ברצוננו להודות לס ורנר למתן העורבים שימש במחקר זה ובמשרד החקלאות, כנימות, צוות טיפול בבעלי החיים WS, NWRC לטיפול בבעלי חיים וניטור. לדבר או שימוש במוצר אינו מצביע על תמיכה של משרד חקלאות אמריקנית. מימון למחקר זה מסופק על ידי משרד החקלאות האמריקאי, כנימות, שירותים הווטרינריים.

הפרוטוקול שלנו מותאם מאחד שפרסמנו בעבר 7. כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בארצות הברית מחלקת החקלאות (USDA), בעלי החיים וצמחי בריאות פיקוח השירות (כנימות), שירותים בטבע (WS), National Wildlife מרכז המחקר (NWRC). 1. העורב Gavaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת זמן מעבר של &#39;חומר המוח פסאודו&#39; דרך מערכת העיכול של עורבים אמריקאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 5 מיליליטר של מבושל ומקושקשים ביצה שלמה עם צבע כחול ועורב gavage 1 באמצעות 2 במחט gavage (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק עורב כל 30 דקות עד צואה כחולה / מוכתם ירוקה הן כבר לא מופרשת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג C57BL / 6 מוח עכבר RML (זן צ&#39;נדלר) נגוע נגוע וחולה במחלה סופנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור 20% wt / כרך רגיל וhomogenate עכבר המוח הנגוע בhomogenizer בלנדר כדור עם 1xפוספט שנאגרו מלוח (PBS) וחרוזי זכוכית, אז צנטריפוגות ב3,000 XG דקות 1 כדי להסיר חומר חלקיקים גדול יותר. הסר supernatant ולדלל עם נפח שווה של 1x PBS ליצור 10% wt / כרך ב PBS סטרילית. להקפיא ב -80 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 17 שעה לפני gavage להסיר מזון, אך לא מים, מעטים עורב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אקראי להקצות עורבים לקבוצות טיפול ובעל פה gavage כל עורב עם 5 מיליליטר של homogenate מוח עכבר הנורמלי או נגוע באמצעות 2 במחט gavage. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה עורבת בכלובים בודדים ולאסוף וברכה כל הצואה בתוך כל כלוב למשך 4 שעות לאחר gavage (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize צואה נקוותה עבור כל עורב בhomogenizer בלנדר כדור עם חרוזי זכוכית עד שמרקם אחיד מושגת. * צואה העורב הן בעיקר נוזלית ויכולה להיות מעורבת בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל עורב, לדלל 500 μl של homogenate צואה ל9.5 מיליליטר 1x PBS להיקף כולל של 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogena הצואהטה ל15 דקות ב 1,400 XG ולחלץ את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער את האיום של זיהום מיקרוביאלי המשני, טיפול supernatant עם 1 μl של 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (Invitrogen, ניו יורק) לשל homogenate 100 μl ואז למקם תחת אור UV בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי להפחית את סיכון לזיהום נגיפי וחיידקיים. לאחר חשיפה לקרינת UV, דגימות sonicate בsonicator מגה פיקסל 3000 בהגדרת 70 ל30 שניות כדי לשבש את הקרום של כל חיידקים שנותרו. </li></ol> 2. עכבר הרכבת חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אקראי להקצות עכברים לקבוצות לאחר הטיפול (טבלת 1): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצת 1 - עכברי טיפול חיוביים מחוסן intraperitoneally (IP) עם 1 מיליליטר של homogenate צואה מעורב פה gavaged עם המוח של עכבר 5 מ&quot;ל נגוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצת 2 - עכברי טיפול שלילי מחוסן IP עם 1 מיליליטר של homogenate צואה מעורב פה gavaged עם מוח עכבר רגיל 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל infectehomogenate ד והנורמלי במוח עכבר לקבוצות 3 ו -4 ל1:100 w / v ב 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצה 3 - עכברי ביקורת חיוביים מחוסנת IP עם 1 מיליליטר של homogenate עכבר המוח הנגוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצת 4 - עכברי בקרה שלילית מחוסן IP עם 1 מיליליטר של homogenate עכבר המוח הנורמלי. </li></ol></li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> קבוצת הטיפול </td><td> מספר בעלי חיים </td></tr><tr><td> קבוצת 1 </td><td> צואה + העורב סקרייפי </td><td> 100 </td></tr><tr><td> קבוצה 2 </td><td> סקרייפי - עורב צואה </td><td> 25 </td></tr><tr><td> קבוצה 3 </td><td> מוח סקרייפי + עכבר </td><td> 10 </td></tr><tr><td> קבוצה 4 </td><td> סקרייפי - מוח העכבר </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> . טבלת 1 מעמד סקרייפי של הבידוד (+ חיובי, שלילי -) ומספר בעלי החיים המשמשים 7. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intraperitoneally לחסן עכבר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עורף עכבר על ידי פרווה צוואר גב עם אגודל ואצבע מורה וסובב בעדינות לחשוף את הצד הגחוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרומם את הקצה אחורי של עכבר כך שהראש הוא מעט נמוך יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 25 מחט G 1 סנטימטר דרך עור, רוחב 1 סנטימטר של קו האמצע, ו 1-2 סנטימטר קדמי למפרק הע&quot;כ באמצעות מזרק נעילת מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1 מיליליטר לחסן לאט לתוך חלל גוף עכבר. </li></ol></li></ol> 3. ניטור עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על עכברים יומיים עד שהם מביעים את הסימנים קליניים של scrapie עכבר. סימנים קליניים יכולים לכלול: קיפוזיס, אטקסיה, זנב קשיח, חוסר הטיפוח, רזון, ועייפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון עכברים עבור כל אחד מ6 הסימנים הקליניים כאשר סימנים נראים לעין הם מאליו, שבו 0 = לא נראה לעין, 1 = בינונית, ו -2 = חמורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים כאשר ציונים יומיים הכולל עבור כל סימן להגיע ≥ 8 ליום 1, ≥ 6 ברציפות במשך 3 ימים, או ב365 ימים שלאחר החיסון (dpi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח קציר euthan מייד לאחראסיה ולאחסן ב -70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את האבחנה מרוסקת, לעכל דגימות מוח עם 3 μl של 50 מיקרוגרם / מיליליטר של תמיסת proteinase-K (PK) בדילול כדלקמן: 3.1. μl PK, 12.5 μl של 500 mM EDTA, pH 8, 109.39 μl של 1x PBS במשך 30 דקות על 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להשבית PK ידי הוספת 8 חיץ טעינת μl ודוגרי דגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דגימות עומס על 12% ג&#39;ל SDS-PAGE, Electrophorese והעברה לממברנה Immobilon PVDF ובלוק עם 5% חלב ללא שומן ב0.2% Tween 20 PBS במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. ואז לבחון עם הנוגדן חד שבטי אנטי PRP Bar224 מצומדת לחזרת peroxidase, בדילול מלא בבלוק, במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. יש לשטוף את הממברנה במשך שעה 1 עם PBS-0.2% Tween 20. כדי להמחיש, דגירה דקות כתם 5 מערביות עם מצע chemiluminescent ותמונה על מערכת תיעוד ג&#39;ל G-box. </li></ol>

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie.">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li><li>Miller, M. W., Williams, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epizootiology+of+chronic+wasting+disease+in+free-ranging+cervids+in+Colorado+and+Wyoming.">Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming.</a> Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).</li><li>Miller, M. W., Williams, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+prion+transmission+in+mule+deer.">Horizontal prion transmission in mule deer.</a> Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).</li><li>Sigurdson, C. J., Adriano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Wasting+Disease.">Chronic Wasting Disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).</li><li>Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+sources+of+prion+transmission+in+mule+deer.">Environmental sources of prion transmission in mule deer.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).</li><li>Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+prions+in+pre-clinical+deer+and+transmission+of+chronic+wasting+disease+solely+by+environmental+exposure.">Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure.</a> PLoS ONE. 4 (6), e5916 (2009).</li><li>VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+remains+infectious+after+passage+through+digestive+system+of+American+crows+(Corvus+crachyrhunchos).">Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos).</a> PLoS ONE. 7 (10), e45774 (2012).</li><li>Imran, M., Mahmood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+animal+prion+diseases.">An overview of animal prion diseases.</a> Virology Journal. 8 (493), (2011).</li><li>Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+prion+disease.">The expanding universe of prion disease.</a> PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26 (2006).</li><li>Bruce, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmissions+to+mice+indicate+that+'new+variant'+CJD+is+caused+by+the+BSE+agent.">Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent.</a> Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).</li><li>Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+lateral+transmission+of+scrapie+between+sheep+kept+under+natural+conditions+using+lymphoid+tissue+biopsy.">Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy.</a> Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).</li><li>Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+risk+of+prion+zoonoses.">The risk of prion zoonoses.</a> Science. 335 (6067), 411-413 (2012).</li><li>Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+agent+diversity+and+species+barrier.">Prion agent diversity and species barrier.</a> Veterinary Research. 39 (47), (2008).</li><li>Harrington, R. D., Baszler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+barrier+limits+transmission+of+chronic+wasting+disease+to+mink+(Mustela+vison).">A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison).</a> The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).</li><li>Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mites+as+vectors+for+scrapie.">Mites as vectors for scrapie.</a> Lancet. 347 (9008), 1114 (1996).</li><li>Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly+larvae+and+pupae+as+vectors+for+scrapie.">Fly larvae and pupae as vectors for scrapie.</a> Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).</li><li>Matthews, D., Cooke, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+for+transmissible+spongiform+encephalopathies+in+non-ruminant+livestock+and+fish.">The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish.</a> Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).</li><li>Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deer+carcass+decomposition+and+potential+scavenger+exposure+to+chronic+wasting+disease.">Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).</li><li>Scherbel, C., Pichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+scrapie+associated+prion+protein+(PrPSc)+by+the+gastrointestinal+microbiota+of+cattle.">Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle.</a> Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).</li><li>Jeffrey, M., Gonza&#225;lez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapie+susceptible+and+scrapie-resistant+sheep.">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).</li><li>Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+sheep+scrapie+brain+homogenate+to+rumen-simulating+conditions+does+not+result+in+a+reduction+of+PrP(Sc)+levels.">Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels.</a> Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).</li><li>Motes C, M. a. l. u. q. u. e. r. d. e., Grassi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+of+BSE+and+scrapie+prions+in+stools+from+murine+models.">Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models.</a> Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).</li><li>Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+shedding,+alimentary+clearance+and+intestinal+spread+of+prions+in+hamsters+fed+with+scrapie.">Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie.</a> Veterinary Research. 40 (1), 4 (2009).</li><li>Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease.">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li><li>Bjorndal, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+digestive+responses+in+two+generalist+herbivores,+the+tortoises+Geochelone+carbonaria+and+Geochelone+denticulate.">Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate.</a> Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).</li><li>Clark, R. G., Gentle, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+grain+passage+time+in+captive+mallards.">Estimates of grain passage time in captive mallards.</a> Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).</li><li>Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+intake,+digestion+and+passage+of+proboscis+monkey+(Nasalis+larvatus)+in+captivity.">Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity.</a> Primates. 33 (3), 399-405 (1992).</li><li>Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+feeding+strategies+and+potential+disease+transmission+in+Wisconsin+white-tailed+deer.">Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer.</a> Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).</li><li>Pulford, B., Spraker, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+PrPCWD+in+feces+from+naturally+exposed+Rocky+Mountain+elk+(Cervus+elaphus+nelsoni)+using+protein+misfolding+cyclic+amplification.">Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification.</a> Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).</li><li>Hicks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guano+deposition+in+an+Oklahoma+crow+roost.">Guano deposition in an Oklahoma crow roost.</a> Condor. 81 (3), 247-250 (1979).</li><li>Aldous, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Winter+habits+of+crows+in+Oklahoma.">Winter habits of crows in Oklahoma.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מדגימים הליך לתעד מעבר של חומר PRP Res דרך מערכת העיכול של עורבים. אנחנו השתמשנו בשיטות מקובלות כדי לקבוע אם יש לי עורב היכולת translocate חומרי PRP Res לאזורים גיאוגרפיים ללא מחלה. אחרים העריכו התנגדות של PRP Res למעלי גירת 19-21 ומכרסם 22,23 נוזלי עיכו...

&quot;ספגות מוח מדבק (TSE) הם הפרעות קטלניות זיהומיות ניווניות המשפיעות על חיות הבר, חיות בית, ובני אדם. הגורם המדבק של מחלות TSE נראה isoforms misfolded או פתוגניים (PRP Res) של חלבוני פריון 1. מחלות בעלי החיים TSE כוללות מחלה ממארת כרונית (CWD) בפרד צבי (hemionus Odocoileus), צבי לבן זנב (virginianus Odocoileus), איילים (elaphus Cervus), ואייל (alces Alces); מרוסק בכבשים ועזים; ספג מוח ( BSE) בבקר; אנצפלופתיה מינק העברה במינק Farmed; ספג מוח של חתולים בחתולים; ספגתי מוח פרסה אקזוטי בגן החיות אקזוטיות מעלה גירה ממשפחת Bovidae; וספג מוח בפרימטים לא אנושיים 8. המחלה אחת האדם TSE, מחלת קרויצפלד יקוב וריאנט, היא נדירה וחשבו שיירכשו על ידי צריכת PRP Res-contaminאוכל ated 9. באופן דומה, BSE יכול להדביק בני אדם, אם בשר מזוהם הוא נצרך 10. מבינים כל מחלות TSE, מרוסק וCWD הם שני עם מגיפות עצמית לקיום ומקורות לזיהום רק הונחו כמבעלי חיים לבעלי חי 2,3,11 כמו גם ממקורות סביבתיים 4-6. המחקר מצביע על כך שרוב המחלות TSE דורשות תקופות דגירה ממושכות בולטות מאירועי חשיפה טבעיים של חומר PRP Res לביטוי של סימנים קליניים 2-4,6,8 ומחסומי מינים לכאורה למזער, אבל לא לחסל את הפוטנציאל, שידור interspecies 12-14 . זיהוי מנגנונים להתפשטות פריון זיהומיות חומרים (PRP מיל &#39;) הוא חשוב ביותר עבור מתן תשובות לשאלות על איך מחלות TSE נעו על פני השטח. חקירות ניסיוניות הראו כי חרקי 15,16, עופות וחזירים 17, ועורבים אמריקאים (נוי Corvushyrhynchos) 7,18 הם נשאים או מפזרים פסיביים של חומר PRP Res. לאחרונה מעבר של חומר PRP Res דרך מערכת העיכול של עורבים תועד, הוכיח את התפקיד שהם עשויים לשחק בפיזור של מחלות TSE 7. תוצאות אלו להפוך אותו מתקבלות על הדעת שעורבים, נבלות, יכולים להיתקל, לצרוך, ולהעביר את חומר זיהומיות באמצעות תצהיר צואה, לאזורים ללא מחלה. הנהלים אנו מדגימים כאן שימשו לתיעוד מעבר של חומר PRP Res דרך מערכת העיכול של עורבים ויקלו על היישום של שיטות אלה לנבלות אחרות ודגמי טורף מינים ספציפיים במחקר עתידי הקשורים באופן משמעותי. במחקר זה שיטות קונבנציונליות נעשו שימוש כדי לחקור את אמצעים בלתי שגרתיים של סחר בחומרי PRP מיל, אשר יכול לתרום להתפשטות והניטל הכולל של חומר PRP Res.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="545">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">RML Chandler strain mouse-adapted scrapie</td>
			<td style="width:112px;">Rocky Mountain Laboratories</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">RC57BL/6 mice</td>
			<td style="width:112px;">Hilltop Lab Animals</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">American crows</td>
			<td style="width:112px;">wild captured</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15140-122</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Phosphate buffered Saline</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">70011-044</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Proteinase-K solution</td>
			<td style="width:112px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:137px;">3115887001</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Loading buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">NP0007 and 0009</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Bis-tris SDS PAGE 12% gel</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">NP0342</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">1SEQ00010</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Tween 20</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">Bullet blender homogenizer</td>
			<td style="width:112px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:137px;">BBX24B</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">2.3 mm Zirconia/silica beads</td>
			<td style="width:112px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:137px;">11079125Z</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">Bar224 anti-PrP monoclonal antibody</td>
			<td style="width:112px;">Cayman Chemical</td>
			<td align="right" style="width:137px;">10009035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">Superblock</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:137px;">37517</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">WBKLS0500</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">G-box gel documentation system</td>
			<td style="width:112px;">Syngene</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedures for identifying infectious prions after passage through the digestive system of an avian species

חומר פריון זיהומיות (PRP מיל &#39;) סביר להניח הגורם לאנצפלופתיה הקטלנית, ניווניות העברה ספג מחלות (TSE) 1. העברת מחלות TSE, כגון מחלה כרונית לבזבז (CWD), חזקה כי מבעלי החיים לבעלי החיים 2,3, כמו גם ממקורות סביבתיים 4-6. יש אוכלי נבלות וטורפים פוטנציאליים לtranslocate חומרי PRP Res באמצעות הצריכה והפרשה של נבלות מזוהמת CWD. מחקר שנערך לאחרונה תעד מעבר של חומר PRP Res דרך מערכת העיכול של עורבים אמריקאים (brachyrhynchos Corvus), נבלות בצפון אמריקה נפוצות 7. אנו מתארים נהלים המשמשים לתיעוד מעבר של חומר PRP Res דרך עורבים אמריקאי. עורבי gavaged עם מרוסק מותאם עכבר RML מתח והצואה שלהם נאספו 4 ההודעה hr gavage. צואה עורב אז היו נקווית והזריקה לתוך intraperitoneallyעכברי C57BL / 6. עכברים היו במעקב יומי עד שהם באים לידי ביטוי סימנים קליניים של מרוסק של עכבר והיו מורדמים לאחר מכן. עכברים ללא תסמינים היו במעקב עד הודעה 365 ימי חיסון. ניתוח כתם מערבי נערך כדי לאשר את מצב מחלה. תוצאות הראה כי פריונים יישארו זיהומיות לאחר שנסעו דרך מערכת העיכול של עורבים ונמצאים בצואה, גרימת מחלה בעכברי מבחן.

הנהלים המשמשים להוכיח כי מערכת העיכול של עורבים אינה מבטלת שעה PRP Res infectivity 4 לאחר gavage האוראלי של homogenate המוח המרוסק של 7. כל העורבים עשרים שgavaged עם חומר PRP Res לאחר מכן מועברים חומר PRP Res באמצעות צואה לעכברים. עכברים חולים זוהו על ידי ביטוי של סימני עכ...

Watch this Scientific Journal Video about Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species at JoVE.com

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

יש אוכלי נבלות פוטנציאל translocate פריונים ספגו מוח העברה זיהומיות בצואה שלהם לאזורים ללא מחלה. שלנו שיטות פירוט משמשות כדי לקבוע אם פריונים מרוסקים מותאמים עכבר יישארו זיהומיות לאחר מעבר למרות שמערכת העיכול של עורבים אמריקאים (brachyrhynchos Corvus), הצריכה נפוצה של בעלי חיים מתים.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

procedures-for-identifying-infectious-prions-after-passage-through

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Views.  USDA.  יש אוכלי נבלות פוטנציאל translocate פריונים ספגו מוח העברה זיהומיות בצואה שלהם לאזורים ללא מחלה. שלנו שיטות פירוט משמשות כדי לקבוע אם פריונים מרוסקים מותאמים עכבר יישארו זיהומיות לאחר מעבר למרות שמערכת העיכול של עורבים אמריקאים (brachyrhynchos Corvus)...

Video: Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in vivo are considered to be of the monocyte lineage2. Certain strains of MVV can replicate in other cell types, however3,4. The green fluorescent protein is a commonly used marker for studying lentiviruses in living cells. We have inserted the egfp gene into the gene for dUTPase of MVV. The dUTPase gene is well conserved in most lentivirus strains of sheep and goats and has been shown to be important in replication of CAEV5. However, dUTPase has been shown to be dispensable for replication of the molecular clone of MVV used in this study both in vitro and in vivo6. MVV replication is strictly confined to cells of sheep or goat origin. We use a primary cell line from the choroid plexus of sheep (SCP cells) for transfection and propagation of the virus7. The fluorescent MVV is fully infectious and EGFP expression is stable over at least 6 passages8. There is good correlation between measurements of TCID50 and EGFP. This virus should therefore be useful for rapid detection of infected cells in studies of cell tropism and pathogenicity in vitro and in vivo8.

We describe a molecular clone of maedi-visna virus that expresses GFP and is fully infectious. Replication of this virus can be detected by using fluorescence microscopy and flow cytometry.

הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 1. רמת בטיחות ביולוגית 4 Suit כניסה ויציאה ונהלים Suite מעבדה

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Work in a biosafety level 4 (BSL-4) containment laboratory requires time and great attention to detail. The same work that is done in a BSL-2 laboratory with non-high-consequence pathogens will take significantly longer in a BSL-4 setting. This increased time requirement is due to a multitude of factors that are aimed at protecting the researcher from laboratory-acquired infections, the work environment from potential contamination and the local community from possible release of high-consequence pathogens. Inside the laboratory, movement is restricted due to air hoses attached to the mandatory full-body safety suits. In addition, disinfection of every item that is removed from Class II biosafety cabinets (BSCs) is required. Laboratory specialists must be trained in the practices of the BSL-4 laboratory and must show high proficiency in the skills they are performing. The focus of this article is to outline proper procedures and techniques to ensure laboratory biosafety and experimental accuracy using a standard viral plaque assay as an example procedure. In particular, proper techniques to work safely in a BSL-4 environment when performing an experiment will be visually emphasized. These techniques include: setting up a Class II BSC for experiments, proper cleaning of the Class II BSC when finished working, waste management and safe disposal of waste generated inside a BSL-4 laboratory, and the removal of inactivated samples from inside a BSL-4 laboratory to the BSL-2 laboratory.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.

אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 2. שיטות כלליות

Work in a biosafety level 4 (BSL-4) containment laboratory requires time and great attention to detail. The same work that is done in a BSL-2 laboratory ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 4. Medical Imaging Procedures

Medical imaging using animal models for human diseases has been utilized for decades; however, until recently, medical imaging of diseases induced by high-consequence pathogens has not been possible. In 2014, the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Integrated Research Facility at Fort Detrick opened an Animal Biosafety Level 4 (ABSL-4) facility to assess the clinical course and pathology of infectious diseases in experimentally infected animals. Multiple imaging modalities including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging, positron emission tomography, and single photon emission computed tomography are available to researchers for these evaluations. The focus of this article is to describe the workflow for safely obtaining a CT image of a live guinea pig in an ABSL-4 facility. These procedures include animal handling, anesthesia, and preparing and monitoring the animal until recovery from sedation. We will also discuss preparing the imaging equipment, performing quality checks, communication methods from "hot side" (containing pathogens) to "cold side," and moving the animal from the holding room to the imaging suite.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 4. Medical Imaging Procedures

Here, we present an overview of the preparation and animal handling procedures required to safely perform medical imaging in an animal biosafety level 4 laboratory. Computed tomography of a mock-infected guinea pig illustrates these procedures that may be used to evaluate the disease caused by a high consequence pathogen.

אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 4. נהלי הדמיה רפואיים

Medical imaging using animal models for human diseases has been utilized for decades; however, until recently, medical imaging of diseases induced by ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol releases or unexpected natural aerosol transmission. Specific laboratories designed to perform these experiments require tremendous engineering controls to provide a safe and secure working environment and constant systems maintenance to sustain functionality. Class III biosafety cabinets, also referred to as gloveboxes, are gas-tight enclosures with non-opening windows. These cabinets are maintained under negative pressure by double high-efficiency-particulate-air (HEPA)-filtered exhaust systems and are the ideal primary containment for housing aerosolization equipment. A well planned workflow between staff members within high containment from, for instance, an animal biosafety level-4 (ABSL-4) suit laboratory to the ABSL-4 cabinet laboratory is a crucial component for successful experimentation. For smooth study execution, establishing a communication network, moving equipment and subjects, and setting up and placing equipment, requires staff members to meticulously plan procedures prior to study initiation. Here, we provide an overview and a visual representation of how aerobiology research is conducted at the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Integrated Research Facility at Fort Detrick, Maryland, USA, within an ABSL-4 environment.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

As high-consequence pathogens can potentially infect subjects through airborne particles, aerobiology has been increasingly applied in pathogenesis research and medical countermeasure development. We present a detailed visual demonstration of aerobiology procedures during an aerosol challenge in nonhuman primates in an animal biosafety level 4 maximum containment environment.

אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 3. Aerobiology

Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...