מימון התקבל ממועצת המחקר האירופית במסגרת התכנית של הקהילה האירופית מסגרת השביעית (FP7/2007-2013) / הסכם גרנט ERC אין [239,603]

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת V (V) מורכב (איור 2); 18 התנהלות צעדים 1.1-1.4 בתא הכפפות, אם כפפת תיבה אינה זמינה, דלג לחלופת שלבים 2 (2.1-2.6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.42 מילימול של ligands H 2 L ב THF היבש ולהוסיף אותו לפתרון ערבוב של כמויות שווה ערך של VO (O i Pr) 3 בTHF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות, ולהסיר את נדיפים תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת הקסאן הקר ולהסיר אותו תחת ואקום. יש לקבל אבקה סגולה כהה בתשואה כמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 8 מ&quot;ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf. דלג לשלב 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מורכב V (V) באמצעות קו Schlenk. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.42 מילימול של L יגנד H 2 בTHF היבש בבקבוק Schlenk יבש עם כובע מחץ, לצרף קו Schlenk ולהחיל לסירוגין סביבות ואקום / גז אינרטי (N 2 או אר), מומלץ ליישם את שלושה sUCH סיבובים ולהמתין 2-5 דקות על שלבי הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת THF היבש באמצעות מזרק דרך פקק מחצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמויות שווה ערך של VO (O i Pr) 3 בתמיסת THF, שהוכנה באופן דומה על ידי משדלת בקבוק Schlenk יבש נכון לשורה, החלת סביבת אינרטי והוספת חומרים כימיים באמצעות מזרק מהפתרון ונדיום לזה של ליגנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות ולהסיר את נדיפים תחת ואקום, ואם יש חשש של מוצרים יציבים, לבצע זיקוק סוג Schlenk של נדיפים תחת אווירת אינרטי; להשתמש זרימת גז אינרטי לצרף הזכוכית הנדרשת שpredried . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת הקסאן הקר ולהסיר אותו תחת ואקום. יש לקבל אבקה סגולה כהה בתשואה כמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 8 מ&quot;ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Ti (IV) מורכב (איור 2); 28 </sעד&gt; התנהלות הצעדים 3.1-3.3 בתא הכפפות, אם כפפת תיבה אינה זמינה, להתאים את הצעדים חלופיים שנדונו לאנלוגי ונדיום (שלב 2) שמעסיקים קו Schlenk במקום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.35 מילימול של L יגנד H 2 בTHF היבש ולהוסיף אותו לפתרון ערבוב של כמויות שווה ערך של טי (O i Pr) 4 בTHF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. הסר את נדיפים תחת ואקום כדי לתת מוצר צהוב בתשואה כמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 8 מ&quot;ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת HT-29 תאי צלחת 96 היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HT-29 תאים בבקבוק 2 75 סנטימטר עם מדיום RPMI-1640 המכיל פניצילין / אנטיביוטיקה 1% סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, ו10% בסרום שור העובר (FBS), על 37 ° C עם 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום כאשר HT-29 התאים מגיעים confluency המקסימאלי (90-100%, כל 3-4 ימים ללא תת). לשטוף עם 1 מיליליטרפתרון של טריפסין (0.25%) / EDTA (0.05%) ולהסיר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של טריפסין (0.25%) פתרון / EDTA (0.05%) ו דגירה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את HT-29 התאים מהבקבוק ולהוסיף 10 מיליליטר של המדיום כדי להשבית את פעילות טריפסין. להעביר 5 מיליליטר של תערובת התאים לצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה להעביר כמה טיפות של תערובת התאים לתוך תא דלפק. קאמרי הדלפק כולל 5 x 5 ריבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ב5 ריבועי נציג באמצעות מיקרוסקופ: 4 ריבועים בפינות והאחד שהוא באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום המשוער של תאים קיימים. סיכום התאים ב5 ריבועי הנציג ולחלק ידי 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים 0.6 ידי התוצאה של צעד 4.7. המספר שקיבל הוא כמות תערובת תא הנדרשת לכל צלחת. חישוב זה מתייחס לצלחת המכילה 0.6 x 10 6 תאים (9,000 תאים לכל היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה להעביר את כמות התערובת הדרושה לכל תא p(200 μl לכל טוב × 66 בארות) באיחור (כפי שמחושב בסעיף 4.8) ולהוסיף 13.2 מיליליטר של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את התערובת לצלחת 96 היטב על ידי פיפטה 11 ערוצים (200 μl לכל טוב, 6 קווים, 66 בארות בסך הכל). גם אחד של כל שורה צריך להישאר ריקים לבקרה ריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדרת התרכובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl (או כמות שונה בהתאם לטווח הריכוז הרצוי) של THF היבש עד 8 מ&quot;ג של כל מתחם שקל כפי שמתואר בשלב 1.4 (או 2.6) או 3.3. שוקל 8 מ&quot;ג L יגנד H 2, יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל כל פתרון מתחם נוסף על ידי הוספת 60 μl של THF ב9 מבחנות אפנדורף שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עם טפטפת 60 μl מהתערובת בסעיף 5.1 לבקבוקון אפנדורף הראשון, resuspend והעברת 60 μl לבקבוקון הבא, וכן הלאה עד 10 ריכוזים שונים הם obtained (כולל תערובת ההורה בסעיף 5.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 20 μl של כל ריכוז בTHF עם 180 μl של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שליטה עם THF בלבד; 20 μl של THF עם 180 μl של מדיום בכל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl מהפתרון שהתקבל (כולל שליטת THF), לכל טוב שכבר מכיל 200 μl של הפתרון הנ&quot;ל של תאים במדיום לתת ריכוזים סופיים של המתחם של עד 200 מ&quot;ג / ליטר (יכול טווח הריכוז להיות שונה בהתאם לפעילות במתחם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה יכול לראות כמה משקעים בריכוז הגבוה ביותר מיושם בהתאם למסיסות המתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על כל מדידה של 3x המתחם (3 קווים בצלחת של אותו מתחם); כל שורה מכילה: תאים שטופלו במתחם ב10 ריכוזים שונים, 1 תאים המכילים גם טופלו בממס רק לבקרה ול1 גם ללא תאים לריקים שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת העמוסה במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 אווירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת cytotoxicity באמצעות assay MTT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון MTT על ידי הוספת 1 גרם של אבקת MTT לפתרון 200 מיליליטר של מדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום. פתרון המניות יכול להיות מחולק ל15 צינורות מיליליטר ומאוחסן -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של פתרון MTT לכל פיפטה 11 ערוצית באמצעות היטב (פרט לבארות שליטה הריקה ללא תאים מצעד 4.10), ו דגירה את הצלחת למשך 3 שעות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון הבינוני מכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של isopropanol היטב כל אחד לפזר formazan. מערבבים את הצלחת ל0.5 שעה עד שיגיע homogeneousness. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה ב 550 ננומטר ל200 μl של הפתרון האמור על ידי ספקטרופוטומטר microplate קורא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על כל מדידה (הכולל 3 חזרות, ראה שלב 5.8) ב -3 ימים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב tהוא אחוז של כדאיות תא על ידי ניכוי הערך ספיגת שליטה הריקה מהערך הנמדד, חלוקת התוצאה על ידי הספיגה של ערך שליטת ממס THF והכפלה ב100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב IC 50 ערכים באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה (או שווה ערך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IC דיווח 50 הוא הממוצע של כל IC 50 הערכים שנאספו על לפחות שלושה ימים שונים, ואת ערך השגיאה הוא סטיית התקן. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development.">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).</li><li>Hatok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+the+evaluation+of+drug+resistance+in+tumor+cells.">In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells.</a> Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).</li><li>Wang, D., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+processing+of+platinum+anticancer+drugs.">Cellular processing of platinum anticancer drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).</li><li>Muggia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platinum+compounds+30+years+after+the+introduction+of+cisplatin:+Implications+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).</li><li>Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+trends+for+metal+complexes+with+anticancer+activity.">New trends for metal complexes with anticancer activity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).</li><li>Ott, I., Gust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+platinum+metal+complexes+as+anti-cancer+drugs.">Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs.</a> Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).</li><li>Desoize, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metals+and+metal+compounds+in+cancer+treatment.">Metals and metal compounds in cancer treatment.</a> Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).</li><li>Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumour+metal+compounds:+more+than+theme+and+variations.">Antitumour metal compounds: more than theme and variations.</a> Dalton Transactions. , 183-194 (2008).</li><li>Mel&#233;ndez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+complexes+in+cancer+treatment.">Titanium complexes in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).</li><li>Evangelou, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanadium+in+cancer+treatment.">Vanadium in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).</li><li>Djordjevic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+vanadium+compounds.">Antitumor activity of vanadium compounds.</a> Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).</li><li>Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+titanium+agents.">Anticancer titanium agents.</a> Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).</li><li>Caruso, F., Rossi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+titanium+compounds.">Antitumor titanium compounds.</a> Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).</li><li>Kostova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+and+vanadium+complexes+as+anticancer+agents.">Titanium and vanadium complexes as anticancer agents.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).</li><li>Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+Titanium(IV)+Complexes:+Renaissance.">Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance.</a> European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).</li><li>Buettner, K. M., Valentine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinorganic+Chemistry+of+Titanium.">Bioinorganic Chemistry of Titanium.</a> Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).</li><li>Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+antitumor+activity+of+highly+resistant+salan-titanium(IV)+complexes+in+nanoparticles:+an+identified+active+species.">High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).</li><li>Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+cytotoxic+vanadium(V)+complexes+of+salan+ligands;+insights+on+the+role+of+hydrolysis.">Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis.</a> Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).</li><li>Tzubery, A., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+Hydrolysis+of+trans-Ti(IV)+Complexes+of+Salen+Ligands:+Structure-Activity+Relationship+Studies.">Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies.</a> Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).</li><li>Tshuva, E. Y., Peri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+cytotoxic+titanium(IV)+complexes;+Insights+on+the+enigmatic+involvement+of+hydrolysis.">Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis.</a> Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).</li><li>Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cytotoxic+reagents+based+on+non-metallocene+non-diketonato+well-defined+C-2-symmetrical+titanium+complexes+of+tetradentate+bis(phenolato)+ligands.">Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cellular+Growth+and+Survival+-+Application+to+Proliferation+and+Cyto-Toxicity+Assays.">Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).</li><li>Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Toxicity+of+Nanogenomedicine+in+MCF-7+Cell+Line:+MTT+assay.">Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).</li><li>Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hepatic+subcellular+fractions+for+Alamar+blue+and+MTT+reductase+activity.">Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity.</a> Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).</li><li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cell-Growth+and+Survival+-+Modifications+to+the+Tetrazolium+Dye+Procedure+Giving+Improved+Sensitivity+and+Reliability.">Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).</li><li>Alley, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+drug+screening+with+panels+of+human+tumor+cell+lines+using+a+microculture+tetrazolium+assay.">Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.</a> Cancer Research. 48, 589-601 (1988).</li><li>Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+note+on+the+use+of+cytotoxicity+assays.">A practical note on the use of cytotoxicity assays.</a> International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).</li><li>Chmura, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+4+complexes+with+aminebisphenolate+ligands+and+their+application+for+the+ring+opening+polymerization+of+cyclic+esters.">Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters.</a> Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).</li><li>Sebaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+accurate+EC50/IC50+estimation.">Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.</a> Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).</li><li>Yung, W. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Chemosensitivity+Testing+and+its+Clinical-Application+in+Human+Gliomas.">In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas.</a> Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).</li><li>McCarthy, N. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה המתוארת בכתב היד הזה משלבת סינתזה כימית עם assay כדאיות תא ביולוגי. כמו בכל שיטות ביולוגיות הנוגעות לתאי קיימא, הוא חיוני לעבודה בברדס למינרית, ולשמור על תנאים סטריליים, כוללים השימוש בממסים אורגניים סטרילי. כמו כן, הכנה ואחסון של תרופות על בסיס לא יציבה hydrolytically מתכת צריכה להתבצע בתנאי אינרטי, שעבורו צריכה להיות מנוצלים טכניקות תא הכפפות או קו Schlenk. הבחירה של הטכניקה לעבוד תחת סביבת אינרטי היא בעיקר תלויה בזמינות של תא הכפפות. אם אחד זמין, כל הסינתזות שדורשות תנאי טמפרטורת חדר הם מאוד נוחים לבצע בו. סינתזות הדורשות חימום בדרך כלל נלקחו מהקופסה בבקבוק Schlenk ומצורפות אל קו Schlenk. איפה כפפת תיבה אינה זמינה, יכולות להתבצע כל המניפולציות עם כלי זכוכית שנבחרו בקפידה על Schleשורת nk, תוך שימוש בואקום / גז אינרטי (N 2 או אר) מניפולציות כדי לשמור על אווירה יבשה. בתהליך הערכת cytotoxicity, יש צורך לבחון את המראה של התאים לאורך כל הניסוי. לפני תחילת הניסוי, מדיום הגידול של תאים חסיד בריאים צריך להיות ברור. תרבות מזוהמת תופיע עכורה. כמו כן, לאחר הדגירה של התאים עם טריפסין-EDTA, התאים צריכים להתנתק מהבקבוק ולטבול את הסוללה בינונית. אם רוב התאים להישאר דבק הבקבוק, הבקבוק צריך להיות מודגרות נוסף במשך כמה דקות. אורכו של מדידה אחת כזו הוא חמישה ימים. אנו מאפשרים ליום אחד לתאים חסיד לצרף ולהסתגל לצלחת התא, ושלושה ימים לדגירה של התאים עם התרופות שנבדקו על מנת לאפשר לתאים כדי להמשיך לאפופטוזיס. יום נוסף נדרש לדגירת עם MTT. כל measureme זהNT יש לחזור לפחות עוד פעמים בימים שונים החל מתרביות תאים שונות, במטרה למדידות כדי להיות עצמאיות. הטכניקה כפי שמתואר במסמך זה מוחלת על סוגים חסיד תא. על מנת ליישם את השיטה על סוגי nonadherent תא מספר התאמות צריכה להתבצע. הוא כבר לא נדרש להקדיש יום אחד לתאים לצרף ולהסתגל לצלחת התא, ולכן ההכנה של הצלחת והתוספת של התרופות שנבדקו יכולים להיות מושלמת באותו היום. בנוסף, בשלב הסופי של המדידה, רק לאחר הדגירה של התאים עם MTT, הפתרון צריך להיות centrifuged לפני הסרת בינונית ותוספת של isopropanol. אפשר גם להחליף את הניצול של MTT כסמן של תאים חיוניים עם assay חלופי לעיכוב צמיחת תאים, שבו זמן הדגירה של התאים עם הסמן הוא קצר יותר מאשר לאכובע עם 30 MTT. גורם נוסף שיש לשקול בעת בחירת הסמן הוא מנגנון פעולה האפשרי של התרופה נבדקה 27. Assay MTT מספק מידע על פעילות המטבולית מיטוכונדריה, וכי הוא תלוי בתגובות אנזימטיות, ניתן להשפיע עליו על ידי מעכבי אנזים. השילוב של הכנת תרופה עם ההערכה של cytotoxicity באמצעות assay MTT מייצג שיטה יעילה לפיתוח תרופות ציטוטוקסיות המבוסס על מתכת חדשה. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת כל מידע לגבי מנגנון המוות של תאים, השלב במחזור התא שמושפע מהסמים והמטרות הביולוגיות האפשרית שלו. למטרות אלה שיטות נוספות, כגון יודיד Propidium (PI) ספיגה Assay וניתוח מחזור התא צריכה להתבצע ביום 31.

כימותרפיה היא עדיין אחד הקורסים העיקריים של טיפולים המועסקים במרפאת למחלות סרטן שונות, ובכך כמות עצומה של מחקר שנערכה ברחבי העולם במטרה לפתח תרופות נגד סרטן חדשים ומשופרות. מחקרים כאלה בעיקר להתחיל ברמה הכימית, עם העיצוב והכנה של תרכובות, ואחריו הערכה ביולוגית של התכונות ציטוטוקסיות במבחנה. כדאיות תא עשויות להיות מוערכות על ידי מבחני שונים המספקים מידע על פעילות תאית 1-2. ציספלטין הוא דוגמא מורכבת פלטינה כי נעשה שימוש נרחב כתרופה כימותרפית, הנחשבת לטיפול יעיל בעיקר לסרטן אשכים ושחל 3-4. עם זאת, הטווח שלה צר פעילות ותופעות לוואי חמור לעורר מחקרים של קומפלקסי מתכות מעבר חזק אחרים 5-8. בין יתר, טיטניום (IV) ונדיום מתחמים (V) הראו תוצאות מבטיחות של פעילות גבוהה והקטינורעילות 9-16. טי (IV) מתחמים היו הראשונים להיכנס לניסויים קליניים לאחר ציספלטין בשל מאפיינים אלה, עם זאת, הם נכשלו בניסויים בשל קשיי ניסוח וחוסר יציבות hydrolytic. יש אפוא צורך הנוכחי לפתח נגזרים משופרים של מתחמי מתכת אלה שעשויים לשלב פעילות אנטי סרטנית גבוהה עם עמידות למים 15,17-21. אתגר בהכנה של טי (IV) ו-V (V) מתחמים מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic של ריאגנטים המבשר, ולכן, יש לשמור אווירת אינרטי. ההכנה של טי (IV) ו-V (V) תרכובות מתבצעת בתנאי N 2 או אר בתא הכפפות או תוך שימוש בטכניקות שורת Schlenk. שיטה נפוצה אחת לצורך ההערכה של הפעילות אנטי סרטנית מבוססת על MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) רומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay. assay זה assay כדאיות colorimetric שהוצג ב1983 על ידי Mosmann22. הוא מאוד נחקר היטב ומאופיין, והיא נחשבת יעילה ביותר כאשר אנו מעריכים את האפקטיביות של תרכובות ציטוטוקסיות חדשות בשל הדיוק שלו, מהירות, ויכולתה להיות מיושמת במגוון רחב של שורות תאים. assay כדאיות זה מבוסס על שינוי הצבע של מולקולת MTT כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. מדידה של הספיגה, שהוא פרופורציונאלי למספר תאי קיימא, והשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה, מאפשרת הערכה של יכולות עיכוב צמיחת תאים של המתחם שנבדק. Assay colorimetric MTT מתנהל במתכונת צלחת 96 היטב 23. התאים עשויים לדרוש preincubation בבארות לפני התוספת של התרופה הנבדקת. הפעמים preincubation עשויות להשתנות 0-24 שעה בהתאם למאפייני הקו הסלולרי. תאים בדרך כלל נחשפו לתרופה ל24-96 שעות בהתאם לפעילות התרופה. פתרון MTT הוא הוסיף אז לתאים שטופלו, שבו לצעוקow MTT מצטמצם formazan הסגול על ידי מגוון של אנזימים של המיטוכונדריה וcytosolic כי הם מבצעיים בתאי קיימא (איור 1) 24. מולקולת MTT לא מצטמצמת על ידי תאים מתים או תאי דם אדומים (מטבולית תאים לא פעילים), תאי טחול (תאי מנוחה) ולימפוציטים מגורה concanavalin (תאים הופעלו) 22. אחרי 3-4 שעות של דגירה עם MTT משקעים formazan. היווצרות formazan מתחילה אחרי 0.5 שעות של דגירה, אבל עבור תוצאות אופטימליות עדיף לחשוף את התאים לMTT לפחות 3 שעות 22. כתוצאה מכך, הגידול הבינוני מוסר וformazan הוא מומס בממס אורגני, רצוי isopropanol 25, למרות DMSO יכול לשמש גם 26. חיסולו של המדיום הוא חיוני להשגת תוצאות מדויקות מאז פנול אדום, שהוא נפוץ באופן נרחב במדיום גידול, והאצת חלבונים יכולים להפריע למדידת ספיגת 25. כאשר הפורםפתרון זאן מגיע הומוגנית, הספיגה של הפתרון נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר microplate קורא. הספיגה ב 550 ננומטר עומד ביחס ישר למספר התאים בטווח של 200-50,000 תאים לכל טוב, ולכן ניתן לאתרם כמויות קטנות מאוד של תאים 22. הספיגה מציינת את כמות תאי קיימא שנותרה לאחר טיפול בתרופה, והוא לעומת הספיגה של תאי בקרה שלא נחשפו לתרופה. ניתוח התוצאות על ידי תוכנה מתאימה מספק (ריכוז עיכוב; 50%) IC 50 ערכים והשגיאות הסטטיסטיות שלהם מבוססים על מספר חזרות של המדידה. Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity להקרנת תרכובות אנטי סרטניות חדשות, בשל דיוקה ופשטות יחסית. עם זאת, בעת שימוש assay MTT, אשר היה תלוי בתגובה האנזימטית, יש לקחת בחשבון כי מעכבי אנזים שונים יכולים להשפיע על ההפחתה של MTTd להוביל לתוצאות שגויות 27. בנוסף, assay MTT אינו מספק כל מידע על המנגנון המולקולרי של הפעילות ציטוטוקסית של התרופה 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane AR</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830122313</td>
			<td>Dried using a solvent drying system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol AR</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830111370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotics</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI without phenol red</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF) AR</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830156391</td>
			<td>dried using a solvent drying system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti(OiPr)4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>205273-500ML</td>
			<td>moisture sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VO(OiPr)3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>404926-10G</td>
			<td>moisture sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette 30-300 &#956;l</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette 5-50 &#956;l</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flask</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate with lid (flat bottom)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>APT.line C150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counter chamber</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf vial</td>
			<td>KARTELL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box</td>
			<td>M. Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ADS LAMINAIRE</td>
			<td>OPTIMALE 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Tek</td>
			<td>El-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20-200 &#956;l</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 5-50 &#956;l</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anticancer metal complexes: synthesis and cytotoxicity evaluation by the mtt assay

מתחמי טיטניום (IV) ונדיום (V) הם סוכנים אנטי סרטני חזקים מאוד. אתגר בסינתזה שלהם מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic, ולכן ההכנה שלהם צריכה להתנהל תחת אווירת אינרטי. הערכה של הפעילות אנטי סרטנית של מתחמים אלה יכול להיות מושגת על ידי assay MTT. Assay MTT הוא assay כדאיות colorimetric מבוסס על הפחתה האנזימטית של מולקולת MTT לformazan כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. התוצאה של הירידה היא שינוי צבע של מולקולת MTT. מדידות ספיגת יחסית לשליטה לקבוע את אחוז שנותר תאים סרטניים קיימא לאחר הטיפול שלהם בריכוזים שונים של מתחם שנבדק, אשר תורגם לפעילות אנטי סרטנית המתחם וIC 50 ערכיה. Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity בשל הדיוק שלו, מהירות ופשטות היחסית. במסמך זה אנו מראשנשלח פרוטוקול מפורט לסינתזה של תרופות המבוססות על אוויר מתכת רגישה ומדידות כדאיות תא, כולל הכנה של צלחות התא, דגירה של התרכובות עם התאים, מדידות כדאיות באמצעות assay MTT, והנחישות של IC 50 ערכים.

מתחמים הוכנו על בסיס נהלים שנקבעו 18,28 וטוהר שלהם עשוי להיות מוערך על ידי ניתוח NMR ויסודות. הנתונים שהתקבלו מassay MTT מנותח להעריך cytotoxicity של המתחם 18,21. ראשית, חיסור של הערך ספיגת שליטה הריקה מכל הערכים האחרים מתבצע. שנית, ערך שליטת ממס THF מוגדר כדאיות 100%, כפי שאין צמיחת עיכוב מתחם נוספת. כל הערכים האחרים הופכים אחוז הכדאיות בהתאם לשליטה. הריכוזים שיושמו ואחוז הכדאיות היחסי מחושב אז מוכנס לתוך תוכנת GraphPad פריזמה (או שווה הערך) כדי לקבוע את IC 50 הערכים הבוסס על רגרסיה ליניארית של שיפוע משתנה (ארבעה פרמטרים) מודל (איור 4, טבלת 1) 29. המדידות צריכה להתבצע על מגווןשל ריכוזים שיפיקו גרף מוצגות חלוקה שווה נקודה: לפחות שלוש נקודות בכל רמה ושלוש נקודות כדי להגדיר את המדרון (איור 3, גרף). מדידות מספיקות בריכוזים גבוהים או ריכוזים נמוכים (איור 3, גרף ב &#39;) תפגע בכושר רגרסיה ליניארית של העקומה הנדרשת לקביעת IC 50 ערכים, וכתוצאה מכך, מפחיתות את הדיוק שלהם. IC 50 ערכים יחסי, כפי שנקבעו על ידי רגרסיה ליניארית 29 כושר, מתאימות לריכוזים מובילים ל50% מעיכוב צמיחת תאים אפשרי על ידי המתחם שנבדק, המחושב כנקודת אמצע בין המקסימאלי וכדאיויות תא מינימליות שנמדדו (לא בהכרח 100% ו -0%, בהתאמה, ראו איור 3, גרף ג, א). לדוגמא, אם מתחם מעכב רק 60% מתאי גידול יחסי לשליטה (ו 0% בריכוז נמוךים), 50 IC היחסי שלה הוא הריכוז שמוביל ל30% עיכוב ביחס לשליטה. ערכי השגיאה צריכים לשקף את הסטייה של התוצאות שהתקבלו לחזרות שונות מהערך IC 50 הממוצע שדווח, שנלקחו כמחלות המין. בנוסף, יש לדווח על ערכי עיכוב צמיחת תאים מקסימאלי (%), כפי שמחושבים על ידי הפחתה מ100% הכדאיות המינימלית שנמדדה. ניתוח חלופי עשוי לכלול קביעת IC 50 ערכים מוחלטים. אלה מתאימות לריכוזים מובילים ל50% ביחס עיכוב צמיחת תאים לשליטת 100%, ללא קשר לכדאיויות התא המקסימאלי ומינימאליים שנמדדו. יכולים להיות גם נגזרים ערכים כזה על ידי מודל רגרסיה שאינו ליניארי. כערכים אלה הם מוחלטים, שדיווחו על ערכי עיכוב צמיחת תאים מקסימאלי הוא אופציונלי. כמתואר באיור 3, גרף C, תרכובת עשויה להיות פעילות נמוכה יחסית במונחים של g תא המקסימאלימאפייני עיכוב rowth (עקומה), ועדיין מפגין ערך IC 50 יחסי שהוא נמוך לא רק ממה המוחלט אחת שלה, אלא גם מזו של תרכובת המגיעה קרוב ל100% עיכוב גדילה (עקומה ב). זה יקר מאוד וכך להציג את העקומה יחד עם IC 50 ערכים המדווחים מכל סוג. כאשר בודקים את התוצאות של הניסויים שתוארו בפרוטוקול (איור 4, טבלת 1), ברור שציספלטין וקומפלקסי LTI (O i Pr) 2 וVO (O i Pr) הם מאוד פעילים. זה גם בולט, כי ערך העיכוב המקסימאלי הקרוב יותר של מתחם נתון הוא ל100%, קרוב יותר IC 50 הערך היחסי הוא מוחלט אחת. כאשר משווים את IC 50 ערכים בין התרכובות השונות, יש לו את טי (IV) המורכב cytotoxicity הגבוה ביותר וIC 50 הערכים שלה נמוכים מאלה של ציספלטין ו V המורכב (V). עם זאת, freמוצגי יגנד דואר במידה ניכרת פעילות מופחתת, שכן בעקבות תוספת של ליגנד בריכוזים שונים, כדאיות התא לא לרדת באופן משמעותי כפי שהיא עושה למתחמים שלה. זה מבטיח כי הפעילות אנטי סרטנית הגבוהה של הקומפלקסים מסתמכת על מרכזי המתכת. מאז יגנד החופשי בקושי מגיע 50% עיכוב צמיחת תאים, לא ניתן לגזור IC 50 ערך מוחלט בצורה מדויקת. למעשה, ערך יחסי גם לא היה יכול להיות מחושב כראוי על ידי התוכנה בשל הפעילות קלה ומתאים לערכים גבוהות שגיאה. עם זאת, ברור כי גם אם IC 50 ערך יחסי יכול כבר נגזר על H 2 L, זה לא היה בא לידי ביטוי בפעילות ניכרת, וכך הופך את דו&quot;ח ערך העיכוב המקסימאלי יחד עם IC 50 ערכים יחסי (והתיאור של העקומה) חיוני. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 50 IC יחסית (מיקרומטר) </td><td> המוחלט 50 IC (מיקרומטר) </td><td> עיכוב מקסימאלי (%) </td></tr><tr><td> LVO (O i Pr) </td><td> 13 ± 3 </td><td> 19 ± 8 </td><td> 81% </td></tr><tr><td> LTI (O i Pr) 2 </td><td> 3 ± 1 </td><td> 5 ± 3 </td><td> 87% </td></tr><tr><td> H 2 L </td><td> - </td><td> - </td><td> 47% </td></tr><tr><td> ציספלטין </td><td> 14 ± 5 </td><td> 13 ± 6 </td><td> 91% </td></tr></tbody></table> טבלת 1. תוצאות cytotoxicity לתרכובות שנבדקו: IC יחסית ומוחלט 50 (מיקרומטר) וערכים מרביים צמיחת תאי עיכוב כלפי HT-29 תאים הבאים תקופת דגירה של שלושה ימים עם V (V) LVO המורכב (O i Pr), Ti (IV ) מורכב LTI (O i Pr) 2, L יגנד החופשי H 2 וציספלטין; ניתנים 18,21 50 ערכי IC כממוצע של ליטר<html> שלוש פעמים מזרחה שלוש חזרות עם ערכי שגיאה כמו מחלות מין. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50767/50767fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50767/50767fig1.jpg" /> איור 1. ההפחתה של MTT על ידי אנזימים של המיטוכונדריה וcytosolic לformazan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50767/50767fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50767/50767fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50767/50767fig2.jpg" /> איור 2. הכנת V (V) וטי (IV) קומפלקסים 18,28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50767/50767fig2large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> t &quot;עבור: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50767/50767fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50767/50767fig3.jpg" /> איור 3. דוגמאות לתוצאות של מדידות כדאיות תא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50767/50767fig3large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50767/50767fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50767/50767fig4.jpg" /> איור 4. מינון עקומות תלויות cytotoxicity לתרכובות שנבדקו: תלותה של HT-29 כדאיות תא בריכוז מנוהל של V (V) LVO המורכב (O i Pr) (כחול), טי (IV) המורכב LTI (O i Pr) 2 ( , H אדום) ליגנד החופשי 2 L (שחור) וציספלטין (ירוק), לאחר תקופת דגירה של שלושה ימים, כobtained מלפחות שלוש פעמים בשלוש חזרות כפי שמשתקף בערכי השגיאה 18,21.

Watch this Scientific Journal Video about Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay at JoVE.com

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

anticancer-metal-complexes-synthesis-cytotoxicity-evaluation-mtt

Google

Research

JoVE Journal

Chemistry

57.1K Views.  The Hebrew University of Jerusalem.  שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT. 

Video: Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Amide Coupling Reaction for the Synthesis of Bispyridine-based Ligands and Their Complexation to Platinum as Dinuclear Anticancer Agents

Amide coupling reactions can be used to synthesize bispyridine-based ligands for use as bridging linkers in multinuclear platinum anticancer drugs. Isonicotinic acid, or its derivatives, are coupled to variable length diaminoalkane chains under an inert atmosphere in anhydrous DMF or DMSO with the use of a weak base, triethylamine, and a coupling agent, 1-propylphosphonic anhydride. The products precipitate from solution upon formation or can be precipitated by the addition of water. If desired, the ligands can be further purified by recrystallization from hot water. Dinuclear platinum complex synthesis using the bispyridine ligands is done in hot water using transplatin. The most informative of the chemical characterization techniques to determine the structure and gross purity of both the bispyridine ligands and the final platinum complexes is 1H NMR with particular analysis of the aromatic region of the spectra (7-9 ppm). The platinum complexes have potential application as anticancer agents and the synthesis method can be modified to produce trinuclear and other multinuclear complexes with different hydrogen bonding functionality in the bridging ligand.

This protocol describes the use of amide coupling reactions of isonicotinic acid and diaminoalkanes to form bridging ligands suitable for use in the synthesis of multinuclear platinum complexes, which combine aspects of the anticancer drugs BBR3464 and picoplatin.

תגובה אמידה צימוד לסינתזה של ligands מבוסס Bispyridine וcomplexation לפלטינה כסוכנים נגד סרטן Dinuclear

Amide coupling reactions can be used to synthesize bispyridine-based ligands for use as bridging linkers in multinuclear platinum anticancer drugs. ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Metal-free Synthesis of Ynones from Acyl Chlorides and Potassium Alkynyltrifluoroborate Salts

Ynones are a valuable functional group and building block in organic synthesis. Ynones serve as a precursor to many important organic functional groups and scaffolds. Traditional methods for the preparation of ynones are associated with drawbacks including harsh conditions, multiple purification steps, and the presence of unwanted byproducts. An alternative method for the straightforward preparation of ynones from acyl chlorides and potassium alkynyltrifluoroborate salts is described herein. The adoption of organotrifluoroborate salts as an alternative to organometallic reagents for the formation of new carbon-carbon bonds has a number of advantages. Potassium organotrifluoroborate salts are shelf stable, have good functional group tolerance, low toxicity, and a wide variety are straightforward to prepare. The title reaction proceeds rapidly at ambient temperature in the presence of a Lewis acid without the exclusion of air and moisture. Fair to excellent yields may be obtained via reaction of various aryl and alkyl acid chlorides with alkynyltrifluoroborate salts in the presence of boron trichloride.

The goal of this manuscript is to demonstrate a straightforward method for the preparation of ynones from acyl chloride and potassium alkynyltrifluoroborate salt starting materials. The one-pot reaction proceeds rapidly in the presence of boron trichloride without exclusion of air and moisture.

סינתזה נטולת מתכת של Ynones מacyl כלורידים ואשלגן Alkynyltrifluoroborate מלחים

Ynones are a valuable functional group and building block in organic synthesis. Ynones serve as a precursor to many important organic functional groups ...

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

הסינתזה, אפיון ותגובתיות של סדרה של רותניום<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; מכלולים

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

Reverse Microemulsion-mediated Synthesis of Monometallic and Bimetallic Early Transition Metal Carbide and Nitride Nanoparticles

A reverse microemulsion is used to encapsulate monometallic or bimetallic early transition metal oxide nanoparticles in microporous silica shells. The silica-encapsulated metal oxide nanoparticles are then carburized in a methane/hydrogen atmosphere at temperatures over 800 &#176;C to form silica-encapsulated early transition metal carbide nanoparticles. During the carburization process, the silica shells prevent the sintering of adjacent carbide nanoparticles while also preventing the deposition of excess surface carbon. Alternatively, the silica-encapsulated metal oxide nanoparticles can be nitridized in an ammonia atmosphere at temperatures over 800 &#176;C to form silica-encapsulated early transition metal nitride nanoparticles. By adjusting the reverse microemulsion parameters, the thickness of the silica shells, and the carburization/nitridation conditions, the transition metal carbide or nitride nanoparticles can be tuned to various sizes, compositions, and crystal phases. After carburization or nitridation, the silica shells are then removed using either a room-temperature aqueous ammonium bifluoride solution or a 0.1 to 0.5 M NaOH solution at 40-60 &#176;C. While the silica shells are dissolving, a high surface area support, such as carbon black, can be added to these solutions to obtain supported early transition metal carbide or nitride nanoparticles. If no high surface area support is added, then the nanoparticles can be stored as a nanodispersion or centrifuged to obtain a nanopowder.

A &#8220;removable ceramic coating method&#8221; is presented in visual format for the synthesis of non-sintered and metal-terminated monometallic and bimetallic early transition metal carbide and nitride nanoparticles with tunable sizes and crystal structures.

סינתזה בתיווך Microemulsion הפוכה של monometallic ובי-המתכתי המוקדם מעבר מתכת קרביד ניטריד חלקיקים

A reverse microemulsion is used to encapsulate monometallic or bimetallic early transition metal oxide nanoparticles in microporous silica shells. The ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as Ru(II), Pt(II), and Rh(III). The compound, named as a water-soluble metal-organic complex array (WSMOCA), is obtained through 1) the conventional solution-chemistry-based preparation of the corresponding metal complex monomers having a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protected amino acid moiety and 2) their sequential coupling together with other water-soluble organic building units on the surface-functionalized polymeric resin by following the procedures originally developed for the solid-phase synthesis of polypeptides, with proper modifications. Traces of reactions determined by mass spectrometric analysis at the representative coupling steps in stage 2 confirm the selective construction of a predetermined sequence of metal centers along with the peptide backbone. The WSMOCA cleaved from the resin at the end of stage 2 has a certain level of solubility in aqueous media dependent on the pH value and/or salt content, which is useful for the purification of the compound.

Synthesis of a Water-soluble Metal&amp;#8211;Organic Complex Array

A potential general method for the synthesis of water-soluble multimetallic peptidic arrays containing a predetermined sequence of metal centers is presented.

סינתזה של מערך מורכב מתכת-אורגנית נמס במים

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from benzimidazolium salts. Detailed and generalized protocols are also presented for testing the catalytic activity of such complexes in arylation and Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions. Representative results are shown for the catalytic activity of the four complexes in arylation and Suzuki-Miyaura type reactions. For each of the reactions investigated, at least one of the four complexes successfully catalyzed the reaction, qualifying them as promising candidates for catalysis of many carbon-carbon bond-forming reactions. The protocols presented are general enough to be adapted for the synthesis, purification and catalytic activity testing of new palladium N-heterocyclic carbene complexes.

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from benzimidazolium salts. The complexes were tested for catalytic activity in arylation and Suzuki-Miyaura reactions. For each reaction investigated, at least one of the four complexes successfully catalyzed the reaction.

פלדיום<em&gt; N</em&gt; קומפלקסים Carbene heterocyclic: סינתזה מ Benzimidazolium מלחים ופעילות קטליטי פחמן פחמן בונד התגבשות התגובות

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Synthesis and Performance Characterizations of Transition Metal Single Atom Catalyst for Electrochemical CO2 Reduction

This protocol presents both the synthesis method of the Ni single atom catalyst, and the electrochemical testing of its catalytic activity and selectivity in aqueous CO2 reduction. Different from traditional metal nanocrystals, the synthesis of metal single atoms involves a matrix material that can confine those single atoms and prevent them from aggregation. We report an electrospinning and thermal annealing method to prepare Ni single atoms dispersed and coordinated in a graphene shell, as active centers for CO2 reduction to CO. During the synthesis, N dopants play a critical role in generating graphene vacancies to trap Ni atoms. Aberration-corrected scanning transmission electron microscopy and three-dimensional atom probe tomography were employed to identify the single Ni atomic sites in graphene vacancies. Detailed setup of electrochemical CO2 reduction apparatus coupled with an on-line gas chromatography is also demonstrated. Compared to metallic Ni, Ni single atom catalyst exhibit dramatically improved CO2 reduction and suppressed H2 evolution side reaction.

Synthesis and Performance Characterizations of Transition Metal Single Atom Catalyst for Electrochemical CO2 Reduction

Here, we present a protocol for the synthesis and electrochemical testing of transition metal single atoms coordinated in graphene vacancies as active centers for selective carbon dioxide reduction to carbon monoxide in aqueous solutions.

סינתזה, אפיוני ביצועים של מתכות מעבר מאטום בודד הזרז להפחתת2 CO אלקטרוכימי

This protocol presents both the synthesis method of the Ni single atom catalyst, and the electrochemical testing of its catalytic activity and selectivity ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and porous metal-dithiolene network in the highly ordered single crystalline state. Unlike the highly reactive free-standing thiols, which tend to decompose and complicate the crystallization of metal-thiolate open frameworks, the thioester reacts in situ to provide the thiol species, serving to mitigate the reaction between the mercaptan units and the metal centers, and to improve crystallization consequently. Specifically, the thioester was synthesized in a one-pot procedure: an aromatic bromide (hexabromotriphenylene) reacted with excess sodium thiomethoxide under vigorous conditions to first form the thioether intermediate product. The thioether was then demethylated by the excess thiomethoxide to provide the thiolate anion that was acylated to form the thioester product. The thioester was conveniently purified by standard column chromatography, and then used directly in the framework synthesis, wherein NaOH and ethylenediamine serve to revert in situ the thioester to the thiol linker for assembling the single-crystalline Pb(II)-dithiolene network. Compared with other methods for thiol synthesis (e.g., by cleaving alkyl thioether using sodium metal and liquid ammonia), the thioester synthesis here uses simple conditions and economical reagents. Moreover, the thioester product is stable and can be conveniently handled and stored. More importantly, in contrast to the generic difficulty in accessing crystalline metal-thiolate open frameworks, we demonstrate that using the thioester for in situ formation of the thiol linker greatly improves the crystallinity of the solid-state product. We intend to encourage broader research efforts on the technologically important metal-sulfur frameworks by disclosing the synthetic protocol for the thioester as well as the crystalline framework solid.

Here, we present a one-pot, transition-metal-free synthesis of thiols and thioesters from aromatic halides and sodium thiomethoxide, followed by the preparation of single crystals of a metal-dithiolene network using thiol species generated in situ from the more stable and tractable thioester.

סינתזה של אבן בניין תיול עבור התגבשויות של מסגרת מתכת Gyroidal-גופרית מוליכים למחצה

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...