שיטה זו תאפשר לחוקרים להעריך את הכדאיות התאית ללא תלות בתפקוד המיטוכונדריאלי. וזה נוח למאמצי סינון סמים תפוקה גבוהה. טכניקה זו מהירה, מדויקת, זולה, ומאפשרת קביעת תרכובות ציטוטוקסיות, כולל אלה הפוגעות בתפקוד המיטוכונדריאלי ברוב סוגי התאים.
קל לבצע פרוטוקול זה. חשוב לשים לב להכנת התרופה, תנאי הטיפול וצפיפות התאים כדי להבטיח דיוק ותוקף ניסיוניים. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שצעדי רכישת תמונה וניתוח תמונה יכולים להיות קשים לסיכום, במיוחד עבור חוקרים שיש להם ניסיון מועט עם Gen5 Software.
התחל בהכנת פתרונות של תרכובות הריבית בריכוז הרצוי. הקפד תמיד לערבב תרכובות על ידי מערבולת ביסודיות. כדי למדוד ציטוטוקסיות של תרכובת אחת, להכין תרכובות בריכוז סופי 2X.
אם מודדים ציטוטוקסיות של שילובים מורכבים, הכינו אותם בריכוז סופי של פי 4. הכן פקדים ממס רק על ידי ערבוב אותה כמות של ממס עם המדיום המתאים. לאסוף תאים לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ו aliquot 10 microliters של ההשעיה התא.
לקבלת כתמים כחולים טריפאן, להוסיף 10 microliters של 0.4% trypan כחול aliquot ולהשתמש hemocytometer או מונה תאים לספור תאים קיימא ולא קיימא. תאי גלולה בצינור 15 מיליליטר ב 200 פעמים G במשך חמש דקות, ואז שאפו או decamped supernatant. אנחנו להשעות את גלולת התא במאמר מדיה מתאימה בצפיפות תאים של שלוש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר.
השתמש פיפטה רב ערוצית לזרוע 50 microliters של מתלים התא לתוך כל באר של צלחת 96 היטב. עבור בדיקות מורכבות בודדות, להוסיף 50 microliters של פתרון מורכב 2X לתוך כל באר. עבור בארות בקרת ממס, להוסיף 15 microliters של מדיה בדיקה המכיל את הממס בריכוז 2X.
לשילוב בדיקות להוסיף 25 microliters של כל אחד תרכובות 4X לתוך כל באר. עבור בארות בקרה מורכבות יחיד, להוסיף 25 microliters כל פתרון מורכב 4X ומבחן בינוני. ודא כי הריכוז הסופי של DMSO אינו עולה על 0.5%כדי להבטיח את הרבייה, להוסיף תרופות עם טיפים פיפטה נוגע בצד של בארות.
הקפד להוסיף את הסמים למקומות שונים. דקירות זה צריך להתבצע מהר מאוד, רצוי לוקח לא יותר מ 30 דקות לכל צלחת. הקישו בעדינות על הצלחת כדי לערבב את תכולת הבאר ולהדיגר אותה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
כאשר מוכנים להכתים את התאים עם Hoechst 33342 ו propidium יודיד להכין פתרון כתמים טריים 10X ולהוסיף 10 microliters לכל באר. יש להקיש בעדינות על הצלחת ולהדליר אותה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. צנטריפוגה הצלחת ב 200 פעמים G במשך ארבע דקות כדי להביא את כל התאים לתחתית הצלחת.
ואז בזהירות לנגב את החלק התחתון של הצלחת עם לנגב מעבדה לחה כדי להסיר את כל הפסולת שעלולה להפריע הדמיה. תמונה הצלחת בתוך 15 דקות לאחר צנטריפוגה. פתח את Gen5 Software וצור פרוטוקול סטנדרטי חדש, לחץ על הליך ובחר את סוג הלוחות לשימוש.
בדרך כלל, 96 צלחות פלסטיק שחורות היטב. לאחר מכן, הגדר את שיטת הקריאה לתמונה, לחץ על אישור ובחר ערכות DAPI ו- Texas Red Filter עם יעד הגדלה של פי 4. אין צורך בהיסט, שכן מרכזי היטב ידמיין.
עבור מסנן DAPI, הגדר את LED ל- 10, זמן שילוב ל- 99 והתאפס. עבור טקסס רד, הגדר LED לשמונה, זמן אינטגרציה ל 950, ולהשיג 18. לחץ על אפשרויות כדי לוודא שהמוקד האוטומטי מבוצע בערוץ DAPI ואין היסט בהתמקדות בין ערוצים.
שמור את הפרוטוקול על-ידי לחיצה על אישור. כעת ניתן להקליט תמונות באמצעות לחצן 'קרא חדש'. לאחר הקלטת התמונות, לחצו על 'הפחתת נתונים' ובחרו 'עיבוד מקדים של תמונה'.
החל עיבוד מראש של תמונה עם חיסור רקע כהה באמצעות גודל שיטוח אוטומטי בהתבסס על אות DAPI. עבור טקסס רד, השתמש באותן אפשרויות כמו עבור ערוץ 1. כשתסיים, לחץ על אישור.
לאחר מכן עבור אל לוח הניתוח התאי והחל מסכה גרעינית המבוססת על אות DAPI שהשתנה עם ערך סף של 6, 000 יחידות, גודל אובייקט מינימלי של חמישה מיקרומטרים וגודל אובייקט מרבי של 25 מיקרומטר. נתחו את התמונה כולה, אל תכלול עצמים ראשוניים בגבול התמונה ופצלו עצמים נוגעים ללב. באפשרויות זיהוי מתקדמות, הגדר את קוטר הכדור המתגלגל כ- 30 מיקרומטרים והערך את הרקע בהתבסס על 5% מהפיקסלים הנמוכים ביותר.
שמור רק את ספירת התאים במדדים מחושבים. לאחר מכן, לבצע ניתוח subpopulation המבוסס על הממוצע השתנה טקסס אדום אות עם ערך סף של 5, 000 יחידות לספור תאים מתים. לבסוף, גש לספירת התאים המתקבלת.
תמונות מייצגות של תאים מוכתמים בהויכסט, יודיד פרופידיום מוצגים כאן. המספר הכולל של תאים גבוה למדי וגדול ממספר התאים המתים. כאשר פאנל של מטעני ציטוטוקסיות הושווה עם הדרה כחולה trypan, נמצא כי MTT ואת Alamar כחול מתנסה נמדד באופן לא מדויק הכדאיות התאית.
אלה מיטוכונדריאלי אנזימים מבוססי assays הראו כדאיות נמוכה באופן משמעותי בהשוואה להדרה כחולה trypan. הכתמים הכפולים עם Hoechst 33342 ו- PI היו השילוב הטוב ביותר של חוסן, רגישות ועקביות עם כתמים כחולים טריפאן והחריגה החציונית הקטנה ביותר משיטת ההדרה הכחולה של trypan לאחר טיפול מק"ס או 2-DG. החיבור Hoechst PI היה יעיל גם בקביעת הכדאיות התאית לאחר טיפול עם מולקולות מיקוד המיטוכונדריה רוטנונה ושלוש ברומופירובאט.
זה היה מאומת עוד יותר עם פאנל של קווי תא לוקמיה. תאים אלה השתנו ברגישות רוטנונה החל רגיש מאוד לתאי התנגדות. ביצועים לא נאותים של ההתרגם עלולים לסכן את דיוקו.
מספר תוצאות שנפרצו מוצגות כאן. נטיפת יתר עם PI, הזנחת שלב הצנטריפוגה, או תפוקת יתר בערוץ Hoechst, תגרום לתוצאות תת-אופטימליות. בעת תזמון פרוטוקול זה, זכור לייעל את ריכוז הצבע ואת זמן הכתמים עבור כל קו תא.
כמו כן, ציפוי עבור צלחת מדגם, יש צורך להבטיח איכות הדמיה. לאחר זיהוי של תרכובות של אפקט cytotoxicity על תאים סרטניים, החוקרים עשויים להמשיך עם מחקרים מכניים כדי לזהות את המטרות הרלוונטיות שלהם. סינון ספריות מולקולות קטנות בטכניקה זו במקביל לבדיקות MTT קונבנציונליות, יאפשר לזהות במהירות מולקולות שמכוונות לתפקוד המיטוכונדריאלי.
