We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. הכנת תאים וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני assay, תאי הצלחת המתאימים מארח לווירוס בשאלה (טבלה 1 ו -2) ב90-100% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון תיקון של פורמלדהיד 10% ב DH 2 O. בדוגמא, לערבב 5.56 מיליליטר של 36% פורמלדהיד מניות עם 14.44 מיליליטר מזוקק H 2 O (DH 2 O). הערה: שיטות טיפול בטוחות מתאים שימוש ואוורור בעת שימוש בפורמלדהיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כתם סגול גביש: 1% קריסטל ויולט (CV) ב -20% אתנול ו DH 2 א &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת שלט 2x (סוג תא תלוי בריכוז 2x; ראה טבלה 2). לסנן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר אם כל חומרים כימיים לא סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שכבות משתקות (לוח 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכבות נוזל, להפוך את פתרון 2.4% סטרילי של Avicel ב DH 2 O. כדי למנוע יצירת גושים, מוסיף את האבקה לבקבוק המכיל מים ה, במהירות ערבוב עם בר ומערבב שופכים Avicel באיטיות ומערבבים במהירות בטמפרטורת חדר (RT). כאשר הפתרון מוכיח צמיג מדי עבור בר ומערבב להומוגני, לעבור לייקר בקבוק ל&gt; 30 דקות עם תסיסה כבדה כדי להבטיח גם הומוגניזציה. הערה: פתרונות מניות יכולים להתבצע בריכוזים נמוכים, אך הפתרונות יכולים להפריד ויהיה צורך רמיקס כדי להבטיח תפעול. פתרונות עבודה של Avicel ניתן להשתמש החל 0.6-3%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הומוגניזציה, חיטוי הפתרון והחנות האטום ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לagarose ושכבות תאית carboxymethyl (CMC), להכין פתרון המניה ב DH 2 O של 2% CMC או agarose 0.6%. מערבבים עם בר ומערבב וחיטוי או במיקרוגל כדי להביא לפתרון. </li></ol></li></ol> 2. דילולים וזיהומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לאחר ציפוי, לבדוק חזותי את confluency ויכולת קיום של התאים לפני תחילת assay. ודא מורפולוגיה תאית סטנדרטיתnd monolayer ומחוברות ~ 90% היא הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול סדרתי פי עשר מהדגימות זיהומיות. השתמש בתקשורת הצמיחה הסלולרית להתפשטות נגיפית כמדלל (טבלה 2). להשתנות מספר דילולים הנדרשים המבוסס על כייל הצפוי של הנגיף בשאלה, ותמיד להשתמש במדגם שליטה נגוע כדי להבטיח יכולת קיום סלולרית וסיוע בזיהוי לוחית באופן עצמאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהדילולים הסידוריים, להדביק את התאים למשך 45 דקות לשעה 1 (טבלה 1). השתמש בנפח מספיק של הבידוד כדי לכסות את התאים, תוך שמירה על הנפח נמוך ככל האפשר על מנת למקסם את הקשר נגיפי עם monolayer (לוח 4). צלחות בעדינות רוק כל 20 דקות כדי להבטיח גם כיסוי ולמנוע monolayer הסלולרי מייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדבקה, כיסוי נפח מתאים של משתק בינוני ישירות לinoculums בבאר (הטבלה 2) באמצעות 1: לערבב 1 של מדיה שלט 2x וimmobilizing כיסוי של בחירה (CMC, agarose או Avicel). נער בעדינות כדי לערבב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכבות נוזל, לערבב 1: 1 עם תקשורת חיממה 2x רובד ו1.2-2.4% מניות RT Avicel להשיג פתרון עבודה של .6-1.2% בינוניים כיסוי Avicel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכבה agarose, להשתמש 1: תערובת 1 של מדיה שלט 2x חימם ופתרון מניות של agarose 0.6% מחוממים, מקום באמבט מים C ° 56 למשך 30 דקות כדי לאזן את טמפרטורת קבלת ריכוז agarose / כיסוי סופי של 0.3 %. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לCMC, להכין פתרון מניית 2% ולטפל כפי שתואר עבור שכבת agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מיישם את השכבה לmonolayer, תמיד לאזן חם agarose או CMC במים C ° 56 כדי למנוע נזק לשכבה. להבטיח את הפתרון הוא חם, אבל לא חם למגע כדי למנוע מוות של תאים וtiters ויראלי מופחת. רוב שכבות agarose תתחיל לגבש מתחת 42 מעלות צלזיוס, לעבוד במהירות ו / או להכין קבוצות קטנות כדי למנוע התמצקות בזמן הטיפול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תוספת של השכבה, דגירה צלחות לייצר לוחות שונים שהם בבירור ספיר. היווצרות הפלאק יכולה לקחת 2-14 ימים, תלוי בווירוס להיות מנותחים, טבלת 1. הערה: לאחר צלחות מעולפות נוזל ממוקמות בחממה, לא להעביר אותם. תנועה של שכבות הנוזל במהלך תקופת הדגירה תגרום ללוחות נמרחו. שכבות Agarose וCMC הן מוצקה למחצה וניתן להעביר או נבדקות מעת לעת תחת מיקרוסקופ אור לעקוב אחר התפתחות רובד. </li></ol> 3. תיקון ותאי מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן התאים, לשפוך את או לשאוב את שכבת Avicel, ולתקן את התאים באמצעות תמיסת פורמלדהיד 10% למשך 30 דקות ללילה (&lt;1 מ&quot;ל לכל טוב לצלחת גם 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לagarose או CMC, להוסיף ישירות תמיסת פורמלדהיד לכיסוי עבור שעה 1 ללילה. הערה: אפשר לשמור דוגמאות לפרקי זמן ארוכים במקבעות בתנאי שהוא עושהלא תתאדה ויתייבש כמו זה יכול לעוות את השכבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מכתים ולאחר קיבוע, להשליך את הפורמלין, ולהסיר את האטמים המוצק למחצה עבור agarose וCMC גם עם מים זורמים או באופן ידני עם מרית. יש לשטוף את לוחות Avicel עם מים כדי להסיר את כיסוי / מקבע שייר לפני מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים, לכסות את התאים עם כמות מינימאלית של פתרון סגול גביש ל~ 15 דקות. צלחות רוק במידת צורך, כדי להבטיח כיסוי אפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את הכתם סגול קריסטל עם מים. ברגע קבוע, מוכתם, ומיובש, לוחות חנות ללא הגבלת זמן לניתוח בעתיד. </li></ol> 4. קביעת titers ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את השלטים בכל טוב, לוקח את הממוצע לכל משכפל טכני של אותו הדילול. לפורמטי צלחת גדולים, בארות הנחה עם פחות מ 5 או יותר מ -100 לוחות. שימו לב לגודל שלט ומורפולוגיה. הביקורת השלילית צריכה monolayer אחיד ויכול לשמש כשליטת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את כייל הנגיף של מניית המדגם על ידי לקיחת המספר הממוצע של לוחות לדילול והפוך בסך הכל גורם לדילול. </li></ol><img alt="משוואת 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> הערה: כדוגמא, 30 ו -32 לוחות נספרו למשכפל של 1 x 10 -7 הדילול [31 (ממוצע) / 10 -7 (דילול) x 0.4 מיליליטר (הבידוד)] יניב כייל של 7.75 x 10 8 pfu / מיליליטר.

<ol>
	<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li><li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses.">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li><li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses.">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li><li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays.">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , (2011).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata,+Japan,+in+2004+and+2005.">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li><li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication.">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

השיקול החשוב ביותר עבור assay פלאק מוצלח טמון באופטימיזציה של הפרוטוקול לתרבות הנגיפית המסוימת בשאלת תנאים יכולים להשתנות באופן משמעותי. נקודות מפתח לקחת בחשבון הן: לארח תאימות סלולרית עם הווירוס בשאלה, תנאי גידול נגיפיים מתאימים, טווחי דילול מספיק כדי לבדל את הפלאק באופן ברור, ובחירה נכונה כיסוי וצביעה לתאים ווירוס בשאלה. בעוד VEEV וRVFV לגדול בתנאים דומים מאוד ניצול רב של סוגים אותו התא מארח, הבדלים בקינטיקה מורפולוגיה וצמיחת השלט להשתנות באופן משמעותי. בעת השימוש בתאי Vero למבחני פלאק, אשר באופן מסורתי שימשו כקו תא התפשטות ומחוון לאיתור וירוסי קדחת מדממת וalphaviruses, VEEV בדרך כלל גדל למכייל גבוה מRVFV ומדגים מוגבר קינטיקה שכפול, פיתוח לוחות אחידים גדולים ב 48 HPI 4, 10-12. בניגוד לVEEV, RVFV דורש 72 HPI ומדגים לוחות שהם בדרך כלל הרבה יותר קטנים ומשתנים בגודל. בניגוד לRVFV וVEEV, וירוס השפעת הוא מאוד תא מארח ספציפי ויכול להיות קשה כדי להפיץ באמצעות תרבית רקמה. לנגיף השפעת, כניסה והיתוך ויראלי בדרך כלל ביוזמת המחייב של קולט פני תא עם hamagglutinin הנגיפי גליקופרוטאין (HA), שמתווך בכניסה לתא המטרה באמצעות קשירה עם קולט משטח חומצת α-sialic של התא המארח. HA הוא גליקופרוטאין trimeric שנמצא במעטפת הקרום של כל נגיפי השפעת ודורש מחשוף לHA1 יחידות משנה וHA2 על ידי הפרוטאז תא מארח ספציפי. כדי לסבך את הנושא עוד יותר, אתרי מחשוף אלה יכולים לעתים קרובות להשתנות בין זני נגיפים 13. כביטוי של פרוטאזות מסוגלת ביקוע HA מוגבל לרקמות ספציפיות, פרוטאזות arדואר לעתים קרובות הוסיף לתרבית תאי תקשורת על מנת להקל היתוך וכניסה נגיפיים אל תוך תא המארח נבחר 13. TPCK-טריפסין הוא דוגמא אחת לפרוטאז נפוץ המשמש בתרבות תא עם שני תאי Vero MDCK ו: להקל שכפול רב-מחזור (בהעדר סרום inactivating טריפסין) באמצעות הפעלת מפרקי החלבונים של HA ויראלי 14,15. כפי שהודגם במחקר זה ואחרים, הבדלים במחזורי חיים של נגיף יכולים להשפיע על בחירות כיסוי, פורמטי צלחת, ופעמים אוסף, עם סטיות משמעותיות בין מעמדות ומינים של וירוסים שונים. במחקר שלנו, שכבות agarose הפגינו שלטים ברורים יותר בטיטר גבוה יותר מאשר כל אחד CMC או שכבות נוזל לשני RVFV ושפעת B וירוס, חיזוק השירות שלה בקרב מגוון רחב של וירוסים וסוגי תאים. שימוש בריכוז סופי נמוך של agarose סייע רב בהסרת פקקים מוצקים וצביעה פשוטה. CMC כולל הפגין pיעילות oorest כשכבת עבור כל שלושת הווירוסים נבדקו ושלטים קטנים מאוד ולא ברורים הופקו לשפעת B וירוס. למרות CMC הכולל הפגין מאפיינים הפחות רצויים, השימוש בו במהירות גוברת ומאוד וירוסים ארסיים יכולים להוכיח יתרון, כפי שעשה מופיע כדי להקטין את גודל שלט עם ירידה מזערית בלבד בכייל. הכיסוי הנוזלי הוכיח להיות המגוון ביותר בכך שהיא הייתה מאוד פשוטה להכנה, גדל קל שימוש, והיה דומה לagarose על פני כל הווירוסים שנבחרו. בפורמט 96-גם צלחת התפוקה גבוהה יותר, יישום וההסרה לא מעוכב בשל התמצקות כעם שכבות מסורתיות, וסיפק תוצאות מדויקות ועקביות. בחשבון בעת ​​שימוש בשכבות נוזל טמון בצביעה וחוסר היכולת לעקוב אחר היווצרות רובד האטומה שלא ניתן להעביר את הצלחות עד נקודת האיסוף, הגבלת העיבוד הזה לוירוסים עם קינטיקה השכפול אפיין בעבר את. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; שינויים קלים בתנאי assay פלאק יכול לשנות באופן משמעותי את תוצאות, והערכת ביצועים של כל מערכת או שיטה חדשה תמיד היא מוצדקות. בעוד פרוטוקול assay פלאק מותאם ואחיד אינו קיים עבור כל מצב, הדוח שלנו להפגין את הרבגוניות וקלות שימוש במסורתי, כמו גם שכבות נוזל חדשניות למבחני פלאק, תוך מתן רקע מספיק לשינויים נוספים של משתמש.

הבידוד והכימות מדויק של דגימות נגיפיות קיימא היה באופן עקבי מטרת מחקר מתמשכת בוירולוגיה. זה לא היה עד כניסתו של assay פלאק בשנת 1952 כי אמצעי לבחינה איכותי וכמותית לחשב titers ויראלי בעלי החיים פותח 1,2 הראשון. טכניקה זו ראשונה מותאמת ושונה ממבחני הפאג, אשר בעבר שימשו לחישוב titers של פאג&#39;ים המניה בביולוגיה צמח 1,2. בעוד אמצעים חלופיים לכימות נגיפית מאז פיתחו והתאימו, כגון immunoassays, הקרינה ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, חישה מתכונן דופק התנגדות (TRPS), cytometry זרימה, מערכות כתב רקומביננטי, ותגובת השרשרת של פולימראז השעתוק לאחור כמותי (qRT-PCR) , שיטות אלה נכשלים לזהות ולכמת virons המוסמך שכפול 1,3. למרות התקדמות בטכנולוגיות וטכניקות תמשיך לעדן ולשנות את הנוף; plaquמבחני דואר ממשיכים לייצג את תקן הזהב בקביעת ריכוזים נגיפיים לvirons ממס המדבק 1,4. במהלך assay פלאק, monolayer ומחוברות של תאי מארח נגועה בוירוס ממס של ריכוז ידוע כי כבר בדילול סדרתי לטווח ספיר, בדרך כלל בין 5-100 virions. אז monolayers הנגוע מכוסה בכיסוי בינוני משתק כדי למנוע זיהום ויראלי מההבחנה מתפשט גם הזרימה המכנית או convectional של המדיום הנוזלי במהלך התפשטות נגיפית. בעוד שכבות מוצקות או מוצקה למחצה כגון agarose, תאית מתיל או תאית carboxymethyl (CMC) באופן מסורתי שימשו, שכבות נוזל הפכו חלופה אטרקטיבית יותר ויותר עם ​​ההתפתחות של שכבות נוזל רומן כגון Avicel 5 7. יש מבחני פלאק ניצול נוזלי לעומת שכבות מסורתיות יש מספר יתרונות כמו הכיסוי יכול להיות ApplIED בטמפרטורת חדר, ויישום וההסרה קל יותר באופן משמעותי. כשכבות נוזל אינו דורשות התחממות, וירוסים יציבים עדינים וחום עשויים גם להוכיח קל יותר פלאק. לאחר ההדבקה והיישום של השכבה המשתקת, לוחות בודדים, או אזורים של מוות של תאים הראשוניים, יתחיל לפתח זיהום ושכפול נגיפיים כמוגבל לmonolayer שמסביב. תאים נגועים ימשיכו את מעגל השכפול תְמוּגָה-הזיהום, הפצת נוספת הזיהום, וכתוצאה מכך לוחות שונים ובדידים יותר ויותר. בהתאם לתא קינטיקה הצמיחה ומארח הנגיפי משמש, שלט נראה לעין יהיה בדרך כלל יוצר בתוך 2-14 ימים. monolayers סלולרי, אז ייספר עם מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי, או יותר בדרך כלל קבוע וcounterstained על ידי אדום או קריסטל אלים ניטרליים על מנת לזהות בקלות לוחות בעין בלתי מזוינת. יש מגוון רחב של כתמי דלפק שלט זמין, כל הצעה הEir יתרונות וחסרונות ספציפיים. סגול Crystal מתווסף בדרך כלל בנקודת איסוף ולאחר הקיבוע / הסרת הכיסוי, מתן כתם דלפק מהיר וברור המאפשר לזיהוי לוחיות קטנות מאוד כאשר מעורבת מורפולוגיה היא הווה. יש אדום ניטראלי היתרון של יישום מוקדם וקשר רצוף עם השכבה, המאפשר ניטור החי של פיתוח היווצרות רובד, שהוא שימושי במיוחד בעת עבודה עם קינטיקה וירוס או שכפול לא ידועה. עם זאת מצאנו כי צביעה היא בדרך כלל לא בנבדל בעת שימוש באדום ניטראלי. 3 (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל) ברומיד -2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) מציע מספר יתרונות, כמו כתמי צבע בצבע הצהובים לחיות תאים ניתן לספור שלטים כחולים ונגיפיים חשוכים ללא ההסרה של השכבה כ עם אדום ניטראלי. ניגודיות הגבוהה בין תאי חיים ומתים המוענקים על ידי MTT גם מאפשרת זיהוי של לוחיות קטנות בפוסט נקודת זיהום מועד מוקדם יותר, אם כי אחסון יהיה עדיין דורש ההסרה של השכבה 8. כסגול גביש יכול להיות פשוט שנעשה בתמיסה של מים ואלכוהול, ומספק רמה גבוהה של רגישות למורפולוגיה פלאק מעורבת, שבחרנו בו ככתם דלפק מועדף ופשוט לפרוטוקול הפגין כפי שאנו תוך שימוש במספר משפחות של רווחה וירוסים מאופיינים. לאחר תיקון ומכתים את monolayer הסלולרי הנגוע, לוחות נספרים כדי titer דגימות מניית ויראלי במונחים של יחידות פלאק ויוצרים (pfu) למיליליטר. ירידת יומן יצוין בין דילולים סידוריים ו, ​​תלוי בגודל צלחת, בין 5-100 לוחות נספרו, עם ביקורת שלילית המשמשת כנקודת התייחסות. דגימות סטטיסטיים תשתנה ב -10% על כל 100 לוחות נספרו כאשר משווים מדגם משכפל 3. היתרון של שימוש במבחני פלאק כדי לקבוע titers ויראלי טמון ביכולתם לכמת את המספר האמיתי של חלקיקים נגיפיים מדבקים within המדגם. כvirions מרובה עלולה להדביק תא בודד, בטרמינולוגיה של יחידות לעומת virons משמשת במהלך titrations פלאק 1,2. מורפולוגיה הפלאק יכולה להשתנות באופן דרמטי בתנאי גידול שונים ובין מיני ויראלי. גודל שלט, בהירות, הגדרת גבול, והפצה, שכל לציין שהם יכולים לספק מידע רב ערך על גורמי גדילה וארסיים של הנגיף בשאלה. יכולים גם להיות מותאמים עקרונות assay פלאק בסיסיים ושונים במספר הדרכים שונות, כגון בשימוש במבחני מיקוד להרכיב (חומצות שומן חופשיות). חומצות שומן חופשיות לא להסתמך על תמוגה תא וcounterstaining לזהות היווצרות הפלאק, אלא להעסיק immunostaining טכניקות כדי לזהות ישירות חלבונים נגיפיים תאיים באמצעות נוגדנים מתויגים. רגישות מוגברת, ירידה בזמני דגירה לאחר הדבקה, והכי חשוב היכולת לכמת וירוסים לא אלימים כל מובחניםיתרונות כאשר העסקת חומצות שומן חופשיות. בעוד בשימוש נרחב, הגורמים המגבילים הקריטיים בחומצות שומן חופשיות לעומת assay פלאק מסורתי טמון בצורך בנוגדנים מתאימים ויכולת הבדיקה רק עבור יחידות משנה חלבון נגיפיות לעומת virons זיהומיות בפועל 4. לצורך מחקר זה, אנו מגבילים את הדיון שלנו למבחני פלאק קלאסיים ומתארים את השימוש בשכבות מסורתיות מוצקות ומוצקות למחצה (CMC agarose ו), יחד עם שכבות תאית מייקרו נוזל רומן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

מבחני פלאק יישארו אחת מהשיטות מדויקות ביותר לכימות הישיר של virons זיהומיות וחומרים אנטי בספירת לוחות בדידים (יחידות זיהומיות ואזורים מתים סלולריים) בתרבית תאים. כאן אנו מדגימים כיצד לבצע assay פלאק בסיסי, וכיצד שכבות וטכניקות שונות מן יכולים להשפיע על היווצרות וייצור שלט. בדרך כלל מצעי כיסוי מוצקים או מוצק למחצה, כגון agarose או תאית carboxymethyl, היו בשימוש כדי להגביל את ההתפשטות נגיפית, מניעת זיהום ללא הבחנה דרך מדיום הגידול הנוזלי. שכבות משותקות להגביל זיהום סלולארי לmonolayer הסמוך, המאפשרות יצירת מוקדי ספיר דיסקרטיים והיווצרות הרובד הבאה. כדי להתגבר על הקשיים כרוכים בשימוש בשכבות מסורתיות, כיסוי נוזל רומן ניצול תאית מייקרו ונתרן תאית carboxymethyl כבר בשימוש יותר ויותר כתחליף בתקןassay פלאק. מבחני פלאק כיסוי נוזליים יכולים להתבצע בקלות בכל 6 או 12 פורמטי צלחת גם סטנדרטיים כמו לכל טכניקות מסורתיות ואין צורך בציוד מיוחד. בשל המצב הנוזלי שלה וקלות הבאים של יישומים וההסרה, פורמטי צלחת microculture יכולים לחלופין להיות מנוצלים כחלופה תפוקה מהירה, מדויקת וגבוהה לtitrations ויראלי קנה מידה גדולה יותר. שימוש בפולימר נוזלי שאינו מחומם צמיג מציע הזדמנות כדי לייעל את העבודה, חוסך בחומרים כימיים, חלל חממה, ועליית בטיחות מבצעית בעת שימוש במעבדות בלימה מסורתיות או גבוהות כמו אין חימום מגיב או כלי זכוכית נדרשת. שכבות נוזל עשויות גם להוכיח רגישות יותר משכבות מסורתיות לאיתור וירוסים יציבים חום מסוים.

היכולת של מבחני פלאק להעריך נכונה titers ויראלי מסתמכת על מספר רב של גורמים: בחירת תא המארח מתאימה, תקשורת נכונה ותנאי גידול לכדאיות סלולרית ונגיפית, התפשטות נגיפית משותקת, וקביעה מדויקת של תקופת הדגירה הנגיפית כדי לאפשר זמן מספיק לצורך ברור והיווצרות רובד ספיר. במחקר זה, וירוסים משלוש משפחות מייצגות נבחרו כדי להדגים הבדלים ב: בחירת כיסוי, תקופת דגירה, ומורפולוגיה פלאק על פני שונה סוגי מדגם. ונצואלה סוסי דלקת קרום המוח (VEEV) נבחרה כמודל ויראלי (+) ssRNA, אשר יכול לגרום למחלה משמעותית במינים ובני אדם סוסים ומייצג את משפחת Togaviridae. מתח טייוואן השפעת B, מפולח (-) וירוס ssRNA בעיקר מדביק בני אדם, מייצג את משפחת Orthomyxoviridae. בקעת וירוס קדחת (RVFV), - וירוס של פרוקים-רגלי ssRNA נולד בעיקר הדבקת פרוקי רגליים, ()מעלי גירה ובני אדם, נבחר כנציג משפחת Bunyaviridae. לRVFV (איור 1), כייל נקבעו מפתרון מניות של זן רקומביננטי חי מוחלש MP12 של RVFV בפורמט 12 צלחת גם ניצול CMC, agarose, או שכבות Avicel שהודגרו צד-לצד לזיהום שלאחר 72 שעות (HPI). צלחת נציג מראה דילולים הנעים בין 10 4- עד 10 -7 ניתן לראות בלוחות א לוח באמצעות CMC ושכבות agarose הראו שלטים קטנים, ברורים, וברורים עם גבול מעגלי מוגדר היטב. לוחות עם כיסוי נוזל היו מעט יותר עשירים וגדולים יותר בהשוואה לagarose ושלטי CMC, וסיפקו גבול פחות ברור. titers ויראלי הושווה בלוח ב &#39;עם כל שכבות ביצוע comparably. על מנת לקבל השוואה ויזואלית ברורה בין שכבות לMP12 יחד עם גודל מדגם גדול יותר כדי לקבוע רפרודוקציהibility, צלחת 6 היטב גם trialed בשלושה עותקים (איור 2). בפורמט צלחת 6 היטב, השימוש בכיסוי CMC הראה לוחות קטנים יותר או שכבות agarose או נוזל, שהיו דומים בהגודל לזה. וכייל נגיפיים היו דומים בין כל שלוש שכבות (לוח ד &#39;), לוחות שנוצרו בשכבות agarose ונוזל הוכיחו קלים יותר לספור בשל הגודל המוגבר שלהם. בניגוד לRVFV, כייל VEEV ומורפולוגיה רובד בין שכבות השונות מגוונות במידה ניכרת (איור 3 א). לוחות נוצרו בשכבות CMC הפגינו מורפולוגיה ברורה ומובחנת בעת שימוש בתבנית צלחת גם 12, על חשבון גודל שלט ורגישות (לוח ב &#39;). בניגוד לCMC, השימוש בשכבות agarose והנוזל הביאו לוחות גדולים יותר באופן משמעותי, המצביע נמוך עיכוב נגיפי ורגישות מוגברת לשכפול VEEV. זו אושרה בעבר אך ורק כאשר משווה agarose לעומת CMC בapaper פורסם על ידי חוארז et al. 4. בעוד agarose ונוזלי שכבות מיוצרות לוחות גדולים יותר מCMC, הלוחות שמוגדרים היטב גבולות והיו קשים לספור בפורמט גם 12, עם שכבות נוזל המספקות דיפוזיה הגבול הגדולה ביותר. כאשר לוחות היו trialed ב 6 צלחות היטב (איור 4), הפורמט גם 6 הגדול שלל את הנושא של לוחות גדולים בגלוי שהיו קשה להבדיל בפורמט גם 12, עם agarose ושכבות נוזל המוכיחים עדיף על שכבות CMC במונחים של הגדרת שלט וברגישות (4D איור). בהשוואה לRVFV או VEEV, שפעת מספקת מספר אתגרים ייחודיים בעת plaquing, כגון החובה של פרוטאז חיצוני. הרגישות של נגיף שפעת לבחירות של כיסוי שונה גם תועדה היטב בעבר כשינויים משמעותיים כבר ציינו כאשר שינויים קלים כמו שונה מותגים של agarose יש להיותen משמש 9. מעניין עבור זן השפעת B טייוואן, השימוש בCMC כשכבת הביא לוחות ניכר קטנים יותר שהיו קשים לספור והיו קשה להבקיע אמין (איור 5 א). השימוש בשכבת agarose סיפק את הלוחות הטובים ביותר (לוח ג), וגרם לכתם כהה ברקע (כנראה עקב כדאיות monolayer מוגברת), והראה שלטים ברורים וחדים יותר בהשוואה ישירה לשימוש בשכבת הנוזל (לוח ב &#39; ). יתרון בולט של פולימרים נוזליים על שכבות מוצקות ומוצקות למחצה, כגון agarose וCMC, טמון בקלות של ההסרה ויישום. שכבות חצי קשות דורשות חימום, ומיצוק יכול להתגלות כבעייתי בעת טיפול והסרת. על מנת לנצל את היתרונות הללו ולקבוע את המעשיות של ניצול Avicel באופן תפוקה גבוהה לRVFV, פורמט צלחת 96 גם היה trialed בconcentrati כיסוי שונהתוספות (איור 6). לRVFV MP-12, דילולים בוצעו ארבע פעמים בשני 0.6 ו -1.2% הריכוזים הסופיים של Avicel. יישום והסרת כיסוי הוכיחו פשוטים, ללא הבדלים נראות לעין בין משכפל או בין הריכוזים ציינו, מפגינים רמה גבוהה של שחזור. כאשר הבקיע, לוחות היו ברורים וספיר לעין בלתי מזוינת, הוכחת ההיתכנות של ניצול שכבות נוזל באופן תפוקה גבוה לRVFV. <img alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> איור 1:. השוואות כיסוי פלאק RVFV ניצול 12 צלחות גם Veros היו מצופות על 2.5 x 10 5 תאים ב -12 צלחות גם ונגוע ב200 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של MP12. לאחר ההדבקה 1.5 שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC (ג הסופיoncentrations), יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגם בלוח א הפלאק נספרו וtitered בלוח ב &#39;. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> איור 2:. השוואות כיסוי פלאק RVFV ניצול 6 צלחות גם Veros היו מצופות ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגוע ב400 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של MP12. שלוש שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמו בלוח, ניסויים נפרדים B, ו- C. בוצעו באופן זהה כפי שתואר עבור הפנלים AC, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> איור 3: &lt;השוואות strong&gt; שלט VEEV כיסוי ניצול 12 צלחות גם. Veros היו מצופות על 2.5 x 10 5 תאים ב -12 צלחות גם ונגועה ב200 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של זן תרכיב VEEV TC-83. לאחר הדבקת 1.5 שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמו בלוח א הפלאק נספרו וtitered בלוח ב &#39; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> איור 4:. השוואות כיסוי פלאק EEV V ניצול 6 צלחות גם Veros היו מצופות ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגועה ב400 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של VEEV TC-83. לאחר הדבקה, 3 מיליליטר שכבות של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמהבפנלים, ניסויים נפרדים &#39;ו- ג בוצעו באופן זהה כפי שתוארו עבור פנלים - C, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> איור 5: השוואת כיסוי פלאק שפעת תאי MDCK היו מצופים ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגוע ב400 μl של הבידוד תוך שימוש באותו דילול סדרתי המדגם התחלתי של שפעת B טייוואן.. אין בסרום שור העובר (FBS) שימש בתקשורת הצמיחה או שכבות, כמו FBS יכול לעכב התפשטות שפעת באמצעות עיכוב של פרוטאזות מסוימת הנדרשים להיתוך ויראלי. TPCK-טריפסין התווסף לכל שכבות לפני יישום על מנת לאפשר איחוי ויראלי וכניסה עם תאי המארח. לאחר הדבקה, 3 מיליליטר שכבות של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC יושמו על מנת להשוות באופן ישירשכבות כפי שהודגם בלוח, B וניסויים נפרדים ג בוצעו באופן זהה כפי שתוארו בפנלים - C, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). בעוד ממוצע נלקח ללוחות CMC הם היו קשים לספור באופן אמין כפי שהם הפגינו גבולות מפוזרים וגדלי שלט קטנים מאוד. <img alt="איור 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> איור 6:. שכבות שלט תפוקה גבוהה צלחת גם 96 של Veros מצופה ב 3 x 10 4 תאים לכל טוב, היו נגועות ב-50 μl של הבידוד תוך שימוש באותו דילול סדרתי מדגם התחלתי של RVFV MP12 עבור שעה 1, ארבע פעמים. לשכבות, 0.6 ו -1.2% ריכוזים סופיים של Avicel היו trialed כדי לקבוע את הכדאיות ואת שחזור של ניצול שכבות נוזל באופן תפוקה גבוהה, פנלי A ו- B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> שפעת B </td></tr><tr><td> סוג התא </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> תקופת הדבקה </td><td> 1 שעה </td><td> 1 שעה </td><td> 45 דקות </td></tr><tr><td> זמן דגירה </td><td> 3 ימים </td><td> 2 ימים </td><td> 3 ימים </td></tr></tbody></table> סוגי רובד תנאי הרכבת Assay וניידים: טבלה 1 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> שפעת B </td></tr><tr><td> סוג התא </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> סוג גידול</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> שלט מדיה </td><td> 2xEMEM </td><td> 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> הנשר בינוני השתנה של 1. Dulbecco בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 1% L-גלוטמין, 1% Penicllin / סטרפטומיצין. הנשר בינוני השתנה של 2. Dulbecco בתוספת 1% L-גלוטמין, 1% Penicllin / סטרפטומיצין, 0.2% בסרום אלבומין שור, 0.025% HEPES, 50ug / מיליליטר DEAE-Dextran. מדיה א 2x המינימלית חיונית (500 מיליליטר) בתוספת 5% FBS (25 מיליליטר), חומצות אמינו (5 מיליליטר) Essential 1% מינימום, 1% נתרן פירובט (5 מיליליטר), 1% L-גלוטמין (5 מיליליטר), 2% פן / סטרפטוקוקוס (10 מיליליטר). מדיה ב 2x המינימלי חיונית (500 מיליליטר) בתוספת 0.2% הסרום אלבומין שור, חומצות אמינו חיוניות 1% מזערי (5 מיליליטר), 50ug / מיליליטר, 0.025% HEPES, DEAE-Dextran, טריפסין-TPCK * * רק לפני ההכנה, להוסיף 1 μl לכל 25מיליליטר של 2 מיקרוגרם / מיליליטר מניות של TPCK-טריפסין לaliquot תשתמש לערבב עם agarose ללוחות. טבלה 2: רובד וויראלי / סלולארי הצמיחה Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> שפעת B </td></tr><tr><td> סוג התא </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> תקופת הדבקה </td><td> 1 שעה </td><td> 1 שעה </td><td> 45 דקות </td></tr><tr><td> זמן דגירה </td><td> 3 ימים </td><td> 2 ימים </td><td> 3 ימים </td></tr></tbody></table> פתרונות כיסוי לא יפקעו כאשר עשו כל כך הרבה זמן כעקרות נשמר. טבלה 3: מאגר בשכבות <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 6 גם </td><td> גם 12 </td><td> 96 גם </td></tr><tr><td> # של תאים / היטב </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2.5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> נפח של innoculum (μl) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> נפח של שכבה (מיליליטר) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> לוח 4: פורמטי פלייט

Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

110.2K Views.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Video: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Assay רובד לnorovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.