We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. הכנת תאים וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני assay, תאי הצלחת המתאימים מארח לווירוס בשאלה (טבלה 1 ו -2) ב90-100% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון תיקון של פורמלדהיד 10% ב DH 2 O. בדוגמא, לערבב 5.56 מיליליטר של 36% פורמלדהיד מניות עם 14.44 מיליליטר מזוקק H 2 O (DH 2 O). הערה: שיטות טיפול בטוחות מתאים שימוש ואוורור בעת שימוש בפורמלדהיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כתם סגול גביש: 1% קריסטל ויולט (CV) ב -20% אתנול ו DH 2 א &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת שלט 2x (סוג תא תלוי בריכוז 2x; ראה טבלה 2). לסנן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר אם כל חומרים כימיים לא סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שכבות משתקות (לוח 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכבות נוזל, להפוך את פתרון 2.4% סטרילי של Avicel ב DH 2 O. כדי למנוע יצירת גושים, מוסיף את האבקה לבקבוק המכיל מים ה, במהירות ערבוב עם בר ומערבב שופכים Avicel באיטיות ומערבבים במהירות בטמפרטורת חדר (RT). כאשר הפתרון מוכיח צמיג מדי עבור בר ומערבב להומוגני, לעבור לייקר בקבוק ל&gt; 30 דקות עם תסיסה כבדה כדי להבטיח גם הומוגניזציה. הערה: פתרונות מניות יכולים להתבצע בריכוזים נמוכים, אך הפתרונות יכולים להפריד ויהיה צורך רמיקס כדי להבטיח תפעול. פתרונות עבודה של Avicel ניתן להשתמש החל 0.6-3%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הומוגניזציה, חיטוי הפתרון והחנות האטום ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לagarose ושכבות תאית carboxymethyl (CMC), להכין פתרון המניה ב DH 2 O של 2% CMC או agarose 0.6%. מערבבים עם בר ומערבב וחיטוי או במיקרוגל כדי להביא לפתרון. </li></ol></li></ol> 2. דילולים וזיהומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לאחר ציפוי, לבדוק חזותי את confluency ויכולת קיום של התאים לפני תחילת assay. ודא מורפולוגיה תאית סטנדרטיתnd monolayer ומחוברות ~ 90% היא הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול סדרתי פי עשר מהדגימות זיהומיות. השתמש בתקשורת הצמיחה הסלולרית להתפשטות נגיפית כמדלל (טבלה 2). להשתנות מספר דילולים הנדרשים המבוסס על כייל הצפוי של הנגיף בשאלה, ותמיד להשתמש במדגם שליטה נגוע כדי להבטיח יכולת קיום סלולרית וסיוע בזיהוי לוחית באופן עצמאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהדילולים הסידוריים, להדביק את התאים למשך 45 דקות לשעה 1 (טבלה 1). השתמש בנפח מספיק של הבידוד כדי לכסות את התאים, תוך שמירה על הנפח נמוך ככל האפשר על מנת למקסם את הקשר נגיפי עם monolayer (לוח 4). צלחות בעדינות רוק כל 20 דקות כדי להבטיח גם כיסוי ולמנוע monolayer הסלולרי מייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדבקה, כיסוי נפח מתאים של משתק בינוני ישירות לinoculums בבאר (הטבלה 2) באמצעות 1: לערבב 1 של מדיה שלט 2x וimmobilizing כיסוי של בחירה (CMC, agarose או Avicel). נער בעדינות כדי לערבב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכבות נוזל, לערבב 1: 1 עם תקשורת חיממה 2x רובד ו1.2-2.4% מניות RT Avicel להשיג פתרון עבודה של .6-1.2% בינוניים כיסוי Avicel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכבה agarose, להשתמש 1: תערובת 1 של מדיה שלט 2x חימם ופתרון מניות של agarose 0.6% מחוממים, מקום באמבט מים C ° 56 למשך 30 דקות כדי לאזן את טמפרטורת קבלת ריכוז agarose / כיסוי סופי של 0.3 %. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לCMC, להכין פתרון מניית 2% ולטפל כפי שתואר עבור שכבת agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מיישם את השכבה לmonolayer, תמיד לאזן חם agarose או CMC במים C ° 56 כדי למנוע נזק לשכבה. להבטיח את הפתרון הוא חם, אבל לא חם למגע כדי למנוע מוות של תאים וtiters ויראלי מופחת. רוב שכבות agarose תתחיל לגבש מתחת 42 מעלות צלזיוס, לעבוד במהירות ו / או להכין קבוצות קטנות כדי למנוע התמצקות בזמן הטיפול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תוספת של השכבה, דגירה צלחות לייצר לוחות שונים שהם בבירור ספיר. היווצרות הפלאק יכולה לקחת 2-14 ימים, תלוי בווירוס להיות מנותחים, טבלת 1. הערה: לאחר צלחות מעולפות נוזל ממוקמות בחממה, לא להעביר אותם. תנועה של שכבות הנוזל במהלך תקופת הדגירה תגרום ללוחות נמרחו. שכבות Agarose וCMC הן מוצקה למחצה וניתן להעביר או נבדקות מעת לעת תחת מיקרוסקופ אור לעקוב אחר התפתחות רובד. </li></ol> 3. תיקון ותאי מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן התאים, לשפוך את או לשאוב את שכבת Avicel, ולתקן את התאים באמצעות תמיסת פורמלדהיד 10% למשך 30 דקות ללילה (&lt;1 מ&quot;ל לכל טוב לצלחת גם 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לagarose או CMC, להוסיף ישירות תמיסת פורמלדהיד לכיסוי עבור שעה 1 ללילה. הערה: אפשר לשמור דוגמאות לפרקי זמן ארוכים במקבעות בתנאי שהוא עושהלא תתאדה ויתייבש כמו זה יכול לעוות את השכבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מכתים ולאחר קיבוע, להשליך את הפורמלין, ולהסיר את האטמים המוצק למחצה עבור agarose וCMC גם עם מים זורמים או באופן ידני עם מרית. יש לשטוף את לוחות Avicel עם מים כדי להסיר את כיסוי / מקבע שייר לפני מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים, לכסות את התאים עם כמות מינימאלית של פתרון סגול גביש ל~ 15 דקות. צלחות רוק במידת צורך, כדי להבטיח כיסוי אפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את הכתם סגול קריסטל עם מים. ברגע קבוע, מוכתם, ומיובש, לוחות חנות ללא הגבלת זמן לניתוח בעתיד. </li></ol> 4. קביעת titers ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את השלטים בכל טוב, לוקח את הממוצע לכל משכפל טכני של אותו הדילול. לפורמטי צלחת גדולים, בארות הנחה עם פחות מ 5 או יותר מ -100 לוחות. שימו לב לגודל שלט ומורפולוגיה. הביקורת השלילית צריכה monolayer אחיד ויכול לשמש כשליטת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את כייל הנגיף של מניית המדגם על ידי לקיחת המספר הממוצע של לוחות לדילול והפוך בסך הכל גורם לדילול. </li></ol><img alt="משוואת 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> הערה: כדוגמא, 30 ו -32 לוחות נספרו למשכפל של 1 x 10 -7 הדילול [31 (ממוצע) / 10 -7 (דילול) x 0.4 מיליליטר (הבידוד)] יניב כייל של 7.75 x 10 8 pfu / מיליליטר.

<ol>
	<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li><li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses.">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li><li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses.">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li><li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays.">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , (2011).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata,+Japan,+in+2004+and+2005.">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li><li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication.">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

השיקול החשוב ביותר עבור assay פלאק מוצלח טמון באופטימיזציה של הפרוטוקול לתרבות הנגיפית המסוימת בשאלת תנאים יכולים להשתנות באופן משמעותי. נקודות מפתח לקחת בחשבון הן: לארח תאימות סלולרית עם הווירוס בשאלה, תנאי גידול נגיפיים מתאימים, טווחי דילול מספיק כדי לבדל את הפלאק באופן ברור, ובחירה נכונה כיסוי וצביעה לתאים ווירוס בשאלה. בעוד VEEV וRVFV לגדול בתנאים דומים מאוד ניצול רב של סוגים אותו התא מארח, הבדלים בקינטיקה מורפולוגיה וצמיחת השלט להשתנות באופן משמעותי. בעת השימוש בתאי Vero למבחני פלאק, אשר באופן מסורתי שימשו כקו תא התפשטות ומחוון לאיתור וירוסי קדחת מדממת וalphaviruses, VEEV בדרך כלל גדל למכייל גבוה מRVFV ומדגים מוגבר קינטיקה שכפול, פיתוח לוחות אחידים גדולים ב 48 HPI 4, 10-12. בניגוד לVEEV, RVFV דורש 72 HPI ומדגים לוחות שהם בדרך כלל הרבה יותר קטנים ומשתנים בגודל. בניגוד לRVFV וVEEV, וירוס השפעת הוא מאוד תא מארח ספציפי ויכול להיות קשה כדי להפיץ באמצעות תרבית רקמה. לנגיף השפעת, כניסה והיתוך ויראלי בדרך כלל ביוזמת המחייב של קולט פני תא עם hamagglutinin הנגיפי גליקופרוטאין (HA), שמתווך בכניסה לתא המטרה באמצעות קשירה עם קולט משטח חומצת α-sialic של התא המארח. HA הוא גליקופרוטאין trimeric שנמצא במעטפת הקרום של כל נגיפי השפעת ודורש מחשוף לHA1 יחידות משנה וHA2 על ידי הפרוטאז תא מארח ספציפי. כדי לסבך את הנושא עוד יותר, אתרי מחשוף אלה יכולים לעתים קרובות להשתנות בין זני נגיפים 13. כביטוי של פרוטאזות מסוגלת ביקוע HA מוגבל לרקמות ספציפיות, פרוטאזות arדואר לעתים קרובות הוסיף לתרבית תאי תקשורת על מנת להקל היתוך וכניסה נגיפיים אל תוך תא המארח נבחר 13. TPCK-טריפסין הוא דוגמא אחת לפרוטאז נפוץ המשמש בתרבות תא עם שני תאי Vero MDCK ו: להקל שכפול רב-מחזור (בהעדר סרום inactivating טריפסין) באמצעות הפעלת מפרקי החלבונים של HA ויראלי 14,15. כפי שהודגם במחקר זה ואחרים, הבדלים במחזורי חיים של נגיף יכולים להשפיע על בחירות כיסוי, פורמטי צלחת, ופעמים אוסף, עם סטיות משמעותיות בין מעמדות ומינים של וירוסים שונים. במחקר שלנו, שכבות agarose הפגינו שלטים ברורים יותר בטיטר גבוה יותר מאשר כל אחד CMC או שכבות נוזל לשני RVFV ושפעת B וירוס, חיזוק השירות שלה בקרב מגוון רחב של וירוסים וסוגי תאים. שימוש בריכוז סופי נמוך של agarose סייע רב בהסרת פקקים מוצקים וצביעה פשוטה. CMC כולל הפגין pיעילות oorest כשכבת עבור כל שלושת הווירוסים נבדקו ושלטים קטנים מאוד ולא ברורים הופקו לשפעת B וירוס. למרות CMC הכולל הפגין מאפיינים הפחות רצויים, השימוש בו במהירות גוברת ומאוד וירוסים ארסיים יכולים להוכיח יתרון, כפי שעשה מופיע כדי להקטין את גודל שלט עם ירידה מזערית בלבד בכייל. הכיסוי הנוזלי הוכיח להיות המגוון ביותר בכך שהיא הייתה מאוד פשוטה להכנה, גדל קל שימוש, והיה דומה לagarose על פני כל הווירוסים שנבחרו. בפורמט 96-גם צלחת התפוקה גבוהה יותר, יישום וההסרה לא מעוכב בשל התמצקות כעם שכבות מסורתיות, וסיפק תוצאות מדויקות ועקביות. בחשבון בעת ​​שימוש בשכבות נוזל טמון בצביעה וחוסר היכולת לעקוב אחר היווצרות רובד האטומה שלא ניתן להעביר את הצלחות עד נקודת האיסוף, הגבלת העיבוד הזה לוירוסים עם קינטיקה השכפול אפיין בעבר את. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; שינויים קלים בתנאי assay פלאק יכול לשנות באופן משמעותי את תוצאות, והערכת ביצועים של כל מערכת או שיטה חדשה תמיד היא מוצדקות. בעוד פרוטוקול assay פלאק מותאם ואחיד אינו קיים עבור כל מצב, הדוח שלנו להפגין את הרבגוניות וקלות שימוש במסורתי, כמו גם שכבות נוזל חדשניות למבחני פלאק, תוך מתן רקע מספיק לשינויים נוספים של משתמש.

הבידוד והכימות מדויק של דגימות נגיפיות קיימא היה באופן עקבי מטרת מחקר מתמשכת בוירולוגיה. זה לא היה עד כניסתו של assay פלאק בשנת 1952 כי אמצעי לבחינה איכותי וכמותית לחשב titers ויראלי בעלי החיים פותח 1,2 הראשון. טכניקה זו ראשונה מותאמת ושונה ממבחני הפאג, אשר בעבר שימשו לחישוב titers של פאג&#39;ים המניה בביולוגיה צמח 1,2. בעוד אמצעים חלופיים לכימות נגיפית מאז פיתחו והתאימו, כגון immunoassays, הקרינה ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, חישה מתכונן דופק התנגדות (TRPS), cytometry זרימה, מערכות כתב רקומביננטי, ותגובת השרשרת של פולימראז השעתוק לאחור כמותי (qRT-PCR) , שיטות אלה נכשלים לזהות ולכמת virons המוסמך שכפול 1,3. למרות התקדמות בטכנולוגיות וטכניקות תמשיך לעדן ולשנות את הנוף; plaquמבחני דואר ממשיכים לייצג את תקן הזהב בקביעת ריכוזים נגיפיים לvirons ממס המדבק 1,4. במהלך assay פלאק, monolayer ומחוברות של תאי מארח נגועה בוירוס ממס של ריכוז ידוע כי כבר בדילול סדרתי לטווח ספיר, בדרך כלל בין 5-100 virions. אז monolayers הנגוע מכוסה בכיסוי בינוני משתק כדי למנוע זיהום ויראלי מההבחנה מתפשט גם הזרימה המכנית או convectional של המדיום הנוזלי במהלך התפשטות נגיפית. בעוד שכבות מוצקות או מוצקה למחצה כגון agarose, תאית מתיל או תאית carboxymethyl (CMC) באופן מסורתי שימשו, שכבות נוזל הפכו חלופה אטרקטיבית יותר ויותר עם ​​ההתפתחות של שכבות נוזל רומן כגון Avicel 5 7. יש מבחני פלאק ניצול נוזלי לעומת שכבות מסורתיות יש מספר יתרונות כמו הכיסוי יכול להיות ApplIED בטמפרטורת חדר, ויישום וההסרה קל יותר באופן משמעותי. כשכבות נוזל אינו דורשות התחממות, וירוסים יציבים עדינים וחום עשויים גם להוכיח קל יותר פלאק. לאחר ההדבקה והיישום של השכבה המשתקת, לוחות בודדים, או אזורים של מוות של תאים הראשוניים, יתחיל לפתח זיהום ושכפול נגיפיים כמוגבל לmonolayer שמסביב. תאים נגועים ימשיכו את מעגל השכפול תְמוּגָה-הזיהום, הפצת נוספת הזיהום, וכתוצאה מכך לוחות שונים ובדידים יותר ויותר. בהתאם לתא קינטיקה הצמיחה ומארח הנגיפי משמש, שלט נראה לעין יהיה בדרך כלל יוצר בתוך 2-14 ימים. monolayers סלולרי, אז ייספר עם מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי, או יותר בדרך כלל קבוע וcounterstained על ידי אדום או קריסטל אלים ניטרליים על מנת לזהות בקלות לוחות בעין בלתי מזוינת. יש מגוון רחב של כתמי דלפק שלט זמין, כל הצעה הEir יתרונות וחסרונות ספציפיים. סגול Crystal מתווסף בדרך כלל בנקודת איסוף ולאחר הקיבוע / הסרת הכיסוי, מתן כתם דלפק מהיר וברור המאפשר לזיהוי לוחיות קטנות מאוד כאשר מעורבת מורפולוגיה היא הווה. יש אדום ניטראלי היתרון של יישום מוקדם וקשר רצוף עם השכבה, המאפשר ניטור החי של פיתוח היווצרות רובד, שהוא שימושי במיוחד בעת עבודה עם קינטיקה וירוס או שכפול לא ידועה. עם זאת מצאנו כי צביעה היא בדרך כלל לא בנבדל בעת שימוש באדום ניטראלי. 3 (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל) ברומיד -2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) מציע מספר יתרונות, כמו כתמי צבע בצבע הצהובים לחיות תאים ניתן לספור שלטים כחולים ונגיפיים חשוכים ללא ההסרה של השכבה כ עם אדום ניטראלי. ניגודיות הגבוהה בין תאי חיים ומתים המוענקים על ידי MTT גם מאפשרת זיהוי של לוחיות קטנות בפוסט נקודת זיהום מועד מוקדם יותר, אם כי אחסון יהיה עדיין דורש ההסרה של השכבה 8. כסגול גביש יכול להיות פשוט שנעשה בתמיסה של מים ואלכוהול, ומספק רמה גבוהה של רגישות למורפולוגיה פלאק מעורבת, שבחרנו בו ככתם דלפק מועדף ופשוט לפרוטוקול הפגין כפי שאנו תוך שימוש במספר משפחות של רווחה וירוסים מאופיינים. לאחר תיקון ומכתים את monolayer הסלולרי הנגוע, לוחות נספרים כדי titer דגימות מניית ויראלי במונחים של יחידות פלאק ויוצרים (pfu) למיליליטר. ירידת יומן יצוין בין דילולים סידוריים ו, ​​תלוי בגודל צלחת, בין 5-100 לוחות נספרו, עם ביקורת שלילית המשמשת כנקודת התייחסות. דגימות סטטיסטיים תשתנה ב -10% על כל 100 לוחות נספרו כאשר משווים מדגם משכפל 3. היתרון של שימוש במבחני פלאק כדי לקבוע titers ויראלי טמון ביכולתם לכמת את המספר האמיתי של חלקיקים נגיפיים מדבקים within המדגם. כvirions מרובה עלולה להדביק תא בודד, בטרמינולוגיה של יחידות לעומת virons משמשת במהלך titrations פלאק 1,2. מורפולוגיה הפלאק יכולה להשתנות באופן דרמטי בתנאי גידול שונים ובין מיני ויראלי. גודל שלט, בהירות, הגדרת גבול, והפצה, שכל לציין שהם יכולים לספק מידע רב ערך על גורמי גדילה וארסיים של הנגיף בשאלה. יכולים גם להיות מותאמים עקרונות assay פלאק בסיסיים ושונים במספר הדרכים שונות, כגון בשימוש במבחני מיקוד להרכיב (חומצות שומן חופשיות). חומצות שומן חופשיות לא להסתמך על תמוגה תא וcounterstaining לזהות היווצרות הפלאק, אלא להעסיק immunostaining טכניקות כדי לזהות ישירות חלבונים נגיפיים תאיים באמצעות נוגדנים מתויגים. רגישות מוגברת, ירידה בזמני דגירה לאחר הדבקה, והכי חשוב היכולת לכמת וירוסים לא אלימים כל מובחניםיתרונות כאשר העסקת חומצות שומן חופשיות. בעוד בשימוש נרחב, הגורמים המגבילים הקריטיים בחומצות שומן חופשיות לעומת assay פלאק מסורתי טמון בצורך בנוגדנים מתאימים ויכולת הבדיקה רק עבור יחידות משנה חלבון נגיפיות לעומת virons זיהומיות בפועל 4. לצורך מחקר זה, אנו מגבילים את הדיון שלנו למבחני פלאק קלאסיים ומתארים את השימוש בשכבות מסורתיות מוצקות ומוצקות למחצה (CMC agarose ו), יחד עם שכבות תאית מייקרו נוזל רומן.

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>For serial dilutions</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Heat inactivate before use at 62 &amp;#176;C for 30 min</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Shake vigorously when reconsitiuting&amp;nbsp; for &gt;30 min to homogenize</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

מבחני פלאק יישארו אחת מהשיטות מדויקות ביותר לכימות הישיר של virons זיהומיות וחומרים אנטי בספירת לוחות בדידים (יחידות זיהומיות ואזורים מתים סלולריים) בתרבית תאים. כאן אנו מדגימים כיצד לבצע assay פלאק בסיסי, וכיצד שכבות וטכניקות שונות מן יכולים להשפיע על היווצרות וייצור שלט. בדרך כלל מצעי כיסוי מוצקים או מוצק למחצה, כגון agarose או תאית carboxymethyl, היו בשימוש כדי להגביל את ההתפשטות נגיפית, מניעת זיהום ללא הבחנה דרך מדיום הגידול הנוזלי. שכבות משותקות להגביל זיהום סלולארי לmonolayer הסמוך, המאפשרות יצירת מוקדי ספיר דיסקרטיים והיווצרות הרובד הבאה. כדי להתגבר על הקשיים כרוכים בשימוש בשכבות מסורתיות, כיסוי נוזל רומן ניצול תאית מייקרו ונתרן תאית carboxymethyl כבר בשימוש יותר ויותר כתחליף בתקןassay פלאק. מבחני פלאק כיסוי נוזליים יכולים להתבצע בקלות בכל 6 או 12 פורמטי צלחת גם סטנדרטיים כמו לכל טכניקות מסורתיות ואין צורך בציוד מיוחד. בשל המצב הנוזלי שלה וקלות הבאים של יישומים וההסרה, פורמטי צלחת microculture יכולים לחלופין להיות מנוצלים כחלופה תפוקה מהירה, מדויקת וגבוהה לtitrations ויראלי קנה מידה גדולה יותר. שימוש בפולימר נוזלי שאינו מחומם צמיג מציע הזדמנות כדי לייעל את העבודה, חוסך בחומרים כימיים, חלל חממה, ועליית בטיחות מבצעית בעת שימוש במעבדות בלימה מסורתיות או גבוהות כמו אין חימום מגיב או כלי זכוכית נדרשת. שכבות נוזל עשויות גם להוכיח רגישות יותר משכבות מסורתיות לאיתור וירוסים יציבים חום מסוים.

היכולת של מבחני פלאק להעריך נכונה titers ויראלי מסתמכת על מספר רב של גורמים: בחירת תא המארח מתאימה, תקשורת נכונה ותנאי גידול לכדאיות סלולרית ונגיפית, התפשטות נגיפית משותקת, וקביעה מדויקת של תקופת הדגירה הנגיפית כדי לאפשר זמן מספיק לצורך ברור והיווצרות רובד ספיר. במחקר זה, וירוסים משלוש משפחות מייצגות נבחרו כדי להדגים הבדלים ב: בחירת כיסוי, תקופת דגירה, ומורפולוגיה פלאק על פני שונה סוגי מדגם. ונצואלה סוסי דלקת קרום המוח (VEEV) נבחרה כמודל ויראלי (+) ssRNA, אשר יכול לגרום למחלה משמעותית במינים ובני אדם סוסים ומייצג את משפחת Togaviridae. מתח טייוואן השפעת B, מפולח (-) וירוס ssRNA בעיקר מדביק בני אדם, מייצג את משפחת Orthomyxoviridae. בקעת וירוס קדחת (RVFV), - וירוס של פרוקים-רגלי ssRNA נולד בעיקר הדבקת פרוקי רגליים, ()מעלי גירה ובני אדם, נבחר כנציג משפחת Bunyaviridae. לRVFV (איור 1), כייל נקבעו מפתרון מניות של זן רקומביננטי חי מוחלש MP12 של RVFV בפורמט 12 צלחת גם ניצול CMC, agarose, או שכבות Avicel שהודגרו צד-לצד לזיהום שלאחר 72 שעות (HPI). צלחת נציג מראה דילולים הנעים בין 10 4- עד 10 -7 ניתן לראות בלוחות א לוח באמצעות CMC ושכבות agarose הראו שלטים קטנים, ברורים, וברורים עם גבול מעגלי מוגדר היטב. לוחות עם כיסוי נוזל היו מעט יותר עשירים וגדולים יותר בהשוואה לagarose ושלטי CMC, וסיפקו גבול פחות ברור. titers ויראלי הושווה בלוח ב &#39;עם כל שכבות ביצוע comparably. על מנת לקבל השוואה ויזואלית ברורה בין שכבות לMP12 יחד עם גודל מדגם גדול יותר כדי לקבוע רפרודוקציהibility, צלחת 6 היטב גם trialed בשלושה עותקים (איור 2). בפורמט צלחת 6 היטב, השימוש בכיסוי CMC הראה לוחות קטנים יותר או שכבות agarose או נוזל, שהיו דומים בהגודל לזה. וכייל נגיפיים היו דומים בין כל שלוש שכבות (לוח ד &#39;), לוחות שנוצרו בשכבות agarose ונוזל הוכיחו קלים יותר לספור בשל הגודל המוגבר שלהם. בניגוד לRVFV, כייל VEEV ומורפולוגיה רובד בין שכבות השונות מגוונות במידה ניכרת (איור 3 א). לוחות נוצרו בשכבות CMC הפגינו מורפולוגיה ברורה ומובחנת בעת שימוש בתבנית צלחת גם 12, על חשבון גודל שלט ורגישות (לוח ב &#39;). בניגוד לCMC, השימוש בשכבות agarose והנוזל הביאו לוחות גדולים יותר באופן משמעותי, המצביע נמוך עיכוב נגיפי ורגישות מוגברת לשכפול VEEV. זו אושרה בעבר אך ורק כאשר משווה agarose לעומת CMC בapaper פורסם על ידי חוארז et al. 4. בעוד agarose ונוזלי שכבות מיוצרות לוחות גדולים יותר מCMC, הלוחות שמוגדרים היטב גבולות והיו קשים לספור בפורמט גם 12, עם שכבות נוזל המספקות דיפוזיה הגבול הגדולה ביותר. כאשר לוחות היו trialed ב 6 צלחות היטב (איור 4), הפורמט גם 6 הגדול שלל את הנושא של לוחות גדולים בגלוי שהיו קשה להבדיל בפורמט גם 12, עם agarose ושכבות נוזל המוכיחים עדיף על שכבות CMC במונחים של הגדרת שלט וברגישות (4D איור). בהשוואה לRVFV או VEEV, שפעת מספקת מספר אתגרים ייחודיים בעת plaquing, כגון החובה של פרוטאז חיצוני. הרגישות של נגיף שפעת לבחירות של כיסוי שונה גם תועדה היטב בעבר כשינויים משמעותיים כבר ציינו כאשר שינויים קלים כמו שונה מותגים של agarose יש להיותen משמש 9. מעניין עבור זן השפעת B טייוואן, השימוש בCMC כשכבת הביא לוחות ניכר קטנים יותר שהיו קשים לספור והיו קשה להבקיע אמין (איור 5 א). השימוש בשכבת agarose סיפק את הלוחות הטובים ביותר (לוח ג), וגרם לכתם כהה ברקע (כנראה עקב כדאיות monolayer מוגברת), והראה שלטים ברורים וחדים יותר בהשוואה ישירה לשימוש בשכבת הנוזל (לוח ב &#39; ). יתרון בולט של פולימרים נוזליים על שכבות מוצקות ומוצקות למחצה, כגון agarose וCMC, טמון בקלות של ההסרה ויישום. שכבות חצי קשות דורשות חימום, ומיצוק יכול להתגלות כבעייתי בעת טיפול והסרת. על מנת לנצל את היתרונות הללו ולקבוע את המעשיות של ניצול Avicel באופן תפוקה גבוהה לRVFV, פורמט צלחת 96 גם היה trialed בconcentrati כיסוי שונהתוספות (איור 6). לRVFV MP-12, דילולים בוצעו ארבע פעמים בשני 0.6 ו -1.2% הריכוזים הסופיים של Avicel. יישום והסרת כיסוי הוכיחו פשוטים, ללא הבדלים נראות לעין בין משכפל או בין הריכוזים ציינו, מפגינים רמה גבוהה של שחזור. כאשר הבקיע, לוחות היו ברורים וספיר לעין בלתי מזוינת, הוכחת ההיתכנות של ניצול שכבות נוזל באופן תפוקה גבוה לRVFV. <img alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> איור 1:. השוואות כיסוי פלאק RVFV ניצול 12 צלחות גם Veros היו מצופות על 2.5 x 10 5 תאים ב -12 צלחות גם ונגוע ב200 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של MP12. לאחר ההדבקה 1.5 שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC (ג הסופיoncentrations), יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגם בלוח א הפלאק נספרו וtitered בלוח ב &#39;. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> איור 2:. השוואות כיסוי פלאק RVFV ניצול 6 צלחות גם Veros היו מצופות ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגוע ב400 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של MP12. שלוש שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמו בלוח, ניסויים נפרדים B, ו- C. בוצעו באופן זהה כפי שתואר עבור הפנלים AC, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> איור 3: &lt;השוואות strong&gt; שלט VEEV כיסוי ניצול 12 צלחות גם. Veros היו מצופות על 2.5 x 10 5 תאים ב -12 צלחות גם ונגועה ב200 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של זן תרכיב VEEV TC-83. לאחר הדבקת 1.5 שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמו בלוח א הפלאק נספרו וtitered בלוח ב &#39; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> איור 4:. השוואות כיסוי פלאק EEV V ניצול 6 צלחות גם Veros היו מצופות ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגועה ב400 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של VEEV TC-83. לאחר הדבקה, 3 מיליליטר שכבות של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמהבפנלים, ניסויים נפרדים &#39;ו- ג בוצעו באופן זהה כפי שתוארו עבור פנלים - C, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> איור 5: השוואת כיסוי פלאק שפעת תאי MDCK היו מצופים ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגוע ב400 μl של הבידוד תוך שימוש באותו דילול סדרתי המדגם התחלתי של שפעת B טייוואן.. אין בסרום שור העובר (FBS) שימש בתקשורת הצמיחה או שכבות, כמו FBS יכול לעכב התפשטות שפעת באמצעות עיכוב של פרוטאזות מסוימת הנדרשים להיתוך ויראלי. TPCK-טריפסין התווסף לכל שכבות לפני יישום על מנת לאפשר איחוי ויראלי וכניסה עם תאי המארח. לאחר הדבקה, 3 מיליליטר שכבות של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC יושמו על מנת להשוות באופן ישירשכבות כפי שהודגם בלוח, B וניסויים נפרדים ג בוצעו באופן זהה כפי שתוארו בפנלים - C, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). בעוד ממוצע נלקח ללוחות CMC הם היו קשים לספור באופן אמין כפי שהם הפגינו גבולות מפוזרים וגדלי שלט קטנים מאוד. <img alt="איור 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> איור 6:. שכבות שלט תפוקה גבוהה צלחת גם 96 של Veros מצופה ב 3 x 10 4 תאים לכל טוב, היו נגועות ב-50 μl של הבידוד תוך שימוש באותו דילול סדרתי מדגם התחלתי של RVFV MP12 עבור שעה 1, ארבע פעמים. לשכבות, 0.6 ו -1.2% ריכוזים סופיים של Avicel היו trialed כדי לקבוע את הכדאיות ואת שחזור של ניצול שכבות נוזל באופן תפוקה גבוהה, פנלי A ו- B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> שפעת B </td></tr><tr><td> סוג התא </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> תקופת הדבקה </td><td> 1 שעה </td><td> 1 שעה </td><td> 45 דקות </td></tr><tr><td> זמן דגירה </td><td> 3 ימים </td><td> 2 ימים </td><td> 3 ימים </td></tr></tbody></table> סוגי רובד תנאי הרכבת Assay וניידים: טבלה 1 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> שפעת B </td></tr><tr><td> סוג התא </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> סוג גידול</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> שלט מדיה </td><td> 2xEMEM </td><td> 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> הנשר בינוני השתנה של 1. Dulbecco בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 1% L-גלוטמין, 1% Penicllin / סטרפטומיצין. הנשר בינוני השתנה של 2. Dulbecco בתוספת 1% L-גלוטמין, 1% Penicllin / סטרפטומיצין, 0.2% בסרום אלבומין שור, 0.025% HEPES, 50ug / מיליליטר DEAE-Dextran. מדיה א 2x המינימלית חיונית (500 מיליליטר) בתוספת 5% FBS (25 מיליליטר), חומצות אמינו (5 מיליליטר) Essential 1% מינימום, 1% נתרן פירובט (5 מיליליטר), 1% L-גלוטמין (5 מיליליטר), 2% פן / סטרפטוקוקוס (10 מיליליטר). מדיה ב 2x המינימלי חיונית (500 מיליליטר) בתוספת 0.2% הסרום אלבומין שור, חומצות אמינו חיוניות 1% מזערי (5 מיליליטר), 50ug / מיליליטר, 0.025% HEPES, DEAE-Dextran, טריפסין-TPCK * * רק לפני ההכנה, להוסיף 1 μl לכל 25מיליליטר של 2 מיקרוגרם / מיליליטר מניות של TPCK-טריפסין לaliquot תשתמש לערבב עם agarose ללוחות. טבלה 2: רובד וויראלי / סלולארי הצמיחה Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> שפעת B </td></tr><tr><td> סוג התא </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> תקופת הדבקה </td><td> 1 שעה </td><td> 1 שעה </td><td> 45 דקות </td></tr><tr><td> זמן דגירה </td><td> 3 ימים </td><td> 2 ימים </td><td> 3 ימים </td></tr></tbody></table> פתרונות כיסוי לא יפקעו כאשר עשו כל כך הרבה זמן כעקרות נשמר. טבלה 3: מאגר בשכבות <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 6 גם </td><td> גם 12 </td><td> 96 גם </td></tr><tr><td> # של תאים / היטב </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2.5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> נפח של innoculum (μl) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> נפח של שכבה (מיליליטר) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> לוח 4: פורמטי פלייט

Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.5K Views.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Video: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Assay רובד לnorovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

טכניקות מעבדה אספטיים: שיטות ציפוי

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biology

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

פלאק אסאי: שיטה לקביעת טיטר ויראלי כיחידות יוצרות פלאק (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Microbiology

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

Source: Tai, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

בדיקת התקשרות ויראלית לבדיקת תרכובות אנטי-ויראליות

NOTE: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Source: Yadavalli, T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62195">Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

1. Virus infection quantification
NOTE: Virus titers from porcine corneas should be evaluated every day to analyze the effect of drug treatment.

	To ...