אנו מודים Kymberlee אובריאן, סיליה מור, ואדוארד Tronick (חוג לפסיכולוגיה, אוניברסיטת מסצ&#39;וסטס, בוסטון) עבור מתן דגימות שיער האנושיות נותחו במחקר זה, וסטיבן תיירות ואמנדה Dettmer (מעבדה של השוואתית אתולוגיה, NICHD) עבור מתן דגימות שיער קוף רזוס. פיתוח ראשוני והמשך שימוש בשיטה זו כבר נתמכה על ידי NIH RR11122 לMAN

1. אוסף דוגמאות ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיער אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את כל אורכו של השיער שנדגמו (עד לעיפרון ברוחב קוטר) עם גומייה או סיכה. שיער גזור קרוב לקרקפת ככל האפשר (נזהר שלא ניק העור) עם מספריים נקיים. הערה: שטח הדגימה הסטנדרטי הוא הקודקוד האחורי של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוקרים אחדים דיווחו על ירידה ברמות קורט שיער אדם עם מרחק מהקרקפת 6, אשר עשוי להיות בשל סחף מחשיפה חוזרת ונשנית למים ושמפו 7 (אם כי רואה Manenschijn et al. 8 ותומסון et al. 9 לתוצאות הפוכות ב שאין ירידה מגזרית נצפתה) כדי למזער את ההשפעה של &quot;אפקט סחף&quot; זה פוטנציאל, אנו ממליצים לאסוף מגזרי שיער הפרוקסימלי לקרקפת עם אורך שאינו עולה על 3 סנטימטר (בהנחת ששיעור צמיחה ממוצעת של 1 סנטימטר / חודש 10, 3 קטע סנטימטר מכיל Cאורט שהופקד על פני 3 החודשים האחרונים כ). כדי להשיג זאת, יש להשתמש בסרגל כדי למדוד 3 סנטימטר מהחתך הראשון ולחתוך שוב להניב מדגם 3 סנטימטר. הערה: ברגע שהשיער נחתך לאורך, זה כבר לא נחוץ כדי לשמור על הגדילים ביישור אלא אם המחקר כרוך בחיתוך המדגם למקטעים ארוכים 1 סנטימטר נפרדים להקים לוח שנה רטרוספקטיבה של תצהיר קורט על פני תקופת הזמן לפני הדגימה 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מדגם השיער בנרתיק עשוי מרדיד אלומיניום, מעטפת נייר נקייה או צינור 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן צנטריפוגות מהסוג המשמש לשטיפת מדגם. כמו הקורט הוא מאוד יציב בשיער 2, ניתן לאחסן דגימות ללא הגבלה ב -20 מעלות צלזיוס ובמידת צורך, נשלחות לילה בטמפרטורת הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך איסוף שיער צריך להיות מתורגל על ​​מתנדבים והדגימות בפועל צריכה להישקל לפני היציאה למחקר מלא. שים לב: דגימות שיער כמו SMAll כ5-10 מ&quot;ג ניתן לנתח באמצעות השיטות שתוארו כאן, למרות שזה רצוי לאסוף דגימות&gt; 10 מ&quot;ג כדי למזער את הסיכוי לקבלת קריאות EIA מתחת סטנדרטי הקורט הנמוך ביותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיער קוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את השיער (100-250 מ&quot;ג) מהעורף באמצעות גוזז בעלי חיים סטנדרטי. לגלח קרוב לעור ככל האפשר, נזהר שלא לפגוע בעור ולגרום לדימום בגלל רמות קורט דם הן גבוהות מאוד בהשוואה לאלה שנמצאו בשיער. הערה: אזור הצוואר נבחר לדגימה שגרתית משום שהוא בדרך כלל מקור טוב לשיער וניתן להבחין בקלות לצמיחה מחודשת שיער לפני הדגימה מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מדגם השיער בנרתיק עשוי מרדיד אלומיניום או צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן. יש לאחסן דגימות שיער קוף ונשלחו באותו אופן כפי שתואר לעיל עבור דגימות שיער אדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל קוף שיער, שלא כמו שיער קרקפת אדם, גדל לאורך מסוים ולאחר מכן stגדל 11 אופים, זה בדרך כלל לא אפשרי במקרה זה להשתמש במרחק מהעור, כמו לוח שנה להפקדת קורט. עם זאת, אם בעלי חיים ניתן לדגום יותר מפעם אחת (לדוגמא, במהלך בחינות בריאות שגרתיות תקופתיות), רצוי לבצע גילוח ראשוני כדי לקבוע נקודת זמן תחילת המחקר ולאחר מכן reshave אותו האזור לאחר תקופת הזמן הרצויה שחלף. קורט במדגם השני הופקד במהלך הפסקת הגילוח-reshave, המאפשרת ייחוס מדויק של המדגם של תוכן קורט לפעילות HPA מעל המרווח ש5. </li></ol></li></ol> 2. כביסה מדגם וייבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל דגימת שיער לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים isopropanol כיתה (HPLC) על צינור אחד ואחריו היפוך חוזר ונשנה במשך 3 דקות באמצעות כתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג isopropanol לתוך מיכל פסולת, לוקח גהם לא לאבד את כל של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 2.1.2 ו 2.1.3 עוד פעם אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את השיער לפחות 2-3 ימים על מנת להבטיח אידוי isopropanol מלא. </li></ol></li></ol> 3. גריסה לדוגמא וקורט חליצה ​​- שיטת 1 עבור דגימות גדולות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טחינה לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עד 250 מ&quot;ג של שיער יבש לתוך 10 מיליליטר נירוסטה טחינת צנצנת יחד עם כדור נירוסטה 12 מ&quot;מ בודד שחיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את המדגם במשך 6 דקות במהירות של 25 הרץ באמצעות טחנת כדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול עד 50 מ&quot;ג של אבקת שיער על איזון אנליטיים ולאחר מכן להעביר אותו לצינור microcentrifuge נקי 2.0 מיליליטר פוליפרופילן לחילוץ קורט לאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוץ קורט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.0 מיליליטר של מתנול HPLC כיתה לצינור microcentrifuge המכיל את מדגם האבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי צינור דגירה המדגם עבור 18-24 שעות בטמפרטורת חדר עם שותףהיפוך nstant באמצעות כתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב 14,000 סל&quot;ד במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר כדי גלולה שיער האבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 0.6 מיליליטר של supernatant לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מיליליטר, נזהר שלא להפריע גלולה של שיער אבקה. </li></ol></li></ol> 4. גריסה לדוגמא וקורט חליצה ​​- שיטה 2 לדגימות קטנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טחינה לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עד 60 מ&quot;ג של שיער לתוך צינור microcentrifuge preweighed 2 מיליליטר ברזל למכות חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reweigh הבקבוקון כדי להשיג את המשקל לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שלושה חרוזים פלדת כרום 3.2 מ&quot;מ לכל בקבוקון ולאחר מכן לטחון את המדגם לפחות 2 דקות במקצף חרוז. אם בדיקה חזותית מגלה כי המדגם נכתש מספיק, ולאחר מכן לבצע ליטוש נוסף ל0.5 או 1 דקות. שים לב: אין העברת שיער הקרקע שדרושה במקרה זה משום מיצוי קורט מתבצע באותו הבקבוקון כמו טחינה. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוץ קורט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מיליליטר של מתנול HPLC כיתה לצינור microcentrifuge המכיל את מדגם האבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי צינור דגירה המדגם עבור 18-24 שעות בטמפרטורת חדר עם היפוך מתמיד באמצעות כתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב 10,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי גלולה שיער האבקה. הערה: חרוזים פלדת הכרום יישארו בצינור עם השיער במהלך שלבי המיצוי וצנטריפוגה, המהווה את מהירות צנטריפוגה נמוכה יותר בהשוואה לשיטת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1.0 מיליליטר של supernatant לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מיליליטר, נזהר שלא להפריע גלולה של שיער אבקה. </li></ol></li></ol> 5. אידוי ממס וכינונה מחדש לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את מתנול או באמצעות מאייד ואקום או זרם של גז חנקן אם מאייד ואקום אינו זמין. אם נעשה שימוש במאייד ואקום, אדי מתנול יכולים להיות לכוד על ידי אמצעישל מלכודת קרה או מלכודת כימית מצוידות במחסנית פחם פעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות סילוקו של מתנול, מחדש את תמצית הקורט בנפח מתאים של חיץ EIA assay (diluent assay). אם ערכי קורט גבוהים יחסית צפויים, ולאחר מכן להשתמש במאגר בנפח של 0.4 מיליליטר או יותר. אם ערכים נמוכים יחסית צפויים, ולאחר מכן את עוצמת הקול יכול להיות מופחת ל0.2 מיליליטר או פחות כדי להגביר את הרגישות. הערה: 0.2 מיליליטר הוא נפח מספיק כדי להפעיל aliquots הכפולים של המדגם לפחות פעמיים במקרה בשידור חוזר של המדגם הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כך או assay המדגם מחדש מייד או להקפיא אותו ב-20 ° C לניתוח מאוחר יותר. הערה: אם המדגם מחדש קפוא, חשוב להימנע מסובלימציה במהלך תקופת ההקפאה מאז שינוי בנפח דגימה יוביל לערך קורט שווא כאשר החישובים הסופיים מבוצעים. </li></ol> 6. הקורט Assay ונתונים המרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay תמציות שיער עבורקורט באמצעות immunoassay אנזים רגישות גבוהה ערכה (EIA). הערה: אם משתמש ברוק מסחרי ערכת הקורט EIA, בצע את המלצות היצרן כמפורט בהוספת ערכת פרט לכך שבדיקת הדגימות יהיו aliquots הכפולים של כל תמצית שיער מחדש במקום דגימות רוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמצית שיער בקרת איכות (QC) לשימוש בכל assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מספר דגימות שיער נוספים וגם לעבד אותם בנפרד כמו בשלבים 4.1 ו4.2 או בברכתם לעיבוד מדגם גדול כמו בשלבים 3.1 ו3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס ולגבש מחדש את תמציות כמו בשלבים 5.1 ו5.2, ולאחר מכן בריכת תמציות מחדש מכמה דגימות בודדות או תקווינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot נפח מתאים של נקווה לחלץ מחדש (למשל 0.10 מיליליטר) לתוך צינורות microcentrifuge בודדים ולהקפיא לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו ולהפעיל aliquot QC אחד בשני עותקים בכל microplate immunoassay לספק refeלורנס ערך קורט לבדיקת האיכות של כל ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדם התוך assay של השונות (CV; מוגדר כסטיית התקן מחולקת בממוצע של קבוצת ערכים לדוגמא) יכול להיות מחושב על ידי ניתוח 10-12 QC בארות באותה הריצה, ואילו ניתן לחשב בין assay קורות חיים באמצעות ערכי QC פני קבוצה של ריצות. אם תוכנת microplate הקורא של אחד מחשב את קורות חיים לבארות כפולות המייצגות את תמצית כל שיער, ולאחר מכן בשיטה חלופית לקביעת קורות חיים התוך assay היא לחשב את הממוצע של ערכי קורות חיים בודדים אלה על פני כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל תמצית מדגם תשואות קריאה גדולה יותר מאשר תקן הקורט הגבוה ביותר בEIA, אז aliquot נוסף של התמצית מדולל עם כמות מתאימה של חיץ assay וקריאת EIA שלאחר מכן הוא תיקן לגורם לדילול. דוגמאות גם נתחו באופן שיגרתי, אם קורות החיים לבארות הכפולות הוא&gt; 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל ערכות הקורט EIA נועדו למדוד קורט values בדגימות נוזל כגון רוק או פלזמה, את הפלט של תוכנת microplate הקורא חייב להיות מומר לסכום של קורט לכל יחידת משקל של שיער אבקה. הנוסחה הבאה ממירה את פלט assay במיקרוגרם / ד&quot;ל לקורט pg לשיער מ&quot;ג: (A / B) * (C / D) * E * 10,000 = F בי = מיקרוגרם / ד&quot;ל מתפוקת assay; B = משקל (במ&quot;ג) של השיער חשוף למיצוי; C = כרך. (במ&quot;ל) של מתנול מתווסף לשיער האבקה; D = כרך. (במ&quot;ל) של מתנול התאושש מהתמצית ולאחר מכן התייבש למטה; E = כרך. (במ&quot;ל) של חיץ assay משמש מחדש את התמצית מיובשת; ו= ערך סופי F של ריכוז קורט שיער בpg / מ&quot;ג. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Selye, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+the+general+adaptation+syndrome.">Stress and the general adaptation syndrome.</a> Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).</li><li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Hair+cortisol:+A+novel+biomarker+of+hypothalamic-+pituitary-adrenocortical+activity.">Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li><li>Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+neurochemistry+of+self-injurious+behavior:+A+nonhuman+primate+model.">The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model.</a> Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).</li><li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques.">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).</li><li>Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+monkey+model+of+self+injury:+Effects+of+relocation+stress+on+behavior+and+neuroendocrine+function.">A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function.</a> Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).</li><li>Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+as+a+retrospective+calendar+of+cortisol+production+-+Increased+cortisol+incorporation+into+hair+in+the+third+trimester+of+pregnancy.">Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy.</a> Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).</li><li>Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shampoo+and+water+washing+on+hair+cortisol+concentrations.">Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations.</a> Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).</li><li>Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+method+to+measure+long+term+cortisol+levels.">Evaluation of a method to measure long term cortisol levels.</a> Steroids. 76, 1032-1036 (2011).</li><li>Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+provides+a+historical+record+of+cortisol+levels+in+Cushing&#8217;s+syndrome.">Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing&#8217;s syndrome.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).</li><li>LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variations+in+growth+rate+and+sample+collection+on+interpreting+results+of+segmental+analyses+of+hair.">The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair.</a> Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).</li><li>Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+hair+growth+in+Macaca+mulatta.">Variability of hair growth in Macaca mulatta.</a> Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).</li><li>Sauv&#233;, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cortisol+in+human+hair+as+a+biomarker+of+systemic+exposure.">Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure.</a> Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).</li><li>Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+cortisol+analysis+in+hair+and+its+clinical+applications.">An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications.</a> Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).</li><li>Bechsh&#248;ft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortisol+levels+in+hair+of+East+Greenland+polar+bears.">Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears.</a> Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).</li><li>Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Society+of+Hair+Testing+guidelines+for+drug+testing+in+hair.">Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair.</a> Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).</li><li>Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hair+follicles+display+a+functional+equivalent+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+(HPA)+axis+and+synthesize+cortisol.">Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol.</a> FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).</li><li>Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol+as+a+biological+marker+of+chronic+stress:+Current+status,+future+directions+and+unanswered+questions.">Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions.</a> Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).</li><li>Stalder, T., Kirschbaum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cortisol+in+hair+-+State+of+the+art+and+future+directions.">Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions.</a> Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).</li><li>Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol,+stress+exposure,+and+mental+health+in+humans:+A+systematic+review.">Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review.</a> Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים להכריז.

הליך קורט שיער שתואר לעיל הוא פשוט לביצוע, הוא זול יחסית, הופך את השימוש בכימיקלים זמינים, חומרים כימיים, ואספקה, ודורש ציוד זה, למעט במקרה אחד, עשוי להיות נוכח במעבדה האנליטית טיפוסית. יוצא מן הכלל הוא מנגנון שחיקה כגון טחנת כדור או מיני beadbeater. נציין כי חלק מקבוצות המח?...

מדידה של קורט בפלזמה, רוק, או לעתים בשתן או צואה שמשה כמדד ללחץ פיסיולוגי מאז הגילוי של Selye על תפקידו של ציר HPA במתח 1. למרות מאמרים רבים שפורסמו נוגעים פעילות HPA למצבים מלחיצים בחריפות, השדה כבר הקשו על ידי חוסר מדד פשוט ואמין של לחץ פיסיולוגי כרוני. בעיה זו נובעת מכך שהערכות פלזמה ורוק גם תשואה &quot;נקודה&quot; של פעילות HPA שחשופים לסטיות היממה ויכול להיות מבולבלת על ידי הפרעות סביבתיות. דגימות שתן וצואה להניב מדידות של קורט ו / או הפרשת המטבוליט כי ההיקף מספר שעות עד יום שלם בחלק ממקרים. איסוף דגימות מרובות באמצעות כל אחת ממטריצות אלו עשוי לספק מדד משולב גס של רמות הקורט לאורך זמן, עם זאת, אף אחת מהגישות הללו מספק מדד באמת לטווח הארוך של פעילות HPA והיענות של סאי זהגזע ללחצים כרוניים. מדידת קורט בשיער החלה למלא את הצורך החשוב הזה בספרות המתח. מחקרים ראשוניים על ידי מספר מעבדות הפגינו את נוכחותו של קורט בשיער אנושי אך לא לחקור האם רמות קורט שיער השתנו כפונקציה של מתח 2. כמעבדה שלנו כבר מתעניינת שנים רבות בוויסות של ציר HPA קוף רזוס ידי גורמים חברתיים והתנהגותיות שונים 3, יצאנו כדי להקים ולאמת את שיטות להפקה וניתוח של קוף רזוס שיער 4. בהתבסס על ההנחה שהקורט נישא בדם משולב באיטיות וברציפות לשיער גדל, מטרת השיטה החדשה הייתה להשתמש ברמות של קורט שמקורם בשיער כמדד משולב של פעילות HPA על פני תקופות של שבועות עד חודשים. כמה אתגרים מתודולוגיים נתקלו בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי. ראשית, מחקרים קודמים הראו כי o כמויות קטנותו במחזור הקורט מופרשים בזיעה וחלב ולכן יכול מעיל החיצוני של השיער פיר 2. כדי לחסל לבלבל את הפוטנציאל הזה, פיתחנו הליך לשטוף קל שמופיע כדי להסיר קורט חיצוני עם השפעה מינימאלית על קורט נוכחת בתוך השערה הולך וגדל. לפיכך, קוף השיער נתון להליך זה (כלומר שתי שטיפות 3 דקות עם isopropanol) איבד כ 7-8% מכלל תוכן קורט שיער, ולשטוף שלישי הוסר פחות מ 1% יותר מסטרואידי המדגם 4. נראה שיש קורט חיצוני יותר בשיער אנושי, שכן באותו ההליך הוסר ממוצע בסך הכל 27% תוכן קורט מהדגימות (ק רוזנברג וג&#39; מאייר, לא פורסמו). כמו קוף שיער, לעומת זאת, שטיפה נוספת הכילה הרבה פחות קורט (כ -7%) מאשר שתי שטיפות הראשונות. לכן, תוצאות משני קוף ושיער אנושי לתמוך בטענה שרוב (אם לא כל) קורט החיצוני ניתן להסיר תוך שמירת frac גדולtion של קורט בתוך מטריצת השיער הפנימית. שנית, מחקרי הפיילוט שלנו הראו גם כי שחיקה השיער לפני מיצוי התאוששות קורט גדלה באופן משמעותי מהמדגם, ככל הנראה על ידי השבירה פתוחה המטריצה ​​חלבוניים המורכבת של השערה כמו גם להגדיל את השטח זמין לחדירת ממס. שתי שיטות שחיקה שונות פותחו, כל אחד עם יתרונות וחסרונות. יש שיטה 1, אשר עושה שימוש בטחנת כדור, היתרון של ייצור האבקה הטובה ביותר. עם זאת, טחנת כדור היא פריט ציוד יקר יחסית, ואם משתמש עם צנצנות טחינה סטנדרטיות וכדורים, הוא מסוגל טחינה רק שתי דגימות בכל פעם. דגימות קטנות הן גם קשות לעבד באמצעות טחנת כדור עם צנצנות טחינה רגילות. השיטה 2, אשר משתמשת beadbeater, היא פחות יעילה ביכולת הטחינה שלו. כתוצאה מכך, התאוששות קורט ממוצעת היא כ 10% נמוך יותר בשיטה זו בהשוואה לטחנת הכדור (נתונים שלא פורסמו). מצד השני, beadbeaterהוא הרבה פחות יקר מאשר טחנת כדור, יכולות להיות קרקע 16-24 דגימות בפעם בהתאם לדגם, והשיטה היא גם מתאימה למדגמים קטנים. בשל התאוששות ההפרש שהוזכר לעיל, רצוי להשתמש באותה השיטה שחיקה עבור כל הדגימות במחקר מסוים. ברגע שדגימות השיער עברו עיבוד, הם חולצו עם מתנול וקורט בתמציות הוא מנותח באמצעות ערכת EIA מסחרית רגישה וספציפית שנועדה במקור למדידת קורט רוק. נהלי החילוץ וassay אומתו בחלקו על ידי הוכחת כי דילולים סדרתי של תמציות מדגימות קוף שיער הניבו קריאות EIA שדומות מאוד לקריאות המתקבלות מסטנדרטים קורט אותנטיים. לאחר מכן, אנו הראו כי קורט שיער (בנוסף לפלזמה וקורט רוק) היה רגיש ללחץ הגדול בחיים של רילוקיישן מנדט מנהלי של הקופים לרבעוני דיור חדשות 4,5. Presenנייר לא מספק תיאור מפורט של השיטות המשמשות באופן שיגרתי במעבדה שלנו לעבד את דגימות שיער אדם וקוף ולחלץ ולנתח קורט מדוגמאות כאלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade isopropanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A451</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade methanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Salivary cortisol assay kits</td>
			<td style="width:116px;">Salimetrics</td>
			<td style="width:119px;">1-3002</td>
			<td>See manufacturer&#39;s kit insert for information on assay sensitivity and specificity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Max Scientific</td>
			<td>10-9151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0-ml XXTuff reinforced microvials</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>330TX</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.2-mm chrome-steel beads</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>11079132c</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10-ml stainless steel grinding jars</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">02.462.0061</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm stainless steel grinding balls</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">05.368.0037</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant activated carbon cartridge</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DTK120R</td>
			<td>Use with Savant chemical trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for 15-ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>S02135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>NC9854190&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MM 200 mixer mill</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Beadbeater 16&#160;</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant DNA Speedvac</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DNA120-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant refrigerated vapor trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>RVT400-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant chemical trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>SCT120</td>
			<td>Alternative to refrigerated vapor trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate washer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate mixer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Multichannel pipetter</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair

הורמון לחץ קורטיזול (הקורט) משולב באיטיות לתוך פיר שיער גדל והולך של בני אדם, פרימטים לא אנושיים, ויונקים אחרים. פיתחנו ומאומתים שיטה להפקת קורט וניתוח מקוף רזוס שיער ולאחר מכן הותאם בשיטה זו לשימוש עם שיער קרקפת אנושית. בניגוד ל&quot; דגימות נקודה &quot;קורט מתקבלות מפלזמה או רוק, שיער קורט מספק מדד משולב של פעילות מערכת ההיפותלמוס, יותרת המוח adrenocortical (HPA), ומתח ובכך פיסיולוגי, במהלך תקופת התאגדות הורמון. בגלל שיער קרקפת אנושי גדל בשיעור ממוצע של 1 סנטימטר / חודש, רמות הקורט מתקבלות ממגזרי שיער כמה סנטימטר באורך עלולים לשמש כסמן ביולוגי של לחץ שחווה על פני מספר החודשים. בשיטה שלנו, כל דגימת שיער נשטפה ראשון פעמיים בisopropanol כדי להסיר כל קורט מהחלק החיצוני של השערה שכבר הופקדה מזיעה או חלב. לאחר ייבוש,מדגם הוא קרקע לאבקה דקה כדי לשבור את מטריצת החלבון של השיער ולהגדיל את שטח הפנים להפקה. קורט מהפנים של השערה מופק לתוך מתנול, מתנול הוא התאדה, ותמציתו מחדש במאגר assay. קורט חילוץ, יחד עם סטנדרטים ובקרת איכות, הוא ניתח אז באמצעות immunoassay אנזים זמין מסחרי רגיש וספציפי ערכה (EIA). קריאת נתוני EIA מומר לקורט pg למשקל שיער אבקת מ&quot;ג. בשיטה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לנתח קורט שיער בבני אדם, כמה מינים של קופים מקוק, חרגולים, כלבים, ודובי קוטב. מחקרים רבים הן מהמעבדה שלנו ומקבוצות מחקר אחרות הוכיחו את תחולתה הרחבה של קורט שיער להערכת חשיפה ללחץ כרוני בטבעי, כמו גם הגדרות מעבדה.

איור 1 מציג את התדפיס מקבוצה מייצגת של דגימות שיער אדם (גבר בוגר ונושאים אנושיים נשיים) מעובד בשיטה 2 שחיקה וחילוץ. תוכנת מחשב הייתה בשימוש כדי ליצור את פלט הנתונים ולהתאים עקומת sigmoidal 4 פרמטר לסטנדרטי הקורט (איור 2). קורות החיים בין היטב מצלחת זה נע 0.01-5...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair at JoVE.com

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

קורטיזול (קורט) מצטבר בשערה הולך וגדל של בני אדם ופרימטים לא אנושיים. אנו מתארים שיטות לחילוץ וניתוח קורט שיער עם דיוק גבוה ורגישות. מדידה של שיער קורט היא טוב במיוחד מתאימה להערכת לחץ כרוני על פני תקופות של שבועות עד חודשים.

הפקה וניתוח של קורטיזול מאדם וקוף השיער

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

extraction-and-analysis-of-cortisol-from-human-and-monkey-hair

Research

JoVE Journal

Biology

28.0K Views.  University of Massachusetts, Amherst.  קורטיזול (קורט) מצטבר בשערה הולך וגדל של בני אדם ופרימטים לא אנושיים. אנו מתארים שיטות לחילוץ וניתוח קורט שיער עם דיוק גבוה ורגישות. מדידה של שיער קורט היא טוב במיוחד מתאימה להערכת לחץ כרוני על פני תקופות של שבועות עד חודשים. 

Video: Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

הפקה של ארס וארס בלוטת Microdissections מהעכבישים לproteomic וניתוח transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

טכניקה חדשה לניתוח כמותי של נשירת שיער בעכברים באמצעות ניתוח גווני אפור

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

חילוץ, תיוג וטיהור של תאים ספציפיים לשושלת מזקיקים אנטראליים אנושיים

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...