סקידמור הפקולטה הפיתוח גרנט מימן את ההכנה ופרסום של כתב היד הזה.

1. הרכבה עוברים (עם השלמת הטכניקה ויזואליזציה נבחרת, כגון Immunocytochemistry, הכלאה באתר, וכו &#39;) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עוברים בצלחת פטרי מלא 35 מ&quot;מ עם חיץ של בחירה (איור 1 א). הבחירה של חיץ מבוסס על הליך התיוג. בדרך כלל מאגרים מבוססי PBS מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, ובאמצעות מלקחיים, לאבטח את הראש עם זוג מלקחיים אחד תוך משיכת החלמון משם עם הזוג האחר (איור 1). לחלופין, השתמש בסיכת חרקים בבעל סיכת חרקים למשוך בעדינות את החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפוקר העובר (חוט דיג (0.41 מ&quot;מ קוטר) דבוק לאו צינור נימים או פיפטה פסטר) להעביר את העוברים לחלק מצלחת פטרי שאין לו הרבה פסולת חלמון (איורים 1C-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, לשאוב את העוברים בנוזל קטן ככל האפשר, וגרמתיently פיפטה אותם על גבי שקופית (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פתיל משם נוזל עודף באמצעות מעבדה לנגב. יש להימנע ממגע עם עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית לעוברים. לתוויות ניאון, השתמש מגיב antifade של בחירה. עבור אותות colorimetric, גליצרול 70% עשוי לשמש כמדיום גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפוקר העובר, לכוון את העוברים על צדם בשורות (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אחד &quot;טיפה&quot; של וזלין או גריז ואקום גבוה לכל פינה של coverslip (איור 1G). זה מונע נזק של עובר מדחיסה מוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip (צד וזלין למטה) על גבי עוברים (איור 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את coverslip בכל פינה עד שתקשורת ההרכבה (גליצרול 70% או מגיב הרכבה אנטי לדעוך) נוגע coverslip (איור 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, להוסיף עוד מדיה הרכבה על ידי pipetting ממש ליד coverslip, באמצעות pipettor בטווח של 20-200 מיליליטר. זה יהיה פתיל תחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מעבדה לנגב, נקי לחלוטין סביב coverslip. להיות בטוח שלא תפעילו לחץ על coverslip, כפי שהדבר יפגע בעוברים. אזור זה חייב להיות יבש ואין לי וזלין או תקשורת גוברת עליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח לק על ציפורניים כדי לאטום מסביב לקצה של coverslip (איור 1I). </li></ol>

<ol>
	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Wnt+signaling+using+Lithium+Chloride:+Inquiry-Based+Undergraduate+Laboratory+Exercises.">Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises.</a> Zebrafish. , (2012).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling.">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li><li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression.">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li><li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons.">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li><li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish.">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li><li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell.">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li><li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons.">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos.">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li><li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers.">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li><li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis.">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras:+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation.">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li></ol>

אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים גם עבור מחבר.

הרכבה לרוחב של הדמיה עזרי עוברי דג הזברה קבועה של התפתחות חוט השדרה. באמצעות הסרת חלמון הכדור, מרחק העבודה דרוש להדמיה מיקרוסקופית חריגה מצטמצם. תוצאות הנציג שלנו היו מוגבלות לבמה 24 hpf, לעומת זאת, טכניקה זו יכולה לשמש כתחילה כ18 hpf, אם כי העוברים קודם לכן קשים יותר לנתח בשל גודלו של העובר ואת השבריריות של הרקמה. טכניקה זו היא גם החלים על עוברים מבוגרים מ24 hpf. בעזרת הבהירות האופטית של דג הזברה העוברית, היכולת לבצע מסכי גנטיים קדימה, אחורה גנטיקה, וגישות מהונדסים, כמה תהליכים התפתחותיים עשויים להיחקר. זה כולל מדדי mitotic של אבות עצביים עם סמנים כמו BrdU ואנטי phospho-היסטון 4-6 מרס ודפוסים דרך ביטוי של סמני אב עצביים וגליה בפאקס, nkx, dbx, וFamilie olig1,4-6 ים. ריאגנטים שידווחו נחישות גליה ועצבית (כגון חלבון גליה חומצת fibrillary (GFAP) וHUC / D) 1,4,5,10 ניתן להשתמש. בידול תת עצבי ניתן לנתח דרך ביטוי של איון, VSX, engrailed, וגני gata 1,4-6. ולבסוף, ניתוח של האקסון הדרכה אפשרי באמצעות נוגדנים כגון אנטי טובולין acetylated, 3A10, וZnP-1 2,11,12. למרות שמערכות מודל חוליות אחרות (עכבר וחומוס) משמשים ללמוד פיתוח חוט השדרה, הצפייה בו זמנית היתרי דג הזברה היחידה של כל הצירים התפתחותיים בעובר ללא פגע. המגבלה הברורה לגישה זו היא כי העוברים קבועים, המונעת הדמיה לחיות. למעשה, הסרת (או לניזק) תוצאות החלמון במוות עוברי מהיר, ולכן זה לא ניתן להקטין את מרחק העבודה בעוברים חיים באמצעות טכניקה זו. עם זאת, שיתוף השדרה ההגדלה גבוההההדמיה rd בעוברי חיה אפשרית. על מנת לשמר את החלמון במהלך הדמיה חיות, ניתן להציב עוברים בשקופיות דיכאון, המספקים מרחב גדול יותר בין הדגימה וcoverslip. לחלופין, יכול להיות דבוק כמה coverslips x 22 מ&quot;מ 22 מ&quot;מ משני השקופיות של 3 x 1 בשקופיות מיקרוסקופיות. Coverslips לשמש &quot;גשר&quot; לcoverslip שמעליה. אם עוברים הם בנים יותר מ 18 hpf, tricaine משמשת כדי להרדים עוברים כדי למנוע תנועה. אמנם מרחק עבודה של 0.288 מ&quot;מ נדרש לעוברי deyolked ב24 hpf, כאשר עובדים עם עוברים חיים המשובצים בagarose, עם חלמונים שלמים, עדשה מיקרוסקופית עם מרחק עבודה של 3.3 מ&quot;מ מספיקה. לחלופין, תרבויות explant מקורם בעוברי deyolked ניתן דמיינו באמצעות טכניקת קיבוע קריש פלזמה 13. ניתן לצפות אוכלוסיות שונות של תאים באמצעות חלבוני ניאון מקודדים גנטי כגון GFP, mCherry, או photoconצבע vertible קאאד (עד כמה שם). יתר על כן, תאים שכותרתו fluorescently בתוך עובר chimeric ניתן לראות גם בגישה זו 14. טכניקת הרכבה עולה בקנה אחד שהיא יציב במשך חודשים היא כלי חיוני עבור ביולוגים התפתחותיים ותא. טכניקה פשוטה זו היא לשחזור, ומאפשרת השוואה קלה בין ניסויים ניסויים שונים. יתר על כן, את היישור של עוברים בשורות בקלות מאפשר זיהוי של עוברים ספציפיים לניתוח מאוחר יותר.

ויזואליזציה של חוט השדרה בדג הזברה היא מעוכבת על ידי מספר הגורמים. בשל העובי של somites שמעליה והמיקום הפנימי של חוט השדרה, במרחק ניכר עבודה ארוכה נדרש לפתרון סלולארי גבוה. חלמון הכדור (שהוא עדיין נוכח במהלך הנוירוגנזה שלבים מוקדמים) מגדיל עוד יותר את מרחק העבודה הנדרש, והוא נפגע בקלות על ידי לחץ של coverslip. בנוסף, שאריות מחלמון פגום אוסרת להדמיה ברורה של רקמות. למרות חתכים בציר dorso-הגחון (DV) הם אפשריים, הם לא בקלות מתירים הדמיה סימולטני בציר קדמי, אחורי (AP) 1. כדי להתגבר על המכשולים הללו, עוברים הם גזורים ורכובים על שקופיות. הליך זה מספק מספר יתרונות. ראשית, עוברי דג הזברה בקלות לשכב עם הצד לרוחב כלפי מעלה, המאפשר הדמיה ציר סוכנות הידיעות AP. שנית, הסרת Bal החלמוןl מקטין את מרחק העבודה הנדרש, ומגביל את הפסולת. שלישית, הליך התקנה זו מאפשר לשני ניאון ומיקרוסקופיה brightfield. רביעית, עוברים רכובים יציבים במשך חודשים על 4 מעלות צלזיוס, המאפשרים ויזואליזציה דגימה ממושכת. לבסוף, התקדמות של פיתוח מתרחשת בכי חלקים קדמי הם בוגרים יותר ממגזרים האחוריים. על מנת להבטיח כי מבוים hemisegments השדרה מתאים הם בהשוואה בין עוברים, רקמת somite שמעל משמשת כמדריך. לדוגמא, somite האחורית ביותר העשירית overlies hemisegment השדרה עשירית, שהוא שווה ערך מבחינה התפתחותית בעוברי בהתאמה במה. הליך הרכבה זו של עוברים ללא פגע מאפשר זיהוי קל של somites. אנו משתמשים בגנטיקה ובטכנולוגיות לדפוק למטה גנטיות כדי ללמוד את המכניזם של הדרכה האקסון בחוט השדרה המתפתח. בפרט, אנו קובעים כי robo2, robo3, וDCC נדרשים לCommissural הראשי ASCEnding (COPA) pathfinding האקסון. באמצעות הליך ההרכבה המתואר כאן, היינו יכול לבחון את צמיחת הגחון, מעבר קו האמצע, רוחב השליך, גב ו2,3 צמיחה הקדמי. הליך הרכבה זה גם יכול להיות מיושם על DV או דפוסים AP של חוט השדרה. יש לנו להשתמש בהליך זה כדי לקבוע תפקידים שונים של effectors Wnt במורד הזרם בדפוסי DV של חוט השדרה. באמצעות הרכבה זו, היינו יכול להשיג ברזולוציה של סמני DV ברמת התא הבודד, ולקבוע משמרות דפוסים דקה כתוצאה של קבלת אות Wnt שינתה 4,5. הליך הרכבה זו מאפשר גם לחישוב מדד mitotic באמצעות אנטי phosphohistone 3 או תיוג BrdU (ריבוי אב) בידול 5.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petri dishes 35mm X 10mm
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			25373-041
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Dumont Forceps #3
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			NC9839169
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Cover glass
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-541-B22X22-1.5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Slides
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-550-343
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			SlowFade Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			S36936
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			ProLong Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:116px;">
			P36934
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petroleum Jelly
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Any grocery store
			</td>
			<td style="width:116px;">
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Loop Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			80094-482
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Insect Pins
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26002-10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Nickel Plated Pin Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26016-12
			 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 
 
 
 
 
 
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Name of Equipment
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Catalog number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Olympus Stereo microscope
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:118px;">
			SZ61
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

חוט השדרה של דג הזברה הוא מודל חקירה יעיל למחקר מערכת עצבים מכמה סיבות. ראשית, יכולות להיות מנוצלים גנטי, מהונדס וגן גישות מציאה לבחון את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התפתחות מערכת עצבים. שנית, ציפורניים גדולות של עוברים מסונכרנים התפתחותית לספק גודל מדגם ניסוי גדול. שלישית, הבהירות האופטית של עובר דג הזברה מאפשרת לחוקרים לחזות אב, גליה, ואוכלוסיות נוירונים. למרות עוברי דג הזברה הם שקופים, עובי דגימה יכול לעכב להדמיה מיקרוסקופית יעילה. אחת סיבות לכך היא פיתוח טנדם של חוט השדרה ורקמות somite שמעליה. סיבה נוספת היא חלמון הכדור הגדול, שעדיין קיימות בתקופות של נוירוגנזה מוקדמת. במאמר זה, אנו מדגימים microdissection וההסרה של החלמון בעוברים קבועים, המאפשר להדמיה מיקרוסקופית, תוך שמירה על רקמות somite. אנו also להפגין הרכבת semipermanent של עוברי דג הזברה. זה מאפשר התבוננות בהתפתחות הנוירולוגית בצירי dorso-הגחון וקדמי, אחורי, כפי שהוא שומר על שלוש ממדי של הרקמה.

כאשר הבהרת המנגנונים העומדים בבסיס אירועים התפתחותיים שונים כגון דפוסים סלולריים, בידול, והאקסון הדרכה, חשוב להיות מסוגל לדמיין תאים בהקשר של הרקמות שלהם. פגמים דפוסים dorsoventral נוכחים בדרך כלל כשינוי הגחון או הגבי בתחום הביטוי של גורמי שעתוק בפאקס, nkx, או משפחות dbx 4. לעתים, שינויים יכולים להיות עדינים, הכוללים רק כמה קטרי תא 4. ניתוח חתך רוחב מאפשר סוג זה של ניתוח. עם זאת, חומרים כימיים עם אותות חלשים יותר, או חתכים שאינם בניצב לציר AP יכולים להגביל את הפרשנות. יתר על כן, ניתוח חתך רוחב לא לוקח בקלות בחשבון אם שינויים להתמיד בציר AP, ומסתמך על הזמינות של cryostat. מגבלה זו לעקיפה על ידי השקפות רוחביות של חוט השדרה. כפי שניתן לראות באיור 2 ב, nkx6.1 mRNA הוא דistributed בערך מחצית הגחון של חוט השדרה ב24 שעות לאחר הפריה (hpf), בתוך תחום האב. ובתאים וניתן להבחין מתאי הפוסט mitotic בשל נוכחותם של צלחת הרצפה, הנמצאת בחלק המדיאלי של חוט השדרה. צפו עם אופטיקה DIC, תאים בודדים הם להבחין בבירור, וגבול מוגדר בין ההבעה וnonexpressing תאים הוא מאליו. יציאת מחזור תא אב מלווה בשינויים בביטוי גנים. לדוגמא, כל הנוירונים לאחר mitotic להביע HUC / D שניתן לזהות עם 1,5 immunocytochemistry. בדיקות ה-mRNA לאיון, gata, ומשפחות VSX לתייג תאי עצב לאחר mitotic הספציפי של עמדה עקבית ומספר בתוך כל hemisegment חוט השדרה 6. בנוסף, קולטני האקסון הדרכה כגון אלה במשפחה רובו באים לידי ביטוי באוכלוסיות מוגבלות של נוירונים postmitotic (איור 2 ג) <sup&gt; 2,7,8. הרכבה לרוחב של עוברים מאפשרת ספירה מדויקת של תאי עצב לאחר mitotic. בדומה לכך, אבות שממשיכים להתחלק ניתן לכמת עם אנטי phospho-היסטון 3 immunocytochemistry כמו גם תיוג BrdU. יתר על כן, מוות של תאים ניתן להעריך עם תיוג Tunel 4-6. ב24 hpf, האקסונים של הנוירונים postmitotic הבאים יכולים להיות דמיינו עם שיטות שונות, וניתן להבחין ברמת התא הבודד: הגבי לרוחב עולה (דולה), Commissural הראשוני עולה (COPA), Commissural המשני עולה (קוזה), הגחון אורכית יורד (ולד), קולמר-Agdur (KA), Commissural מתפצל / אורך (קלח / ל &#39;), עולה היקפי (ה-CIA), היקפי יורד (CID), וחד קוטבי Commissural יורד (UCoD), Rohon-בירד (RB), motoneurons ( ז) 9. אקסונים להאריך מהנוירונים האלה בגב, הגחון, קדמי ואחוריים כיוונים. הם סניף, לחצות את קו האמצע, וצאו משני הגביוחוט השדרה הגחון. כאשר מצמידים עם מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה, התנהגויות סלולריות מגוונות אלה אנחנו רואים בעוברים רכובים רוחבי, באמצעות immunocytochemistry וחלבונים ניאון מקודדים גנטי כגון GFP 2. באיור 2 ד, immunocytochemistry ZnP-1 שימש תווית motoneurons המתפתח. Motoneurons לצאת מחוט השדרה ventrally למעצבב את שרירי פיתוח שמסביב. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. נתיחה ולרוחב הר של עוברי דג הזברה. () לאחר העיבוד לimmunofluorescence, הכלאה באתר, וכו &#39;, עובר ממוקמים בצלחת פטרי מלאה 35 מ&quot;מ עם PBT (PBS עם 0.5% טריטון X-100) או PTW (PBS עם 20-Tween 0.1%). החלמוןהכדור (י.ב.) בא לידי ביטוי. (ב) החלמון הוסר על ידי הבטחת ראשו של העובר ואחרי נתיחה זהירה. (C) פוקר עובר (חוט דיג דבוק לפיפטה פסטר) משמש לעוברים נפרדים ופסולת חלמון (ד &#39;). עוברים ניקו הם pipetted לשקופית מיקרוסקופ (E) ומיושר (F). הריבה (G) נפט מוחלת על הפינות של coverslip. (H) coverslip ממוקם בעדינות על גבי העוברים בהרכבה בינונית. לק (אני) משמש כדי לאטום את הקצוות של coverslip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; איור 2. אנליזה של דפוסי ביטוי גנים והאקסון pathfinding ברוחבית רכוב עוברי דג הזברה. () ציור של עובר דג הזברה ב24 hpf. בBD, בערך ארבעה hemisegments מעל הרחבה שק החלמון הם דמיינו (אזור בארגזים). (ב) nkx6.1 מתבטא בחוט השדרה הגחון, כולל צלחת הרצפה (FP). robo3 (C) מתבטא בתאי עצב postmitotic (PMN). אזור צלחת הרצפה ואב הוא לא בא לידי ביטוי במישור מוקד לרוחב יותר זה. בB, C, בעמוד השדרה מתוחם על ידי סוגר בצד שמאל של התמונה. (ד) מיקרוסקופ Confocal שימש לimmunofluorescence תמונת ZnP-1, אשר תוויות אקסונים מנוע יציאה מחוט השדרה ventrally. בכל התמונות, קדמי הוא בצד השמאל ועל הגב הוא עד. מרחק עבודה ארוך 40X, עדשת טבילה במים (NA 0.8) שימשה (3.3 מ&quot;מ).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development at JoVE.com

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  Skidmore College.  תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה. 

Video: Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...