (Şekil 2B) göre, sırasıyla 26 nM, belirlemek için bir doğrusal eşitliğe oturtuldu. Y yakaladığını ayrıca, her biri gerçek protein konsantrasyonu (Şekil 2C)</st...

Watch this Scientific Journal Video about Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity at JoVE.com

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

8-oxoguanine DNA glikozilaz en glikozilaz aktivite için zaman kurslar ürün oluşumu ve doğrusal kararlı durum faz bir patlama gösteren bifazik bulunmaktadır. Sırasıyla 8-oxoguanine ve ürün DNA&#39;dan glikozilaz serbest çıkarılması karşılık bastırma-akım teknikleri, patlama ve kararlı durum oranları ölçülebilir, kullanılması.

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

19.2K Görüntüleme.  NIEHS, National Institutes of Health. 8-oxoguanine DNA glikozilaz en glikozilaz aktivite için zaman kurslar ürün oluşumu ve doğrusal kararlı durum faz bir patlama gösteren bifazik bulunmaktadır. Sırasıyla 8-oxoguanine ve ürün DNA'dan glikozilaz serbest çıkarılması karşılık bastırma-akım teknikleri, patlama ve kararlı durum oranları ölçülebilir, kullanılması.

Video: Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

DNA, Oksidasyon Biomarker HPLC ölçümü, 8-okso-7,8-dihidro-2&#39;-deoksiganozin, Kültürlenmiş Hücrelerde ve hayvansal dokular

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Kimya

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

DNA Origami Analiz ve Deney için Mika ve Silikon Yüzeyler Hazırlanması

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Paralel Basınç Reaktörleri ve Zincir Transferi Polimerizasyon bir Kinetik Analizi Etilen Polimerizasyonlar

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

İmalat ve fotonik termometreler test

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Disentangling yüksek mukavemetli kopolimer Aramid Elyaf mekanik özelliklerinin belirlenmesi etkinleştirmek için

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Otomatik sentez ve gerçek zamanlı kinetik değerlendirmesinin teknik yönü [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

NMR tabanlı aktivite bileşik Inhibisyonu belirlenmesi için Assays, ıC50 değerleri, Artifactual aktivite, ve Nükrenoside Ribohidolases tüm hücre aktivitesi

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

Tek DNA Moleküllerinden Kitlesel Paralel Protein Sentezi için Femtolitre Damlacık Dizisi

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident high-energy electron beam is rocked with the submicrometric pivot point fixed on a specimen. This method enables us to quantitatively derive the site occupancies and site-dependent chemical information of impurities or intentionally doped functional elements in a specimen, using energy-dispersive X-ray spectroscopy and electron energy-loss spectroscopy attached to a scanning transmission electron microscope, which is of significant interest to current materials science, particularly related to nanotechnologies. This scheme is applicable to any combination of elements even when the conventional Rietveld analysis by X-ray or neutron diffraction occasionally fails to provide the desired results because of limited sample sizes and close scattering factors of neighboring elements in the periodic table. In this methodological article, we demonstrate the basic experimental procedure and analysis method of the present beam-rocking microanalysis.

We provide a general outline of quantitative microanalysis methods for estimating the site occupancies of impurities and their chemical states by taking advantage of electron-channeling phenomena under incident electron beam-rocking conditions, which reliably extract information from minority species, light elements, oxygen vacancies, and other point/line/planar defects.