אני מודה לאנשים הבאים על עזרת בפיתוח של פרוטוקול זה: צ&#39;אק Kristensen, גרטה Binford, אלכס ק &#39;לנקסטר, קונרד Zinsmaier, ומייז עימאד. נתונים ספקטרומטריית ופרוטאומיקה המוניות נרכשו על ידי פרוטאומיקה Consortium אריזונה נתמכת על ידי ES06694 מענק NIEHS לSWEHSC, CA023074 מענק NIH / NCI לAZCC ועל ידי מכון BIO5 מאוניברסיטת אריזונה. מימון עבור עבודה זו סופק מהמכון הלאומי לבריאות (המכון הלאומי לרפואה כללית) ממענקים 1F32GM83661-01 ו1R15GM097714-01 לג&#39;סיקה א גארב.

1. הכנת מכשירי אלקטרו-ממריץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר כבל חשמל אלקטרו-ממריץ לשקעים ולצרף דוושת רגל חיצונית לכניסת האות החיצונית. הערה: חוטי חשמל חייבים להיות מבודדים כראוי ונוכחיים מספקים נחשפה מתכת לא צריך לגעת בם. ללבוש כפפות גומי או nitrile להגנה. מתג הפעלת אלקטרו-ממריץ צריכה להיות במצב OFF בעת צירוף כבל חשמל וחיבור חוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר האלקטרודה חיובית למסוף פלט אדום על אלקטרו-ממריץ (כאשר בורר קוטביות הוא במצב רגיל) ולחבר את האלקטרודה השלילית למסוף הפלט השחור. הערה: כל חוט האלקטרודה צריך לסיים בקליפ תנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממריץ נקבע ההגדרות הראשוניות המומלצים הבאות: מתח = 7 V, תדר = 1 פעימות בשנייה, עיכוב = 0 אלפיות שנייה, משך = 200 אלפיות שנייה, קטניות תאום לעבור = רגילות, ומתג מצב = off. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלט בדיקה של אלקטרודות על ידי הצמדת קליפים תנין לvoltmeחוטי בדיקה חיוביים ושליליים ter. הפעל מתג הפעלת ממריץ ולספק נוכחי עם דוושת רגל. </li></ol> 2. הכנת מלקחיים משתקים וחומרים אחרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שן אחת של מלקחיים במשקל נוצה לציפוי פלסטיק נוזלי ולחכות ארבע שעות כדי לאפשר יבש ציפוי. בחוזקה לעטוף 15 מ&quot;מ של הקצה של שיניים היריבים עם שכבה אחת של חוט תפירה מכותנה, ולאבטח את החוט על ידי קשירת הסוף בקשר. הערה: החוט משמש לקליטת תמיסת מלח מיושם שמקדמת מוליכות חשמליות, ואילו ציפוי הפלסטיק מספק בידוד לעכב נוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך קצה מחט מזרק בוטה במספריים חדים וחלק הפתיחה עם נייר חול. צרף את המחט למלכודת פסולת ואקום (למשל, בקבוק של מסנן אבק) דרך צינורות. הערה: המחט לשאוב ממנו המים ולהקיא, ותשמש כדי להשלים את המעגל שנוצר על ידי אלקטרודות ממריץ. Mu פתיחת המחטרח &#39;להיות קטן מספיק כדי לא לפגוע בעכביש, עדיין גדול מספיק כדי פתרון ואקום מבלי לסתום (לדוגמא, 25 G x 1 ½ במד, ראה חומרי רשימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים במשקל נוצת עמדה אופקיים בעמדה סגורה היטב באמצעות מהדק בשני ראשים מכוסים ויניל מאובטח לבסיס מגנטי או מכשירי עמדה קבועים תחת השדה של מיקרוסקופ לנתח מבט, עם שיניים מצופים פלסטיק של מלקחיים על גבי חוט ומצופה שיניים בתחתית. הערה: מהדק שני הראשים נשמר במצב נייח לבסיס המגנטי על ידי בעל מהדק (ראה חומרי רשימה). גומייה עשויה להיות מאובטחת בצורה הדוקה סביב שיניים של מלקחיים במשקל הנוצה, בסמוך לבעל המהדק, להוסיף לחץ נוסף כדי לשמור על המלקחיים במשקל הנוצה במצב סגור סביב העכביש הציג פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף קליפ תנין האלקטרודה החיובי לשיניים התחתונה &#39;המלקחיים במעלה הזרם של חוט ולצרף קליפ תנין השלילי כדי להקהות מחט ואקום מתכת. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעגל הבדיקה נוכחי עם מד מתח על ידי הצבת להוביל חיובי על שיני מלקחיים בין החוט וקליפ תנין והצבה להוביל שלילי על מחט ואקום בוטה. לחץ דוושת רגל כדי להבטיח הנוכחי מספיק מזוהה ולהסיר הפניות אם נוכחי מספיק מזוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין כמה צינורות microcapillary לאוסף ארס. החזק צינור microcapillary אחת בקצה אחד עם יד עטויה בכפפה ובקצה השני עם מלקחיים מתכת סטרילי, הצבת הקצה התקיים מלקחיים אופקיים מעל להבת מבער בונזן. משוך את microcapillary עם המלקחיים מתכת מהלהבה כדי ליצור קצה מוארך, תוך החזקת הקצה השני במצב נייח. הערה: ללבוש משקפי מגן כmicrocapillaries יכול בקלות שבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוח microcapillaries מוכן על רצועת מרק הרכבה בצלחת פטרי. לבחון microcapillary מסתיים תחת מיקרוסקופ לנתח וליצור פתח קטן, משופע בסוף משך עם מלקחיים מתכת מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Laמספר משתנה bel של צינורות 0.5 מיליליטר סטרילי. מוסיף מים סטריליים, ללא יונים לסטרילי צינורות (לדוגמא, 5 μl מים ללא יונים autoclaved). צינורות סגורים וצינורות מניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח בכוס ולמלא כוס שנייה עם מים autoclaved. </li></ol> 3. קיבוע של עכביש במלקחיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל CO 2 טנק ולהעביר עכביש מבקבוקון פלסטיק איסוף סגור (ראה חומרי רשימה) ל- CO 2 קאמרי באמצעות מלקחיים מתכת ארוכים. שים לב: יש לי עכבישים אלמנה שחורים ארס מסוכן; תמיד ללבוש כפפות במהלך פרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור עכביש בחדר למשך 5-10 דקות או עד שהרדים וכבר לא נע אחרי שדחק בעדינות עם מלקחיים ארוכים. השתמש פיפטה ההעברה להרטיב חוט במלקחיים עם תמיסת מלח. הערה: לקבלת הנחיות בנוגע CO 2 פרמטרים הרדמה לאלמנות שחורות, מתייחס לSpagna ומור 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר עכביש מורדם מCO 2תא על ידי להרים אותו על ידי הרגליים הקדמית שלה באמצעות מלקחיים לנתח בוטים וידיים בכפפות. הזז עכביש מורדם למשקל נוצה מנגנון מלקחיים. שיניים נפרדות של מלקחיים במשקל נוצה סגורים ומניחים cephalothorax העכביש בין השיניים ולאפשר השיניים כדי לסגור עצומות כדי להבטיח עכביש מוחזק בחוזקה במקום אך לא נמחץ. ודא שהעכביש ממוקם צד dorsum השריון כלפי מטה (ראה Foelix 20 למדריך לאנטומיה עכביש), מונח על שיני חוט מצופה, והצד הגחוני של השריון מול ציפוי הפלסטיק, ואילו האלקטרודה החיובית נשארה מחוברת לשיניים תחתונה. עבודה במהירות בעת טיפול בעכביש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם לנתח הגדלת מיקרוסקופ, מיקוד, ומקור אור עד chelicerae של העכביש והניבים גלויים לעין. </li></ol> 4. ארס אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ואקום ולרסס chelicerae עכביש עם פתרון מים באמצעות מזרק n קהה שקצה שניeedle. יניקה משם מים עם מחט ואקום כדי להסיר זיהומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גע במחט הוואקום עם האלקטרודה שלילית מצורף לדוכן עכביש ולספק דופק עם זמני דוושת רגל אחת או יותר. אבק משם להקיא במידת צורך. הערה: דוכן עכביש הוא בתוך פה אחורי לchelicerae על פני השטח הגבי בין chelicerae וendites (ראה Foelix 20 לאנטומיה עכביש מפורטת). הערה: עם כל דופק, חוזו של עכביש רגליים, וארס יהיה גלויים כמו טיפות ברורות העולות מניבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ארס טיפין עם קצה microcapillary וקצה נימי העברה ל0.5 צינור מיליליטר עם פתרון מים או חיץ (פתרון יהיה נשאב לתוך נימים). הערה: למנוע ניקוב עכביש עם נימים שעלולות להוביל לזיהום hemolymph ומוות. כמו כן למנוע זיהום של נימים עם משי ודבק מspinnerets. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק העברה עם מתאם צינור לmicrocapillary (בהפך מקצה לקצה אוסף) ודפתרון ארס ispense בחזרה לתוך צינור. שים צינור על קרח. הערה: השלך נימי פסולת במכל חד סמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בקבוקון פלסטיק איסוף פתוח, יחד עם הכובע שלה, קרוב לעכביש. לתפוס בזהירות את הרגליים של העכביש עם מלקחיים לנתח בוטים החזיקו ביד אחת ומשקל נוצה בזהירות פתוחה מלקחי שיניים עם יד השנייה, הזזה עכביש לאיסוף בקבוקון עם מלקחיים בוטים ולסגור במהירות את כובע. המשך עם צינורות המכיל ארס העכביש והחנות הבאים במקפיא -80 מעלות צלזיוס כאשר סיים. הערה: ימשיך לנקוט בזהירות בעת העברת העכביש מהמלקחיים בחזרה לתוך הבקבוקון. ודא בקבוקון האיסוף והכובע נמצא בקרבת מקום לעכביש להעברה המהירה שלה וללבוש כפפות. </li></ol> 5. ארס בלוטת וניתוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני לשלושה ימים לאחר איסוף ארס, להרדים עכביש בCO 2 תא (ראה שלב 3.1). מלא ספק חנקן נוזלי ומקום הבא למיקרוסקופ לנתח. הערה: ש&quot;שen עבודה עם חנקן נוזלי, הגנה על העין שימוש וכפפות קריוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור נקי לנתיחה ומלקחיים לנתח עם פתרון זה מבטל זיהום RNase ו- DNA. למלא צלחת פטרי קטנה תחת מיקרוסקופ לנתח עם לנתח חיץ (חיץ למשל, ציטראט מלוח-נתרן 1x (SSC)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עכביש מCO 2 תא לצלחת הפטר ולהשתמש במלקחיים כדי להפריד במהירות את cephalothorax מהבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את cephalothorax תחת מיקרוסקופ לנתח עם מלקחיים ומקם את chelicerae לשדה הראייה. השתמש בקצוות החדים של זוג שני של מלקחיים לחתוך ציפורן הצטרפות השריון להיבטים הרוחביים של chelicerae. רוחבי לתפוס chelicerae באמצעות הזוג השני של מלקחיים, ובעדינות למשוך קדימה ואחורה עד שבלוטות ארס הם הוציאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות נפרדות מchelicerae (או להשאיר מצורף לchelicerae אם רוצה) ולהעביר צינור 0.5 מיליליטר cyrosafe. Clos מקוםצינור ed בחנקן נוזלי. הערה: כל נתיחה צריכה לקחת לא יותר מ -15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לנתיחה עם עכבישים נוספים עד לסיום. העברת צינורות מחנקן נוזלי לתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol>
	<li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicogenomic+multiverse:+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms.">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li><li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venomics:+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry.">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li><li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides:+An+emerging+class+of+drug+leads.">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li><li>Casewell, N. R., W&#252;ster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+cocktails:+the+evolutionary+novelty+of+venoms.">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li><li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+aspects+of+spider+bites.">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li><li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms.">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li><li>Silva, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso/Teneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities.">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li><li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+an+update+and+review.">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li><li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+paint:+a+chlorotoxin:Cy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci.">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li><li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution,+functional+variation,+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms.">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li><li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+&#945;-latrotoxin,+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom.">Molecular evolution of &#945;-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li><li>Platnick, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).</li><li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries.">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li><li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider-venom+peptides:+Structure,+pharmacology,+and+potential+for+control+of+insect+pests.">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li><li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+landscapes:+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach.">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li><li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders.">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li><li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies.">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li><li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+activity+of+a+novel+&#945;-latrotoxin+from+red-back+spider+venom.">Cloning and activity of a novel &#945;-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li><li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+(Arachnida:+Theridiidae).">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li><li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Spiders. , (2010).</li><li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics.">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366 (2014).</li><li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+(latrodectin)+which+co-purifies+with+the+&#945;-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+(Theridiidae).">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the &#945;-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li><li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+(Latrodectus+tredecimguttatus).">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li><li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1.">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li><li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+(Agelenidae).">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li><li>Alape-Gir&#243;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper:+geographic,+individual,+and+ontogenetic+variations.">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li></ol>

המחבר יש מה למסור ולא אינטרסים כלכליים מתחרים.

ארס מהווה מקור חשוב של חלבונים מבחינה פיזיולוגית תגובה, פפטידים ומולקולות אחרות בבקשות לגילוי תרופות, כמו גם להיבטים בסיסיים של מחקר סלולארי ואקולוגי 1-3. עם זאת, האוסף של ארס, במיוחד מבעלי חיים מסוכנים או קטנים, היא משימה מאתגרת. פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן לאסוף בלוטות ארס ורעל מעכבישי אלמנה שחורות, ומאשר את ההצלחה של גישה זו באמצעות שילוב של ניתוח MuDPIT של הארס ומסד נתוני חלבון נגזרים מcDNAs המשובטים מארס בלוטות 21. בעוד פרוטוקול זה עובד היטב עבור אלמנות שחורות ועכבישים בגודל בינוניים, טכניקות אוסף ארס אחרות הייתם מועסקות במשך mygalomorph גדול עכבישים (כמו טרנטולה-), כגון שאיפה ישירה של ארס מניבים לתוך כוס טפטפות לדוגמא, 24. גישה זו אחרונה, עם זאת , לא יעבוד היטב עבור עכבישים קטנים יותר בגודל שאינם aggressive. היבט אחד קריטי במיוחד של פרוטוקול אוסף ארס המתואר כאן הוא בשלבים הראשונים של הכנה ואופטימיזציה של תהליך האיסוף, כך שהוא הופך להיות יותר שיגרתי, עקבי ומהיר יותר. הפרוטוקול הוא בהתחלה מאתגר להורים, אבל עם ניסויים חוזרים ונשנים, הוא הופך להיות קל יותר ומהיר יותר. זהירות גם דחקה בו בכל השלבים הקריטיים מעורבים בטיפול בעכבישים מסוכנים, השימוש בזרם חשמלי, מיקרו נימי זכוכית עדין נקודה, ומחטים מזרק. חשוב ללבוש ציוד מגן אישי מתאים כגון כפפות nitrile, חלוק מעבדה, מכנסיים ארוכים ונעליים סגורות, כמו גם משקפי שמש, כאשר עיצוב נימי מיקרו. עוד היבט מאתגר לאוסף ארס הוא הכמות הקטנה של ארס מיוצרת על ידי כל עכביש אחד, במיוחד מינים אלמנו, שממנה הסכומים שגבו יכול להיות ליmited ל1-2 מיקרוליטר לנפש, במקרה הטוב. קבלת ארס מספיק עבור יישומים במורד הזרם, כגון ג&#39;לים חלבון או מבחני תפקודיים עשויה לדרוש שילוב של ארס מאנשים מרובים לתוך צינור אחד. במקרים כאלה, ארס צריך להיות משולב רק מאנשים מאותו המין, השלב האונטוגנטי, ואוכלוסייה נתון הכרה בשונות intersexual, התפתחותי וגיאוגרפיות בחלק הארס 25, 26. עכבישים יכולים גם להפגין הבדלים ניכרים בכמות הארס שהופקה בין אנשים, שבו כמויות פחותות עשויות לשקף הדלדול האחרון של הבלוטה. כך זה עשוי להיות כדאי לאסוף כמה ימי ארס לאחר ההאכלה האחרונה שלהם. אם ארס קטן משתחרר, נוכחי מוגזם לא צריך להחיל את העכביש, שעלולה לגרום לציפורן להתפקע, יגרום לזיהום של הארס עם hemolymph או מוות. זיהום של דגימות ארס עם si העכבישיש להימנע גם ממקורות LK או אדם באמצעות השימוש בציוד סטרילי או נקי. למרות האתגרים הללו, אוסף של ארס טהור, שעזב את העכביש בחיים, עדיף על שיטות שלקבל ארס מhomogenates בלוטה (שאינו להפריד רכיבי ארס מחלבונים תאיים אחרים) ולהרוג את העכביש. כמו כן, חשוב להבטיח כי דגימות מוקפאות במהירות כדי למנוע פירוק חלבונים. הפקת הארס מקדמת ייצור ארס שלאחר מכן, ובכך מגרה ביטוי גני ארס בבלוטת הארס. כמה ימים כך, מכיוון שפרוטוקול זה מאפשר לעכבישים כדי לשרוד דלדול ארס, עלולות להיות גזורים הבלוטות שלהם מאוחר יותר (הריגת העכביש) בנקודה שבה ביטוי גני הארס צפוי להיות מספיק למחקרים גנטיים, כגון תמליל שיבוט 10,11. כמה אמצעי זהירות חשובות גם יש לקחת בניתוחי בלוטת ארס. יש לשים דגש על שימוש במעבדת מכשירים וציודאף אוזן גרון וריאגנטים כי הם ללא RNases שלו פוגע בRNA. כך מומלץ לנגב מלקחיים וציוד שאינו חד פעמי אחר ומשטחים עם פתרונות שלחסל זיהום RNase ו- DNA. הניתוחים צריכים להתבצע במהירות אפשרית ובאופן ישיר הקפוא כדי להבטיח את שלמות RNA של הרקמות נוספות. לבסוף, יש לבצע ניתוחים רק על עכבישים מורדמים, לאחר cephalothorax והבטן שלהם מופרדים במהירות. לסיכום, מאמר זה מספק פרוטוקול מאומת להשיג בלוטות ארס עכביש וארס. בלוטות ארס והרעל לאפשר לבידוד והאפיון של מרכיבי החלבון ופפטיד תוך שימוש בגישות proteomic וtranscriptomic. בנוסף, דגימות ארס יכולות לייצג את הנקודה של מבחני תפקודיים, הקובעים את הפוטנציאל ביו-רפואי והתרופתי של מולקולות המרכיבות אותן מתחילה. כמעט כל העכבישים מייצרים ארס, והצוללן הרחבעיר עתיקה של רכיבי ארס מסונתזים על ידי מינים בודדים מציעה מגוון עצום של מולקולות ארס הם עדיין לא גילו 13. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מספק כלים כדי לחקור את המקור העשיר של מולקולות פעילות ביולוגית קיימים בארס עכביש.

ארס הוא הפרשות בעלי חיים בעיקר הוזרקה לחיה אחרת למטרות טריפה או הגנה, וגם יישומים ביולוגיים חשובים עם הרלוונטיות ביו-רפואיות 1-3. רק בעלי חיים מסוימים לסנתז ארס, אבל הייצור שלה הוא טקסונומית נרחב על פני חסרי חוליות (לדוגמא, צורבים, חלזונות חרוט, עקרבים, עכבישים ו) ובעלי חוליות (לדוגמא, נחשים, דגים ויונקים), משום שהיא התפתחה באופן עצמאי מספר פעמים 1,4 . האפיון ביוכימי של ארס בדרך כלל להראות שהם מורכבים ממגוון רחב של חלבונים ופפטידים, הפועלים במידה רבה על מערכות דם ועצבים של בעלי חיים הזריקו כדי לספק במהירות רעלים המרכיבים 1. חלק קטן מבעלי החיים ארסיים עלול להוות איום על בני האדם, מינים במיוחד עם הפצות בקרבת האדם 5. המחקר של הרכב ארס ופעילויות פונקציונליות שיחק תפקיד חשוב בהאפיון הפונקציונלי של רכיבי חוליות סלולריים (במיוחד תעלות יונים עצביות) 6 והבהרת תהליכים בסיסיים סלולריים (לדוגמא neurosecretion) 7. יתר על כן, יש לי פפטידים ארס בחרו תכונות שימושיות בהקשרים ביו-רפואיים, הכוללים את השימושים שלהם כטיפול בסרטן וכאב 8,9, והם ממוקש למקורות תרופתיים מועמד ופיתוח חומר. ארס גם לשחק תפקיד מרכזי במחקר אקולוגי והאבולוציוני 1,4,10,11, ובכך האוסף של הפרשות מסוכנות אלה יש כלי עזר רבים. יש&gt; 40,000 מינים מתוארים של עכביש (להזמין Araneae), וכל אבל אחת משפחות העכביש יותר מ -100 להחזיק לזווג בלוטות ארס המסתיימות בניבים 12. מגוון המינים הגבוה של עכבישים עולה כי הם מייצגים את clade הגדול ביותר של יצורים ארסיים. עם זאת, אפיון ביוכימי של ארס של עכביש יש lמרוכז argely על מספר קטן של מינים לרוב משויכים envenomation האנושי. מחקרי proteomic וtranscriptomic האחרונים של ארס של עכביש לציין שהם בדרך כלל מכילים הרבה חלבונים ופפטידים 2,13,14 ייחודיים. התקדמות ברצף cDNA תפוקה גבוהה וטביעת אצבעות פפטיד ספקטרומטר המסה יש להקל באופן משמעותי את הגילוי של חלבוני ארס אלה 15. עם זאת, עבודה כזו מתחילה עם האוסף של ארס מספיק ו / או בלוטות ארס העכבישים, ותיעוד מפורט עבור טכניקות כגון מעט 16. מאמר זה מציג פרוטוקול לאוסף של ארס ורעל בלוטות מעכבישי אלמנה שחורים, אשר יכול להיות מיושם על עכבישים בגודל דומה. האוסף של ארס בנפרד מהבלוטות מאפשר זיהוי של חלבונים שמופרשים לתוך הארס בניגוד לחלבונים מבצעים תפקידים סלולריים אחרים. אלמנות שחורות וL אחרמיני atrodectus מוכרים לציבור רחב כבקרב העכבישים המסוכנים ביותר בשל הארס שלהם הרעיל ביותר, אשר גורם לכאב עז בבני אדם, שלעתים מלווה בזעה מרובה, התכווצויות שרירים, יתר לחץ דם, קשיי נשימה ושיתוק בלתי סדיר 5. פרוטוקול אוסף הארס מוצג כאן משתמש אלקטרו-גירוי כדי לספק זרם חשמלי לעכבישים בהרדמה כדי לעורר התכווצויות ושחרורו של ארס שרירי. טיפות ארס נאספות במהירות עם מיקרו-נימים ולוותר לתוך צינורות לאחסון במקפיא. כי הפרוטוקול כרוך נהלים מסוכנים, זה צריך להתבצע רק על ידי אנשים מאומנים היטב וזהירות היא דחקה בשלבים עיקריים. יש הארס שנאסף רבים שימושים, כגון אפיון ובידוד של מולקולות המרכיבות את 2, לניסויים פיסיולוגיים או מבחני תפקודיים 18, וכדי לעורר ביטוי גני ארס 11. הפרוטוקול מסתיים בdescription של נתיחת בלוטת ארס ושימור שימושי לשיבוט של גני ארס ספציפי, הביטוי שהוכח להתרחש 2-3 ימים הבאים דלדול ארס בעכבישים שונים 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Grass Technologies</td>
			<td style="width:107px;">SD9</td>
			<td style="width:435px;">http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Voltmeter</td>
			<td style="width:153px;">RadioShack</td>
			<td>22-223</td>
			<td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pointed Featherweight Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td>4748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasti Dip</td>
			<td style="width:153px;">Performix</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle</td>
			<td style="width:153px;">BD Medical&#160;</td>
			<td>305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum filter flask 1L</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td>DS4101-1000</td>
			<td>smaller flask sizes may also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td style="width:107px;">4280-0900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53508-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting putty strip&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Loctite</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td>
			<td style="width:153px;">Fisher</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe)</td>
			<td style="width:153px;">Eppendorf</td>
			<td>22363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53225-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78310-0</td>
			<td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Foot switch/pedal</td>
			<td style="width:153px;">Linemaster Switch Corp.</td>
			<td style="width:107px;">491-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">21570-007</td>
			<td>similar models could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Clamp Holder</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">89084-746</td>
			<td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">300042-270</td>
			<td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td style="width:107px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cotton sewing thread</td>
			<td style="width:153px;">Threadart.com</td>
			<td style="width:107px;">&#160;THRCOT9</td>
			<td>similar product could be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

ארס הם כימי הפרשות מורכבות בדרך כלל כוללות מספר רב של חלבונים ופפטידים עם פעילויות פיסיולוגיות מגוונות. אפיון פונקציונלי של חלבוני ארס יש יישומים ביו-רפואיים חשובים, לרבות זיהוי המקורות תרופתיים או בדיקות לקולטניות תאים. עכבישים הם clade העשיר ביותר המינים של יצורים ארסיים, אבל הארס של רק כמה מינים הם הבינו היטב, בין שאר בשל הקושי כרוך באיסוף כמויות זעירות של רעל מבעלי חיים קטנים. מאמר זה מציג פרוטוקול לאוסף של ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי, הממחיש את ההליך על האלמנה השחורה המערבית (אלמנה השחורה). הארס שנאסף שימושי לניתוח במורד הזרם מגוון הכוללים זיהוי ישיר של חלבון באמצעות ספקטרומטר מסה, מבחני תפקודיים, וגירוי של ביטוי גני ארס ללימודי transcriptomic. טכניקה זו יש יתרון על פני פרוטוקולים שISOארס מאוחר מhomogenates בלוטה כולה, שאינו להפריד רכיבי ארס אמיתיים מחלבונים תאיים שאינם מופרשים כחלק מהארס. נציג תוצאות מדגימות את זיהוי של פפטידים ארס ידועים מהמדגם שנאסף באמצעות ספקטרומטר מסה. הליך גביית הארס ואחריו פרוטוקול לביתור בלוטות ארס עכביש, עם תוצאות מראות שזה מוביל לאפיון חלבונים הביעו ארס ופפטידים ברמת הרצף.

האוסף של ניתוחי ארס ובלוטת ארס לעתים קרובות מבוצע לאפיין חלבוני ארס ופפטידים ברמת הרצף 10,11,15. גם ארס נאסף עשוי לשמש במבחנים פיסיולוגיים כדי לקבוע הפעילויות פונקציונליות שלהם 18. האוסף של ארס יעודד ביטוי ארס גן הבלוטה, ובכך להקל על השיבוט של תמלילי רעלן ספציפיים באמצעות RT-PCR 10,11. זיהוי של חלבוני ארס גם יכול להיות מושלם באופן תפוקה גבוהה על ידי שילוב שיטות של ספקטרומטריית מסה סטנדרטית עם מסדי נתונים רצף שנוצרו מספריות cDNA בלוטת ארס 15,21. דוגמא לעבודה כזו, החל מארס והבלוטות שנאספו באמצעות הפרוטוקול המפורט לעיל, מדגימה את האפקטיביות שלה, באה לידי ביטוי באיור 1. ארס שנאסף מL. נשים בוגרות Hesperus היו מתעכל עם טריפסין ונתונים לפתרוןניתוח MuDPIT, המקשר HPLC (כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים) לספקטרומטר מסת טנדם (MS / MS). הנה ניתוח MuDPIT בוצע על ידי אוניברסיטת אריזונה פרוטאומיקה Consortium. המוני הפפטידים שזוהו ושברים ניתקו (יונים בתו, המשתמעים מספקטרום) הושוו לרצפי פפטיד נחזו באופן תיאורטי מתרגומים של רצפי cDNA שהתקבלו מספריית ביטוי גנים שנבנתה מL. בלוטות ארס Hesperus (בלוטות נרכשו על ידי הפרוטוקול לנתיחה שתוארו לעיל) 21. בניסוי זה, 36 חלבונים אותרו מכל הספקטרום שנאסף, על סף הסתברות 99.9%, והכילו לפחות אחת זוהה פפטיד. אחד החלבונים שזוהו נתמך על ידי 43 ספקטרום כולל (ספקטרום מופת שמוצג באיור 1 א), מקביל לשלושה פפטידים בלעדיים, המכסה 35% מרצף החלבון (איור 1). החלבון המזוהה (בתרגום מcollecte<html> יש ד cDNA) להיט BLASTp עליון לlatrodectin מL. tredecimguttatus (GenBank הצטרפות P49125.1), עם דואר ציון של 2E-46, ומניות זהות 80% ברמת רצף חומצות אמינו עם החלבון שהתגלה בניסוי הזה. Latrodectin, אשר ידוע גם בשם חלבון מולקולרי נמוך אלפא-latrotoxin משקל, הוא רכיב ארס מוכר של אלמנה שחורה עכבישי 22, 23, המאמת את היעילות של הפרוטוקול שהוצג. כמה חלבונים זוהו מהארס מתאים לרצפים שלגביהם לא להיט פיצוץ הוא מצא. לא ברור אם זו תהיה תוצאה, בשל המשאבים מוגבלים הגנומי הזמינים לעכבישים, כמו גם המידע הפונקציונלי המוגבל לחלבונים שלהם, או בגלל שהחלבון ידוע מייצג מזהם ארס. עם זאת, גן או ביטוי חלבון מנתח בוחן את השפע של חלבון כגון רומן בבלוטות ארס ביחס לרקמות אחרות צריכים לגלות אם זה הוא מרכיב שנאה אמיתי. אף אוזן גרון &quot;fo: לשמור על-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1: פפטיד Latrodectin זיהה מארס אלמנה שחור באמצעות ספקטרומטר מסה () ספקטרום נציג (אחד 43) זוהה באמצעות חלק MS / MS ניתוח MuDPIT של ל &#39;. Hesperus ארס שיועד לתרגום חזוי של רצף cDNA שנאסף מוצג בחלק ב &#39;ספקטרה תערוכות המוניות לחייב יחס (m / z) של יוני בת זוהו על הציר האופקי המיוצר על ידי פיצול פפטיד ההורה (CGEEDFGEEIVK), עם אותיות בראש המציין את רצף הפפטיד המבוסס על המוני יון בת. (ב) רצף החלבון שאליו ספקטרום בחלק שהוקצה, מראה בצבע אדום, נועז וטקסט בקו תחתון את הרצף המקביל מהספקטרום שמוצג בחלק, טקסט אדום נוסף (לא מודגש) מייצג פפטיד אחר בחלבון זה זוהה עם sp שנאסף אחרectra. רצף החלבון מתורגם מרצף cDNA שהתקבל מבלוטות ארס גזורים.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

מאמר זה מספק פרוטוקול להפקת ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי כדי 1) לנהל אפיון proteomic, 2) ביטוי ארס גן הבלוטה לעורר, ו- 3) לבצע מחקרים תפקודיים של ארס. זה ואחריו תיאור של microdissections בלוטת ארס ללימודי ביטוי גנים.

הפקה של ארס וארס בלוטת Microdissections מהעכבישים לproteomic וניתוח transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

33.2K Views.  University of Massachusetts Lowell.  מאמר זה מספק פרוטוקול להפקת ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי כדי 1) לנהל אפיון proteomic, 2) ביטוי ארס גן הבלוטה לעורר, ו- 3) לבצע מחקרים תפקודיים של ארס. זה ואחריו תיאור של microdissections בלוטת ארס ללימודי ביטוי גנים. 

Video: Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

הפקה וניתוח של קורטיזול מאדם וקוף השיער

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to study the functions and evolution of bacterial symbionts in their host. As most symbionts cannot be cultured in vitro, methods to isolate an adequate quantity of bacteria for genome sequencing are very important. In the whitefly Bemisia tabaci, a number of endosymbionts have been identified and are predicted to be of importance in the development and reproduction of the pests through multiple approaches. However, the mechanism underpinning the associations remains largely unknown. The obstacle partially comes from the fact that the endosymbionts in whitefly, mostly restrained in bacteriocytes, are hard to separate from the host cells. Here we report a step-by-step protocol for the identification, extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci mainly by dissection and filtration. Endosymbiont samples prepared by this method, although still a mixture of different endosymbiont species, are suitable for subsequent genome sequencing and analysis of the possible roles of endosymbionts in B. tabaci. This method may also be used to isolate endosymbionts from other insects.

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Here, we present a protocol to isolate endosymbionts from the whitefly Bemisia tabaci through dissection and filtration. After amplification, the DNA samples are suitable for subsequent sequencing and study of the mutualism between endosymbionts and whitefly.

שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly<em&gt; Bemisia Tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...