המחברים מבקשים להודות ליאן Hansmann (Fraunhofer IGB, שטוטגרט) לתמיכה הטכנית שלו לפתח bioreactors וחממת bioreactor.

1. Decellularization של BioVaSc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מערכת כלי הדם של מגזר jejunal חזירי באמצעות גישת עורקי cannulated ולומן מעיים עם PBS -. חזור על פעולה עד שהוא נקי לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מיכל זכוכית קוטר 200 מ&quot;מ עם 4 מתאמים ולחבר אותם באמצעות צינורות סיליקון למשאבת peristaltic (Ismatec). לחץ השליטה יחידה ניתן לנטר באמצעות חיישן לחץ שמחובר לכיפה חד פעמית סטרילי (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא בקבוקי מאגר עם פתרון decellularization (DZ) ולבדוק את מערכת צינורות לבועות אוויר אפשריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את לומן מעיים עם קשרי כבל למחברי הזכוכית לזרימה של אור. לשאוב 500 פתרון מיליליטר DZ לגישת עורקים האדום (איור 1) של מערכת כלי הדם. להפסיק את תהליך השאיבה כל 15 דקות זמן קצר ללחוץ ידני חלל המעי כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך decellularizatiבתהליך, הלחץ של פתרון החיץ צריך להיות בין 80-100 מ&quot;מ כספית, במודל של לחץ הדם הטבעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את BioVaSc עם PBS - עד שהוא נקי משרידי תא (&quot;לבן לחלוטין&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא BioVaSc לחלוטין עם פתרון DZ ודגירה אותו לצלול בפתרון DZ במשך הלילה ב 4 ° C על הנדנדה ייקרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את BioVaSc בפתרון DNase דגירה במשך הלילה ב 4 ° C על הנדנדה שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון DNase ולשטוף עם חיץ כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> γ-עיקור עם 25 kGy </li></ol> 2. סוגי התאים השונים 2.1 בידוד של תאים ראשוניים אנושיים אנדותל כלי הדם עורי (mvECs) וfibroblasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים ביופסיה של עור (רצוי preputium) לרצועות של 2 - 3 מ&quot;מ רוחב עם אזמל ולשטוף אותם 3x עם PBS - פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את הרקמה עם פתרון Dispase ודגירה אותו ל16-18 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האפידרמיס הנפרד מהדרמיס עם 2 פינצטה ולהעביר את שניהם בנפרד לצלחות פטרי מלאות PBS +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדרמיס שטיפת רצועות 1x עם Versene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר טריפסין / EDTA פתרון לרצועות הדרמיס ודגירה אותו בחממה במשך 40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תגובת האנזים מייד עם FCS 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את רצועות עור לצלחת פטרי מלאה בVascuLife ולגרד את כל רצועה עם האזמל 8x כל צד, ומוסיף קצת לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא מיוצרת באמצעות מסננת תא לצינור צנטריפוגות ולשטוף 3x מסננת תא עם VascuLife. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור ב1,200 XG במשך 5 דקות ו resuspend התא גלולה עם VascuLife. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד את fibroblasts, הדרמיס לקצוץ רצועות לחתיכות קטנות באמצעות סכין המנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של תמיסת collagenase לחתיכות הדרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זה 45 דקות בחממה, אז צנטריפוגות ובזהירות להסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1x גלולה עם FCS% DMEM + 10 +% PenStrep, זה צנטריפוגות ובזהירות להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור במדיום התרבות ולהעביר אותו לבקבוק תרבות T75 כדי לאפשר לגדל תאים מתוך הרקמה. </li></ol> S462 שורת תאי 2.2 גידול שורת תאים הסרטניים S462 (הניתן באדיבות על ידי ד&quot;ר ניקולא Holtkamp, ​​אוניברסיטת שריטה הרפואה ברלין) נוצר מגידול ממאיר היקפי עצבים נדן של מטופלת עם סוג נוירופיברומטוזיס תסמונת נטייה התורשתי גידול 1 9. S462 בתרבית DMEM בתוספת FCS 10%. בינוני צריך להיות שונה בכל 2 - 3 ימים. פעם בשבוע התאים צריכים להיות מפוצלים. 3. מערכת מבחן גידול: תנאי תרבות סטטית לעומת דינמית תרבות במערכות Bioreactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את SIS-MUC צינורי לפתוח בצד אחד ולתקן אותה בין שתי טבעות מתכת (כתרי תא, 10 בקוטר מ&quot;מ, עצמי גonstructed). כסה SIS-MUC בתרבית תאים בינוניים למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בודד במספרים סלולריים שהוגדרו (ראה להלן) על אחד או שני צדדים של SIS (ההגדרה מונו או התרבות המשותפת). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 8,000 תאים / 2 סנטימטר של mvECs העיקרי בהיקף כולל של 100 μl על פני השטח basolateral של SIS (serosa לשעבר). 3 שעות מאוחר יותר למלא היטב עם מדיום כדי להבטיח תרבות קומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים אנדותל לדבוק במשך 3 ימים. להעיף את מערכת התרבות סטטית על ידי 180 ° ולהעביר אותו לצלחת 12 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי תערובת של fibroblasts עורי הראשוני (8,000 תאים / 2 סנטימטר) ותאים סרטניים (15,000 תאים / 2 סנטימטר) בהיקף כולל של 500 μl על משטח הפסגה של SIS (בצד של לומן לשעבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים לדבוק במשך 3 שעות ולמלא היטב עם מדיום (תרבות קומטי, בינוני: 50% DMEM Vasculife + 50% בתוספת FCS 10%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת בדיקת הגידול בתרבית בתנאים סטטייםלא 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 14 ימים נוספים. שנה בינוני תרבות כל 2 - 3 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות הדינמית, לתקן SIS-MUC בין שתי טבעות מתכת וזרעי mvECs העיקרי כפי שתואר ב3.2.1. לאחר 3 ימים להסיר את SIS-MUC מטבעות המתכת ולהכניס את הקרום לזרימת הכור (ראה 2C דמויות ו2 ד). החל fibroblasts עור ותאי גידול הראשוני עם מזרק וצינורית על המטריצה ​​בbioreactor, ולאפשר לתאים לדבוק במשך 3 שעות לפני מילוי מערכת bioreactor עם מדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים הבאים היום דינמי התרבות עם זרם בלתי פוסק בינוני (3.8 מיליליטר / דקה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) יכול להיות יזם. התרבות הדינמית נשמר ל14 ימים, מדיום התרבות שונה לאחר 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת הבדיקה הדינמית היא בתרבית באינקובטור בהקמה עצמית המספק זרימת מדיה דרך משאבה והטמפרטורה הדרושה וCO 2 </sub&gt; תוכן. </li></ol> 4. שיטות אפיון לניתוח 4.1 תיקון ופרפין הטבעה של מטריקס collagenous זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל( חיסוני) אפיונים היסטולוגית להסיר את מדיום התרבות ולתקן רקמות עם paraformaldehyde 4% במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר paraformaldehyde 4% ולהעביר את SIS מ להכניס את המתכת לקלטת רקמות הטבעה. להשקות את הרקמה להסרת מקבע שנותר ומייבש לחדירת פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההטבעה בבלוק פרפין, לחתוך את SIS ב2 - 3 פרוסות ומניחים אותם בתבנית מתכת המלא בפרפין, כך את פני שטח חתך פנים כלפי מטה. הוסף את קלטת הרקמה בחלק העליון של העובש כגיבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 5 מיקרומטר פרוסות ולצוף אותם באמבט מים 40 מעלות צלזיוס במשך מיישר, אז הר שקופיות על גבי שקופיות זכוכית מתאימות. שקופיות ללא ציפוי משמשות לכתמי H &amp; E, מגלשות מצופים polylysine עבור מכתים immunohistological כדי לשפר את קובץ מצורף.בואו פרוסות להתייבש היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסים פרפין, להסיר אותו עם קסילן ורעננותם פרוסות לבאים מכתים. </li></ol> 4.2 מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכולות להיות מוכתמות פרוסות rehydrated עם Hematoxylin / Eosin כמכתים סקירה סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים immunhistological, קבוע ופרוסות רקמות הסתננו פרפין חייבות לעבור אחזור אנטיגן כדי לאפשר נוגדנים להכיר ולהיקשר לאפיטופים הספציפיים שלהם. לכן, deparaffinized ושקופיות rehydrated ממוקמות בסיר אדים עם חיץ ציטרט מחומם (pH 6.0) עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לחיץ כביסה (0.5 חיץ + Tween 0.5% M TBS) ופרוסות העיגול עם עט PAP כדי למזער את ההיקף הנדרש לפתרונות מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף בתא לחות. כדי להבטיח להדמיה בתיווך peroxidase ספציפית חזרת של אנטיגן נוגדן מחייב, peroxidase אנדוגני חייב להיות רווי במי חמצן 3%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטיב העיקרידילולים ody מוחלים על הפרוסות, טופחו במשך שעה 1 ב RT ולשטוף בזהירות עם חיץ כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של איגודי נוגדן אנטיגן ספציפיים Ultra Vision Quanto מערכת איתור HRP DAB (Thermo Scientific) משמש על פי הפרוטוקול המומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעיני counterstained עם Hematoxylin דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות הם רכובים עם מדיום מימיים, מיובש, וצלמו באמצעות מיקרוסקופ הפוך. </li></ol>

<ol>
	<li>Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+tissue+models--moving+towards+personalized+regenerative+medicine.">In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).</li><li>Pusch, J., Votteler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+performance+of+a+three-dimensional+model+that+mimics+the+microenvironment+of+the+small+intestine.">The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine.</a> Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models:+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).</li><li>Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of tissue engineering. , (2007).</li><li>Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactors+for+cardiovascular+cell+and+tissue+growth:+a+review.">Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).</li><li>Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bioreactors+in+tissue+engineering.">The role of bioreactors in tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).</li><li>Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+vascularized+scaffold+for+artificial+tissue+and+organ+generation.">Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation.</a> Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).</li><li>Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+liver-like+tissue+on+a+capillarized+matrix+for+applied+research.">Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research.</a> Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).</li><li>Holtkamp, N., Atallah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-13+and+p53+in+the+progression+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Neoplasia. 9, 671-677 (2007).</li><li>Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+tissue+engineering+technology+platforms+into+cancer+research.">Translating tissue engineering technology platforms into cancer research.</a> J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Yang, S. -. T., Zhang, X., Wen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbioreactors+for+high-throughput+cytotoxicity+assays.">Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).</li><li>Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering:+matrix+preparation,+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model.">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

<html> כאשר משווה בין מערכות תרבות 2D and 3D במחקר גידול, מערכות 3D, למרות היותו הגישה יקרה יותר, הוכיחו לחקות את התנאים במייקר ביולוגי טובים יותר. זה יכול להיות הראה כי חלק מהתאים סרטניים לגדול הרבה יותר איטיים בתרבות 3D מאשר בתרבות משותפת 2D 12, אשר היא בהתאם למצב בגידול אמיתי. ביסל ועמיתים לעבודה הראו בעבודתם כי התנהגותם של תאי שד מסרטנים משקפת את המצב in vivo, כוללים מורפולוגיה תא ואיתות, בצורה מדויקת יותר, כאשר תרבות 3D בתוך מטריצה ​​מציעה תא אינטראקציות-ECM. יתר על כן, הם הדגישו את חשיבותה של הסביבה תאית ב-3D על ידי הוכחת כי שינויים באינטראקציות הסביבתיות הובילו להחזרה של התאים הממאירים לפנוטיפ נורמלי. בנוסף והכי חשוב, יכולים להיות גם אישרו בתוצאות אלה במודלים של בעלי החיים vivo 10,11. ontent &quot;&gt; ההשוואה הישירה של in vivo ניסויים בבעלי חיים ובדגמי רקמת מבחנה מגלה יתרונות וחסרונות בשתי המערכות. אחד יתרונות של במבחנה מודלים הוא ברשות הרבה יותר טוב בזמן אמת או הדמיה קבועה על ידי מיקרוסקופ. הגבלה היא כי הם מחקים את תנאים לטווח קצר או סטטי, ואילו בvivo מערכות לעתים קרובות התקדמות. חוסר הנוכחי של כלי דם והובלה תקינה של מולקולות קטנות, תארח את תגובה חיסונית, ותאי תאי אינטראקציות אחרות חסרונות נוספים של במבחנה מודלים 12. לכן, 3D במערכות חוץ גופית כפי שהוצגו במחקר זה מציע תוספת מבטיחה לניסויים בבעלי חיים. הם מספקים השוואה טובה יותר לאורגניזם האנושי ולכן למזער פרשנויות מוטעות ניסיוניות. Biomimetic במערכות מודל vivo יהיה מכאן הפך רלוונטי יותר כדי ללמוד איך סרטן והתפשטות גרורה הוא תלוי בתנאי microenvironmental המסדירים tumorigenesis 11. המחקר שלנו מראה כי סביבת 3D הניתנת על ידי SIS-MUC מובילה להיווצרות יותר כמו גידול רקמות של תאים, אשר לא נצפתה בתרבית תאי 2D הנפוצה (ראה איור 3 א). יתר על כן, השימוש בתאים ראשוניים הנגזרים מביופסיות גידול הוא צעד מאוד חשוב לקראת רפואה אישית, משמעת שמטרתו לזהות את הטיפול הטוב ביותר בהתאם לצרכים האישיים של מטופל. שילוב תאי גידול ראשוני מטופל ספציפי מבודדים מחומר הביופסיה יאפשר בבדיקות במבחנה של אסטרטגיות טיפוליות. מערכות בדיקה מסוג זה תאפשר לחקור תרופות ושילובים שונים ממנו בזמן ותפוקה גבוהה הקרנה לחיסכון בעלויות. בנוסף, השילוב של תאי סטרומה גידולים הקשורים כפי שמוצגים במחקר זה חשוב לגישה אישית, שכן התקדמות גידול השפעות microenvironment של גידול 13 ועשויה להתברר כsuitabיעד טיפולי le. לחלופין לגישה אישית, מודל הגידול שלנו יכול להיות שונה כדי לשמש כמערכת בדיקת גידול כללית על ידי השילוב של שורות תאים סרטניות שהוקמו. זוהי הסתגלות מבטיחה למטרות מחקר בסיסיות. עבור שני בדיקות הסמים מתקרב לנוכחות של מבנה כלי דם נדרשת כדי לבחון את ההתפלגות וספיגה של חומרים טיפוליים. מטריקס SIS-MUC מאפשר זריעת basolateral עם mvEC העיקרי ללימודי ספיגת מכשול, הזריעה המחודשת של מבני כלי הדם נשמרו של BioVaSc תהיה לשפר עוד יותר את המחקר של אספקת סמים. על מנת ליצור מודלים רקמות, מטריקס מתכלה 3D יכול לשמש כמסגרת לשיתוף תרבות תאים מסוגים שונים 14. השימוש במטריצות 3D כזה הוא מוגבל לעתים קרובות על ידי היעדר כלי דם תפקודי. בעיה זו ניתן לפתור על ידי השימוש בBioVaSc, המציע str כלי דם נשמרuctures, אשר ניתן reseeded עם תאי האנדותל. יתר על כן, BioVaSc מספק רכיבים תאיים, אשר להבטיח את ההידבקות של התאים ולאפשר בידול רקמות. הוא גם מאפשר את תפקוד הרקמות ספציפי זמן הארוך של רקמות 3D bioartificial 7,8,15. תנאי מוקדם להנדסה של כלי דם תחליפים פונקציונליים הוא החיקוי של פיסיולוגי אנושיים ותנאים ביומכנית. לכן, מערכות bioreactor, אשר יכולה ליישם את הדרישות הללו במבחנה, הן עניין קיצוני ליצירת מודלים גידול ביולוגיים. השילוב של BioVaSc, טכנולוגית bioreactor ושיתוף תא culturing-סוגים שונים של שיטה מבטיחה מאוד ליצירת רקמות גידול vascularized, אשר תאפשר את המחקר של מנגנונים רלוונטיים להתקדמות סרטן כגון אנגיוגנזה וגרורות. אנו רואים גידול מודלים כגון גישה מבטיחה למשלימים מחקרים בבעלי חיים על ידי מתן שווה ערךלפיסיולוגיה של הגידול האנושי.

תרופות חדשות חייבת להיות מאומתות בכל קשור לאיכותם, בטיחות ויעילות לפני אישור שוק. עד כה, ניסויים בבעלי החיים הם השיטה סטנדרטית לבדיקות סמים ואימות. עם זאת, בשל הבדלי מינים ספציפיים, ניסויים בבעלי החיים לעתים קרובות לא באופן מקיף להעריך את ההשפעה של התרכובות בבני האדם 1. מסיבה זו, חשוב לייצר דגמי רקמה אנושיים שיכול לשמש לבדיקות במבחנה של תרופות וחומרים חדשים. אחד המוקדים של הקבוצה שלנו הוא היצירה של במבחנה מודלים בדיקה עם הפיגום הביולוגי שלנו vascularized (BioVaSc) 2,3. BioVaSc יכול לשמש כמערכת מטריצת 3D סטטי או דינמית. לתרבות סטטי, מגזר jejunal חזירי decellularized (מעי הדק submucosa SIS-MUC) ממוקם בהוספת מתכת לזריעה מחודשת של תאים. תאים שונים, כגון סרטן ותאי האנדותל יכולים להיות מתורבת על הפיגום. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; לתרבות דינמית, BioVaSc מחובר למערכת bioreactor שחלה לאורך זרימה בכלי הדם או על פני השטח של הפיגום. bioreactors הנוכחית ליישם גירויים ביולוגיים, מכאניים, או חשמליים הפועלים על הבידול או התפשטות של תאים 4. לbioreactors בתחום הנדסת רקמות, הרעיון הבסיסי הוא לדמות את התנאים בגוף האדם. שבו, תאים ניתנים סביבה טבעית שבה הם יכולים לתקשר אחד עם השני והמטריצה ​​תאית המקיפה אותם. לייצור במבחנה מערכות בדיקה או השתלות, היכולת לחקות את הסביבה הטבעית של תאים במערכת bioreactor מבנה מנשא מתאים והיא 5 קריטיים. לכן, מכשירים מורכבים יותר ותובעניים מבחינה טכנית יש לפתח כדי למלא משימות אלה 6. זה יתר על כן ניתן להשתמש בפיגום שלנו לestablishment של מודל vascularized בשל המבנים צינוריים השתמרו, הכוללים את עורק ההאכלה, וריד, ומיטת נימים המקשרת. כל התאים החזיריים צריכים להסיר על ידי decellularization הכימי, מכאני והאנזימטית, ומעוקר גמא הפיגום. לאחר מכן ניתן יהיה reseeded מבני כלי דם צינורי המשוחזר עם תאי אנדותל כלי הדם אנושיים באמצעות bioreactor סחרור זלוף 7, אשר מחקה את הפרמטרים ביומכנית ו / או ביוכימיים כגון pH, טמפרטורה, לחץ, אספקת חומרי מזון ופינוי פסולת 6. מחדש endothelialization של המבנים צינורי יוצר מקבילה כלי דם אנושית בתוך 3,7 פיגום collagenous. בשלב הבא, את פני השטח של לומן לשעבר (הרירי) ניתן נזרעו עם תאים אנושיים ראשוניים להקמת שיתוף תרבויות 3,7,8. במחקר זה מערכת בדיקת גידול 3D מוגדרת על ידי שיתוף culturing שורת תאים סרטניים עם st העיקריתאי רומאל בתנאים סטטיים ודינמיים על SIS-MUC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

סרטן הוא אחד הגורמים המובילים למוות בכל עולם. אסטרטגיות טיפוליות הנוכחיות בעיקר מפותחות במערכות תרבות 2D, המשקפות כהלכה תנאים פיסיולוגיים בגוף חי. מטריצות 3D ביולוגיות לספק תאי סביבה שבה תאים יכולים לארגן עצמיים, המאפשרת המחקר של ארגון רקמה והתמיינות תאים. ניתן זורעים פיגומים כגון בתערובת סוגי תאים שונים כדי ללמוד תאי תאי אינטראקציות-3D ישירים של. כדי לחקות את מורכבות 3D של גידולי סרטן, הקבוצה שלנו פיתחה מערכת בדיקה 3D במבחנה גידול. המודלים שלנו 3D מערכת בדיקת רקמות מצב in vivo של גידולים ממאירים היקפיים עצבים נדן (MPNSTs), שהקמנו עם הקטע שלנו decellularized חזירי jejunal פיגום ביולוגי הנגזר vascularized (BioVaSc). במודל שלנו, אנו reseeded מטריצת BioVaSc שונה עם fibroblasts הראשוני, תאי אנדותל כלי הדם (mvECs) ושורת התאים הסרטני S462. לתרבות סטטי, מבנה כלי הדם של BioVaSc מוסר והפיגום שנותר הוא לחתוך פתוח בצד אחד (מעי הדק submucosa SIS-MUC). מטריקס וכתוצאה מכך הוא קבוע אז בין שתי טבעות מתכת (כתרי תא). אפשרות נוספת היא תרבות תאי זרע SIS-MUC במערכת bioreactor תזרים החושפת את התאים למאמץ גזירה. הנה, bioreactor מחובר למשאבת peristaltic בחממה הוקם באופן עצמי. מחשב מווסת את חמצן העורקים ואספקה ​​של חומר מזין באמצעות פרמטרים כגון לחץ דם, טמפרטורה וקצב זרימה. התקנה זו מאפשרת לתרבות דינמית עם או pulsatile מוסדר לחץ או זרימה קבועה. במחקר זה, אנו יכולים לקבוע בהצלחה גם מערכת תרבות 3D סטטי ודינמית לMPNSTs. היכולת למודל גידולים סרטניים בסביבת 3D טבעית יותר תאפשר גילוי, בדיקות, ואימות שלתרופות עתידיות במודל דמוי אדם.

כפי שניתן לראות באיור 1, אנו decellularized המגזר חזירי jejunal (כ -2 מ &#39;אורך ו20 מ&quot;מ קוטר) עם מבנים צינוריים השתמרות של רשת הנימים. לאחר כימי, אנזימטי וdecellularization המכני, השגנו פיגום אני קולגן / III, אשר יכול לשמש לתרבית תאי 3D. מבחן Feulgen בוצע כדי להדגים את טוהר (אין שרידי DNA) של המטריצה ​​(מידע לא מוצג). 2A הדמויות ו2B להראות את התרבות סטטי של SIS-MUC המובטח בכתרי התא. אנו קבועים SIS-MUC בbioreactor בתוך הבית תוכנן (איור 2 ג) לתרבות דינמית. איור 2 ד ממחיש את הזרימה הדינמית מדומה דרך החדר של bioreactor. Bioreactor ממוקם במערכת חממה הוקם באופן עצמי ומחובר עם משאבת peristaltic. התקנה זו מאפשרת תרבות דינמית עם או זרימת pulsatile מוסדר לחץ או ג<html> זרימת onstant. איור 3 נותן סקירה כללית של הקו באופן סטטי בתרבית S462 גידול התא בmonoculture 2D (איור 3 א) ובcoculture 3D (איורים 3 ב-3D). איור 3 ב מציג את התרבות המשולשת של תאים סרטניים S462 וfibroblasts העיקרי בצד הקודקוד של SIS -MUC (צד לומן פנימי לשעבר) וmvEC בצד basolateral (צד serosa לשעבר). זיהוי של סוגי תאים שונים אפשרי על ידי צביעת סמני תאים מסוג מסוימים, כגון גורם פון Willebrand לתייג mvEC (איור 3 ג). ניתן להבחין בין תאי S462 p53 חיובי מfibroblasts העיקרי p53 שלילי (איור 3D) והפצת 3D של תאים ניתן לנתח. נתון מקביל 4 מופעי stainings איור 3 של התרבות המשולשת דינמית בתרבית. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. הגדרת Decellularization. Bioreactor () והגדרת משאבה לdecellularizing BioVaSc, פיקוח על ידי מחשב. (B) decellularized BioVaSc במכל זכוכית. לומן וכניסת העורקים מחוברים למתאמים. . <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> איור 2. על תצוגה של קבוצה קופצים התרבות השונות. () צפו בקטע CAD של מערכת תרבות סטטית בצלחת גם microtiter, (ב) מוסיף מתכת לתרבות סטטי, (C) זרימה בינונית סימולציה (שדה מהירות [מ &#39;/ שנייה]) לתרבות הדינמית של המכסה העליון של הזרימה bioreactor , (ד) הזרימה bioreactor לתרבות דינמית המחובר למשאבת peristaltic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> אף אוזן גרון &quot;עבור: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> איור 3. סקירה כללית של אפיון immunohistological של מודל גידול 3D סטטי. כתם Hematoxylin (א) לתרבות מונו 2D באופן סטטי בתרבית של תאי S462 בשקופית Permanox, (ב) כתם H &amp; E של התרבות המשולשת 3D באופן סטטי בתרבית, חיצים לסמן תאי אנדותל, (C) צביעת immunohistological לגורם פון Willebrand, (ד &#39; ) מכתים immunohistological לp53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> <img alt="איור 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; איור 4. סקירה כללית של אפיון immunohistological של מודל גידול 3D הדינמי. () כתם H &amp; E של התרבות המשולשת 3D דינמי המתורבתת, חיצים לסמן תאי אנדותל, (ב) מכתים immunohistological לגורם פון Willebrand, (C) צביעת immunohistological לp53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System at JoVE.com

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

שיטות ליצירת רקמות גידול 3D אדם כמערכות בדיקה מתוארות. טכנולוגיות אלה מבוססות על ביולוגי vascularized פיגום decellularized (BioVaSc), תאים אנושיים יסודיים ושורת תאים סרטניים, אשר יכול להיות מתורבת תחת סטטי, כמו גם בתנאים דינאמיים בזרימת bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

tissue-engineering-of-a-human-3d-in-vitro-tumor-test-system

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

21.2K Views.  University Hospital Würzburg.  שיטות ליצירת רקמות גידול 3D אדם כמערכות בדיקה מתוארות. טכנולוגיות אלה מבוססות על ביולוגי vascularized פיגום decellularized (BioVaSc), תאים אנושיים יסודיים ושורת תאים סרטניים, אשר יכול להיות מתורבת תחת סטטי, כמו גם בתנאים דינאמיים בזרימת bioreactor. 

Video: Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

לאלץ את המערכת עם V אנכי-כפיפות: הערכה 3D במבחנה של Archwires מלבני גמישה ונוקשה

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...