Ringraziamo il Dott. Julie K. Horton per la lettura critica del manoscritto e il Dr. Rajendra Prasad per utili suggerimenti e discussioni. Porzioni di questa ricerca sono stati originariamente pubblicati nel Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., &quot;sequenza di DNA effetti di contesto sulla attività Glycosylase di Human Glycosylase DNA 8-oxoguanine.&quot; J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Questo lavoro è stato sostenuto, in tutto o in parte, dal National Institutes of Health Research Project di Grant Z01-ES050158 nel programma di ricerca intramurale, NIEHS.

1. Preparazione di enzima e substrato di DNA <ol><li> Over-express OGG1 come proteina di fusione GST-in E. coli, utilizzano il GST-tag per la purificazione, e quindi rimuovere il GST-tag per scissione con HRV-3C proteasi (Figura 1) 6. </li><li> Acquistare la sintesi chimica 5&#39;-6-carbossifluoresceina (6-FAM) oligonucleotide marcato contenente un singolo residuo di 8-oxoG e il suo complementare senza etichetta oligonucleotide filamento. Gli oligonucleotidi 34-mer contengono un 8-oxoG alla posizione 17 della 5&#39;-end. Purificare questi oligonucleotidi mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide. </li><li> Preparare substrato DNA a doppio filamento contenente 8-oxoG miscelando 5&#39;-6-FAM oligonucleotide marcato con il suo filamento complementare ad un rapporto molare di 1:1.2 ricottura in tampone (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Porre il tubo in un galleggiante in acqua bollente per 5 min. Lasciare il tubo in posizione e poi lasciare che l&#39;acqua fredda lentamente per rTemperatura di oom (questo dura circa 2 ore). </li><li> Eseguire la preparazione del campione e l&#39;esperimento in condizioni di scarsa o minima di luce in modo da minimizzare photobleaching del marcatore fluorescente. </li></ol> 2. Misurazione dello stato stazionario decorso e le attività del sito Titolazione OGG1 2.1. Preparazione dei campioni e naturalmente il tempo di stato stazionario <ol><li> Preparare DNA substrato e OGG1 soluzioni separatamente nel tampone di reazione (50 mM HEPES, pH 7.5, 20 mM KCl, 0,5 mM EDTA e 0,1% di BSA) in provette da 1,5 ml microcentrifuga in ghiaccio. La concentrazione di DNA è di 400 nM e la concentrazione apparente di OGG1 è 30, 60, 90, o 120 nM come determinata mediante un saggio di proteina Bradford. Posizionare i tubi di reazione in un set di blocco termico a 37 ° C. Enzima pre-incubazione e soluzioni di DNA substrato separatamente a 37 ° C per 1 min. </li><li> Avviare la reazione mescolando volumi uguali di soluzioni substrato OGG1 e DNA da pipettaggio. Dopo aver mescolato queste soluzionizioni 1:1 (v / v), le concentrazioni finali sono 200 DNA nM e 15, 30, 45, o 60 nM OGG1, rispettivamente. Rimuovere aliquote (10 pl) ad intervalli di tempo e spegnere la reazione mescolando con 1 ml di 1 M NaOH. Come controllo per i corsi a tempo, 10 microlitri della miscela di reazione senza enzimatica viene miscelata con 1 ml di 1 M NaOH. </li><li> Posizionare i campioni di reazione in un blocco di calore ° C 90 per 5 min a fendere il prodotto risultante AP-site. Dopo il riscaldamento, aggiungere 1 ml di HCl 1 M per neutralizzare ogni campione. </li><li> Aggiungere un uguale volume (12 ml) di tampone di caricamento del gel (95% formammide, 20 mM EDTA, 0.02% bromofenolo, e 0.02% xilene cyanol) per ogni campione di reazione, e quindi mettere il composto in un blocco di calore impostato a 95 ° C per 2 minuti, quindi inserire la provetta immediatamente in ghiaccio. </li><li> Caricare i campioni (5 mL) su un gel di poliacrilammide denaturante 15% contenente 8 M urea in 89 mM Tris-HCl, pH 8.8, 89 mM di acido borico, e 2 mM EDTA. Il substrato ei prodotti spaccati sono ben separati dopocorrere il gel. </li></ol> 2.2. Imaging del gel <ol><li> Scansionare il gel utilizzando un imager che può rilevare il DNA marcato in modo fluorescente e visualizzare il substrato e le bande di prodotto. </li><li> Quantificare le bande dopo l&#39;imaging del gel. Si noti che alcuni sfondo scissione può essere osservato dopo il trattamento del substrato stesso con NaOH (Figura 2A). Sottrarre questo sfondo dalla quantità misurata di ciascun prodotto di reazione. </li></ol> 2.3. Analisi dei dati <ol><li> Tracciare la quantità di prodotto formato in ogni tempo di reazione (t) (Figura 2B). Analizzare i dati grezzi utilizzando l&#39;equazione 1 per determinare l&#39;ampiezza del burst (A 0, intercetta y) e la pendenza della fase di stato lineare (V ss). </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Tramal&#39;intercetta rispetto alla concentrazione totale di proteine ​​(cioè concentrazione dell&#39;enzima apparente; Figura 2C), che fornisce una misura della frazione attiva di enzima. Utilizzare un adattamento lineare con intercetta zero per fornire il fattore di correzione per determinare la frazione di enzima attivo. </li><li> Tracciare il tasso di stato stazionario rispetto alla concentrazione dell&#39;enzima attivo (Figura 2D), fornendo il prodotto costante di dissociazione tasso (cioè inclinazione della linea adattata). </li></ol> 3. Misurazione del tempo di pre-steady-state del corso Come mostrato in figura 2, la formazione del prodotto durante la fase di scoppio è troppo veloce misurare da miscelazione manuale e tempra. Quindi, uno strumento quench-flow rapido può fornire un metodo efficace per misurare reazioni rapide che si verificano sulla scala temporale millisecondo (Figura 3) 5. Lo strumento utilizza un motore controllato da computer per miscelare rapidamente unND placare reazioni dopo tempi di reazione specificate. Ad esempio, utilizzare un Kintek RQF-3 Rapid Strumento Quench-Flow per misurare la fase di scoppio iniziale e la successiva fase di stato di formazione del prodotto catalizzato da OGG1. Rapid Strumenti Quench-Flow sono disponibili da diversi produttori. 3.1. Preparazione del campione A parte preparare il substrato di DNA e OGG1 soluzioni in provette da 1,5 ml, come descritto in 2-1. Le concentrazioni di DNA e OGG1 attivi sono 400 nM e 80 nM. Ciò determina concentrazioni finali di 200 DNA nM e 40 nM OGG1 attivo dopo miscelazione 1:1 (v / v). 3.2. Preparazione di un rapido strumento di quench-flow <ol><li> Collegare un bagno di acqua circolante al rapido Instrument quench-flow per il controllo della temperatura (37 ° C). </li><li> Regolare i parametri dello strumento e selezionare il loop reazione appropriata per il tempo desiderato indica secondo istruzioni del produttorezioni. Le anse di reazione sono di lunghezza variabile per fornire tempi di reazione alternativi. </li><li> Preparare tampone di reazione e di NaOH placare le soluzioni in 10 ml luer lock siringhe monouso e allegare queste siringhe alle porte DRIVE e caricare i serbatoi di azionamento con tampone di reazione (siringhe B) e 142 mM NaOH (siringa Q) (Siringa Valvole di carico in posizione di carico) . Per rimuovere le bolle d&#39;aria dalla siringa, lavorano la soluzione avanti e indietro più volte. </li><li> Abbassare il motore passo-passo fino a quando viene a contatto con la parte superiore delle siringhe (siringhe valvole di carico e valvole di carico di esempio in posizione FIRE). </li><li> Lavare i loop di campioni, il ciclo di reazione, e l&#39;uscita di linea con acqua e metanolo. Asciugare le zone arrossate completamente (valvole in posizione di incasso). </li></ol> 3.3. Naturalmente il tempo di pre-stazionario <ol><li> Fare un foro nella parte superiore di un tubo da 1,5 ml con tappo usando un ago 16-gauge. Collegare un tubo in uscita di linea per raccogliere la reazione bonificato. </li><li> Impostare la reactio desideraton tempo (in secondi) utilizzando la tastiera. Il motore passo-passo il backup per regolare volume del loop in modo da mantenere il volume costante raffreddamento. Posizione pistoni per siringa B contro la piattaforma di motore passo-passo con l&#39;aggiunta di buffer con le siringhe monouso fissato alle porte dell&#39;unità. </li><li> Riempire 1 ml luer lock siringhe monouso con substrato di DNA e OGG1 soluzioni, rispettivamente (valvole di esempio nella posizione di carico). Fissare siringhe con substrato di DNA e OGG1 soluzioni per ciascuno dei porti di carico del campione, e quindi riempire i loop di campioni con substrato di DNA e OGG1 soluzioni, rispettivamente (campione Valvole di carico in posizione di carico). </li><li> Impostare tutte le valvole di carico siringa e campione Valvole di carico alla posizione di FUOCO. Avviare la reazione con un colpo della tastiera (ad esempio, premendo il tasto &quot;START&quot; &quot;G&quot; o). Substrato di DNA e OGG1 soluzioni (18 ml ciascuna) vengono immediatamente mescolati nel loop di reazione. </li><li> Attendere fino a quando la reazione si spegne automaticamente nel momento in reazione desiderata mescolando 36 ml di rmiscela eaction con 86 ml di NaOH 142 mm. Dopo tempra la reazione, il campione viene scaricata dal Exit Line. </li><li> Regolare le valvole di carico siringa in posizione LOAD e il campione di carico valvole nella posizione di Flush. Lavare i loop di campioni, il ciclo di reazione, e l&#39;uscita di linea con acqua e metanolo e asciugare come descritto in 3.2. Ripetere la procedura per ogni punto di tempo. </li><li> Eseguire un esperimento di controllo senza enzima per determinare una correzione di fondo, che può essere fatto manualmente o con lo strumento rapid-quench. Per eseguire un controllo con lo strumento rapido raffreddamento, riempire il loop di esempio per il DNA con substrato di DNA, ma mantenere il loop del campione per OGG1 vuoto. Impostare il tempo di reazione, eseguire il mix e dissetare come descritto in 3.3.4-3.3.6. </li><li> Lavare i loop di campioni e il ciclo di reazione con NaOH 2 M, 2 M HCl, acqua e metanolo e poi asciugare le linee lavati. Dopo aver impostato il motore passo-passo alla posizione iniziale, cambiare le valvole di carico siringa al positio LOADn e lavare i serbatoi di azionamento con acqua. </li><li> Trattare i campioni bonifica reazione con calore, e poi substrato separato e DNA prodotto da 15% elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide come descritto in 2.1. </li><li> Visualizzare e quantificare le bande sul gel come descritto in 2.2. </li></ol> 3.4. Analisi dei dati Montare relativi tempi di formazione del prodotto mediante analisi di regressione non lineare ad una equazione con crescenti termini esponenziali e lineare (Equazione 2) forniscono la costante di velocità di primo ordine (k obs), l&#39;ampiezza del burst (A 0), e un tasso lineare (V ss). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. Tempo singolo fatturato Corso <ol><li> Preparare DNA substrato e OGG1 in provette da 1,5 ml separati come descritto in 2-1. La concentrazionezioni di DNA e OGG1 attivi sono 100 nm e 500 nm, rispettivamente; questo produce concentrazioni finali di 50 nm DNA e 250 Nm OGG1 dopo la miscelazione 1:1 (v / v). </li><li> Preparare lo strumento di attenuazione del flusso rapido e la preparazione dei campioni di reazione come descritto in 3.2 e 3.3. </li><li> Trattare i campioni della reazione bloccata con calore e sottoporli al 15% denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide al substrato e prodotti separato come descritto in 2.1. </li><li> Visualizzare e quantificare le bande sul gel come descritto in 2.2. </li><li> Montare le andamento nel tempo della formazione del prodotto di un singolo esponenziale per determinare la costante di velocità di primo ordine (k OBS) come indicato nella equazione 3. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli approcci cinetici descritti qui delineare i metodi per definire le costanti cinetiche elementari. Se un corso di tempo di formazione del prodotto è bifasica con il primo turnover enzimatico verificano rapidamente, poi un passo dopo chimica è limitante durante le successive rotazioni catalitici. Nel caso del OGG1, primo turnover può essere misurata usando concentrazioni elevate di enzimi sia con limitatore (S &lt;E) o alto (S&gt; E) concentrazioni di DNA. Nel primo caso, la reazione è limitata ad un &#39;singolo ...

Un ambiente aerobico affretta instabilità genomica. Un grave lesione del DNA promutagena che si realizza derivanti da stress ossidativo è 7,8-diidro-8-oxoguanine (8-oxoG). Ciò è dovuto al potenziale codifica ambiguo di 8-oxoG. Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) è responsabile dell&#39;avvio base di riparazione per escissione di 8-oxoG. L&#39;attività glicosilasi di OGG1 accise della base 8-oxoG conseguente DNA prodotto con un sito apurinico (AP-site). Una debole attività liasi di OGG1 può incidere la AP-site in alcuni casi. Caratterizzazione cinetica di glycosylases DNA trova generalmente tale da presentare i corsi tempo bifasico. Dopo una fase iniziale di rapida formazione del prodotto (cioè burst), una fase di stato lineare si osserva 1-3. Questo comportamento è indicativo di un passo successivo di chimica (cioè cambiamento conformazionale o rilascio di prodotto) essendo limitante durante la porzione lineare del corso di tempo, mentre la fresast fase, spesso definito come la fase transitoria, corrisponde alla formazione del prodotto presso il sito attivo dell&#39;enzima durante il primo ciclo della reazione. Quando rilascio del prodotto è il tasso di limitare durante la fase a regime, misure di attività forniscono una misura qualitativa del DNA prodotto affinità di legame, ma non forniscono informazioni cinetica relativa eventi presso il sito attivo dell&#39;enzima (cioè chimica). Pertanto, sono necessari metodi per isolare e misurare la fase di pre-scoppio stazionario esponenziale per sondare eventi durante la prima turnover enzimatica a 4 sito attivo dell&#39;enzima. Ci sono tre approcci cinetici standard per caratterizzare il comportamento catalitico di OGG1, (1) allo stato stazionario, (2) pre-steady-state, e (3) un solo fatturato. Questi approcci differiscono l&#39;uno dall&#39;altro per la concentrazione di enzima nella miscela di reazione e l&#39;enzima di rapporto substrato utilizzato in ogni approccio. In un tipico approccio di stato stazionario,talvolta indicato come multipli cinetica fatturato, basse concentrazioni di enzima sono usati per seguire formazione del prodotto. La concentrazione del substrato supera notevolmente la concentrazione dell&#39;enzima modo che più fatturati enzimatiche non influenzano significativamente la concentrazione del substrato. In questa situazione, i corsi tempo dovrebbe essere lineare e spesso è difficile discernere se un burst avvenute nella prima turnover causa della bassa concentrazione di enzima usato in questo approccio, si noti che l&#39;ampiezza di scoppio è equivalente alla concentrazione dell&#39;enzima. Questo può essere superato utilizzando una concentrazione dell&#39;enzima superiore ed estrapolando il decorso lineare per tempo zero per rilevare se il primo turnover enzimatico verificato rapidamente. L&#39;intercetta sulle ordinate (asse y) deve essere proporzionale alla concentrazione dell&#39;enzima e fornisce una misura dell&#39;enzima attivamente impegnati con il substrato. Sebbene questo approccio può in linea di principio fornire prova dell&#39;esistenza di una fase di scoppio, una differenti approccio è necessario per misurare la cinetica della fase di scoppio. In molti casi la fase di scoppio è troppo veloce per misurare con tecniche di miscelazione e spegnimento manuali. In questa situazione, cinetico pre-stazionario e single-turnover (cioè cinetica transitoria) avvicina spesso richiedono uno strumento rapida miscelazione e tempra a seguire primi punti di tempo di una reazione 5. In un approccio pre-stazionario alte concentrazioni di enzima vengono utilizzati in modo che una quantità significativa di prodotto si forma durante la prima turnover. Poiché più fatturati vengono seguiti per osservare ciclismo catalitico (cioè la fase lineare che segue il burst), concentrazione del substrato è maggiore della concentrazione dell&#39;enzima ([enzima] &lt;[substrato]). Per isolare eventi al sito attivo dell&#39;enzima senza il ciclo catalitico, le condizioni single turnover sono utilizzati. In questo caso, il substrato è saturo di enzima (E &gt;&gt; S) in modo che tutto il substrato parteciperanno in la &#39;single fatturato&#39; e in genere mostrano un corso a tempo singolo esponenziale. Come notato sopra per gli enzimi che esibiscono una fase di scoppio, rilascio del prodotto (k off) spesso limita la velocità della fase di stato del corso tempo. Il tasso di rilascio del prodotto (. / Ora v ss, conc) può essere determinato dalla pendenza della fase di stato lineare. La concentrazione di enzima attivo (E) è necessaria per convertire la velocità di rilascio del prodotto per una costante di velocità intrinseca dove k off = v ss / [E]. È importante sottolineare che la concentrazione di enzima attivo è tipicamente inferiore alla concentrazione misurata proteina causa di impurità, enzima inattivo, enzima non legato a produttivamente substrato, e il metodo utilizzato per determinare la concentrazione di proteina. La concentrazione di enzima attivo può essere determinata dalla ampiezza scoppio quando rilascio del prodotto è lenta. Così, estrapolando un corso a tempo di stato stazionario pertempo zero fornisce una stima di enzima attivo necessari per calcolare k off (rilascio del prodotto) dal tasso di steady-state osservato. Per misurare la cinetica di scoppio, un approccio pre-stazionario è necessario seguire la formazione del prodotto durante la prima rotazione che avviene prima della fase di stato lineare. La cinetica di burst segue la formazione di enzima prodotto intermedio. Una volta che la reazione è avviata da miscelazione con substrato enzimatico, la quantità di enzima prodotto aumenta rapidamente finché la reazione raggiunge una fase di crociera. Se catalisi è molto più rapida di quella di rilascio del prodotto, l&#39;ampiezza del burst è uguale enzima attivamente impegnati e l&#39;approccio esponenziale osservata all&#39;equilibrio (k obs) corrisponde al tasso di conversione chimica del substrato a prodotto, ipotizzando che il tasso inverso chimica è trascurabile. In alcuni casi cy cataliticoaggrappano interferisce con un&#39;analisi pre-steady-state, ad esempio quando le grandezze delle tariffe per la chimica e la release del prodotto non sono significativamente differenti. In questo caso, impiegando enzima eccesso rispetto al substrato impedisce ciclismo catalitica e limiti substrato legato con enzima per un singolo turnover. Pertanto, la prima fase della reazione chimica può essere isolato e accuratamente determinato come la costante di velocità di primo ordine (k obs). Questa costante tasso dovrebbe essere simile a K obs determinata da un approccio pre-stazionario sopra descritto. Qui si descrive come questi approcci cinetici possono essere utilizzati per analizzare l&#39;attività glicosilasi di OGG1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) accise il mutageno ossidativo lesione del DNA 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) dal DNA. Caratterizzazione cinetica di OGG1 è intrapresa per misurare i tassi di escissione 8-oxoG e rilascio del prodotto. Quando la concentrazione è inferiore OGG1 DNA substrato, andamento nel tempo della formazione del prodotto siano bifasici, una rapida fase esponenziale (cioè burst) di formazione del prodotto è seguita da una fase di stato lineare. Il burst iniziale di formazione del prodotto corrisponde alla concentrazione di enzima agganciati bene sul substrato, e l&#39;ampiezza scoppio dipende dalla concentrazione di enzima. La costante del burst di velocità di primo ordine corrisponde alla frequenza intrinseca di escissione 8-oxoG e il tasso di stato stazionario lento misura il tasso di rilascio del prodotto (prodotto di DNA tasso costante di dissociazione, k off). Qui, descriviamo approcci allo steady-state, pre-steady-state, e single-fatturato di isolare e misurare sppassi ecific durante OGG1 ciclismo catalitico. Un oligonucleotide marcato fluorescente lesione contenente OGG1 purificati e sono utilizzati per facilitare misurazioni cinetiche precise. Poiché le concentrazioni enzimatiche basse sono utilizzate per effettuare misurazioni di stato stazionario, manuale miscelazione dei reagenti e tempra della reazione può essere eseguita per accertare il tasso di stato stazionario (k off). Ulteriormente, estrapolazione del tasso steady state ad un punto in ordinata al tempo zero indica che un burst di formazione del prodotto è verificato durante la prima turnover (cioè intercetta è positivo). La costante della fase di scoppio esponenziale di velocità di primo ordine può essere misurata usando una tecnica di miscelazione e tempra rapida che esamina la quantità di prodotto formato ad intervalli di tempo brevi (&lt;1 sec) prima della fase stazionaria e corrisponde al tasso di 8 -oxoG escissione (cioè chimica). Il passo chimica può anche essere misurata utilizzando un approccio a singolo giro d&#39;affari in cui il ciclismo catalitica èimpedito saturando DNA substrato con l&#39;enzima (E&gt; S). Questi approcci possono misurare le costanti di velocità elementari che influenzano l&#39;efficienza di rimozione di una lesione del DNA.

Analisi cinetica è costante viene eseguita utilizzando 200 nM DNA substrato e quattro differenti concentrazioni apparenti di OGG1 (15, 30, 45, e 60 nM), come determinato mediante un saggio di proteina Bradford 2. Relativi tempi di formazione del prodotto erano idonei ad una equazione lineare per determinare l&#39;intercetta, che erano 2,2, 11, 15, e 26 nM, rispettivamente, relativi a ciascuna concentrazione di proteina (Figura 2B). L&#39;Y-intercettazioni stati ulteriormente tracciate relati...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Corsi a tempo per l&#39;attività glicosilasi di 8-oxoguanine glicosilasi DNA sono bifasica esibendo una raffica di formazione del prodotto e una fase a regime lineare. Utilizzando tecniche di quench-flow, lo scoppio e le tariffe di stato stazionario possono essere misurati, che corrispondono ad escissione di 8-oxoguanine e rilascio della glicosilasi dal DNA prodotto, rispettivamente.

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

19.2K Views.  NIEHS, National Institutes of Health. Corsi a tempo per l'attività glicosilasi di 8-oxoguanine glicosilasi DNA sono bifasica esibendo una raffica di formazione del prodotto e una fase a regime lineare. Utilizzando tecniche di quench-flow, lo scoppio e le tariffe di stato stazionario possono essere misurati, che corrispondono ad escissione di 8-oxoguanine e rilascio della glicosilasi dal DNA prodotto, rispettivamente.

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

HPLC Misurazione del DNA ossidazione Biomarker, 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina, in colture cellulari e tessuti animali

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

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Chimica

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparazione di Mica e Silicon substrati per il DNA Origami Analisi e sperimentazione

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Polimerizzazione a etilene in reattori a pressione parallele e una analisi cinetica di polimerizzazione a catena Transfer

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Fabbricazione e collaudo di termometri fotonici

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Misura simultanea di HDAC1 e HDAC6 attività in HeLa Cells utilizzando UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Districante fibre di aramide copolimero ad alta resistenza per consentire la determinazione delle loro proprietà meccaniche

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

Assaggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione composta, i valori IC50, l'attività Artifactual e l'attività intera delle cellule

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident high-energy electron beam is rocked with the submicrometric pivot point fixed on a specimen. This method enables us to quantitatively derive the site occupancies and site-dependent chemical information of impurities or intentionally doped functional elements in a specimen, using energy-dispersive X-ray spectroscopy and electron energy-loss spectroscopy attached to a scanning transmission electron microscope, which is of significant interest to current materials science, particularly related to nanotechnologies. This scheme is applicable to any combination of elements even when the conventional Rietveld analysis by X-ray or neutron diffraction occasionally fails to provide the desired results because of limited sample sizes and close scattering factors of neighboring elements in the periodic table. In this methodological article, we demonstrate the basic experimental procedure and analysis method of the present beam-rocking microanalysis.

We provide a general outline of quantitative microanalysis methods for estimating the site occupancies of impurities and their chemical states by taking advantage of electron-channeling phenomena under incident electron beam-rocking conditions, which reliably extract information from minority species, light elements, oxygen vacancies, and other point/line/planar defects.

Analisi quantitativa del sito atomico dei difetti funzionali dei droganti/punti nei materiali cristallini mediante microanalisi potenziata dal canale elettronico