אנו מודים לmetabolomics UAB ממוקד ומעבדת פרוטאומיקה, אשר כבר נתמך בחלקו על ידי המרכז לחקר מחלות עור UAB (P30 AR050948 לג Elmets), מרכז UAB-UCSD אובריאן אקוטי בכליות הפציעה (P30 DK079337 לא Agarwal ) והמרכז לבריאות ריאות UAB (R01 HL114439, R01 HL110950 לי&quot;א Blalock). תמיכה בספקטרומטר המסה הייתה מNCRR משותף מכשור מענק (S10 RR19261 ס &#39;ארנס). אנו מודים גם ריי מור לקבלת תמיכה טכנית. ג זני elegans נמסרו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis, אשר ממומן על ידי המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R01GM085105 לMAM, כולל תוספת מנהלית ערה).

הפרוטוקול כפי שיתואר להלן מחולק לשלושה חלקים: תרבות תולעת, חילוץ פרוסטגלנדין, וניתוח פרוסטגלנדין. כאמור, יש מספר רב של נקודות, כאשר דגימות ניתן לאחסן באופן זמני ב -80 ° C או -20 ° C. 1. תרבות תולעת אנו ממליצים כ -6 גרם של תולעים בשלב מעורבים לLC-MS/MS המקיף. זה אמור לספק מספיק חומר לגילוי לפחות שש זריקות נפרדות. לכימות של PGs הידוע על ידי MRM בזריקה אחת או שתיים, 1-2 גרם מספיקים. ניתוח של תמציות מתרבויות מסונכרנות בהיקף של שלב מסוים הוא גם אפשרי. ניתן לגדל עד 4 זנים שונים בו זמנית. לדוגמה, סוג בר שליטה ושלושה זנים מוטנטים שונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 65 צלחות NGM-X גדולים (16 ס&quot;מ) וחיידקים מרוכזים להאכלה משלימה. השתמש NA22 חיידקים לזריעה. כדי להפוך את החיידקים מרוכזים להזנה משלימה, Groלפחות ארבעה ליטרים של w NA22 במדיום LB ל16-24 שעות. ספין למטה, להסיר את supernatant, resuspend וחיידקים ל -100 מ&quot;ל של חיץ M9. 200 עד 400 מ&quot;ל של תמיסת חיידקים מרוכזת זו עשויה להידרש לכל זן תולעת. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תרבויות תולעת על 5 צלחות ה-X גדולים. תולעים לגדול לכ -3 עד 4 דורות עד שצלחות מלאים במבוגרים הרה להולדת. יש להוסיף לחיידקים מרוכזים צלחות כדי למנוע רעב, במידת צורך (~ מ&quot;ל / 1 צלחת ולתת להתייבש לחלוטין לפני חזרת המכסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף הרמפרודיטים הרה להולדת מצלחות עם חיץ M9 ולאסוף את התולעים בצינור פוליפרופילן חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הרמפרודיטים הרה להולדת להתיישב לתחתית (בדרך כלל כ 3-5 דקות). הסר supernatant, כולל חיידקים, ביצים, ותולעי שלב זחל. Resuspend ב15 מיליליטר חיץ M9 ולערבב בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 200 μl של השעיה תולעת לכל אחד מ60 צלחות NGM זרע. לפזר תולעים בצלחות. שמור על פתרון תולעת מעורבתגם עד שכל הצלחות היו זורעים על מנת להבטיח שהם מקבלים מספרים שווים של תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים עם חיידקים מרוכזים לפי צורך (~ 24 ml/plate/12 לתקופת שעה 1) כדי למנוע רעב. לאפשר צלחות לייבוש באוויר לפני החלפת מכסים. לגדול תולעים במשך 2-4 דורות, בהתאם למספר המקורי של תולעי זרע, או עד צלחות מלאים במבוגרים הרה להולדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תולעת קציר זן אחד בכל פעם. לשטוף את תולעי הצלחות עם חיץ M9 ולאסוף בצינורות 50 מ&quot;ל פוליפרופילן (למשל 6 צינורות). השתמש חיץ M9 לשטוף את צלחת, ולאחר מכן להעביר את המאגר מלא תולעת לצלחת הבאה. לאחר שטיפת מספר (לדוגמה. ה -10) של צלחות, להעביר את המאגר מלא לתולעת צינור 50 מ&quot;ל. מלא את הצינור לחלק העליון עם חיץ M9. חזור על לשטוף לשאר צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו המבוגרים הרה להולדת ליישב לתחתית ב5-6 דקות, להסיר את supernatant (~ 35 מ&quot;ל) ולאחד לתוך צינורות אחד או שניים. ממלא את הצינורות ל 50 מ&quot;ל עם frאש M9 החיץ, לתת לעמוד במשך 3-5 דקות, ולהסיר מבוגרים הרה להולדת עוזבים supernatant. חזור 3 פעמים או עד supernatant הוא שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משעמם פיפטה פסטר גדולה, העברה כתולעים רבים ככל האפשר לשני צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל פוליפרופילן. ספין למטה ב 1000 RCF (~ 3,500 סל&quot;ד בCentraSL2) במשך 5 דקות בצנטריפוגה קלינית. הסר supernatant וחזור עד שכל התולעים ומועברים pelleted באותו הצינור. להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר ותולעים בחנות ב -80 ° C. חזור על פעולה עבור כל הזנים. </li></ol> 2. הפקת פרוסטגלנדין החומרים הכימיים הדרושים לחילוץ מוצגים להלן. השיטה היא שונה מזה של Golovko ומרפי 17 וכוללת מיצוי אצטון ואחריו טיהור נוזלית נוזלית, אשר משפרת את רגישות LC-MS/MS. Bullet בלנדר 5 homogenizer משמש בהליך, אם כי ניתן להשיג תוצאות דומות עם homogenizer Dounce. hydroxytolue Butylatedנה (BHT) ואידוי תחת חנקן (N 2) גז נמצא בשימוש כדי למנוע חמצון. כל כלי הזכוכית יש siliconized (Sigmacote) כדי להפחית מחייב שומנים בדם. מיצוי עם ממסים אורגניים יש לבצע במנדף כימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל צינור פוליפרופילן חרוטי 50 מ&quot;ל. העבר כ 6.0 גרם של תולעים קפואים מצינור חרוטי 15 מ&quot;ל מאוחסן ב -80 ° C על ידי חיתוך דרך הצינור עם סכין גילוח חם ליד סימן מיליליטר 6.5. מרית מתנול לניקוי יכולה לשמש כדי להסיר את תולעת גלולה קפוא מהחלק התחתון של הצינור. על ידי חיתוך באמצעות גלולה כדי לאחזר את החלק התחתון, תולעי זחל פחות צפופים ושיירי חיידקים מהחלק העליון של גלולה נשארים מאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התולעים קפואים לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל נשקל מראש. אם דוגמאות רבות נמצאים בעיבוד, משתמש באותה הכמות (6.0 גר &#39;) של רקמה למחקרים השוואתיים. כהפשרת תולעים לעיסה, להוסיף או להסיר תולעים עם המרית כדי להשיג מסה הרצויה. אופציונלי: מודעהng ד 1.00 של PGF 2α-D4 סטנדרטי כמו בקרה פנימית ליעילות שאיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 מ&quot;ל של 2:1 קר כקרח אצטון / מלוח עם BHT 0.005% להשעית התולעת ומערבבת היטב על ידי vortexing. לוותר על 1.5 מ&quot;ל של תרחיף תולעת לכל אחד מעשרה 5 צינורות פלסטיק עצמי עומדים מ&quot;ל לשימוש בבלנדר Bullet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.7-0.8 מ&quot;ל של 0.5 מ&quot;מ הקוטר ceria התייצב חרוזים זירקוניום אוקסיד לכל צינור 5 מ&quot;ל. סגור את המכסים היטב ולטעון את 12 צינורות לתוך homogenizer Bullet בלנדר 5. הפעל את הבלנדר במשך 3 דקות במהירות 8-9 ומקום הצינורות על קרח. הקפד לסגור את המכסים באופן הדוק מאוד או התוכן עלול להישפך החוצה. בדקו 10 μl של homogenate מצינור אחד בשקופית באמצעות stereoscope. לא צריך להיות מעט מאוד תולעים שלמים שנותרו. חזור באותה המהירות עוד דקה, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שווה להעביר את homogenates לארבעה 10 צינורות זכוכית חרוטי מ&quot;ל באמצעות &quot;פיפטה פסטר 9. הימנע מהעברת חרוזים. שטוף את החרוזים משלושה צינורות sequentially עם 1 מ&quot;ל של אצטון 01:02 / BHT המכיל תמיסת מלח. חזור על פעולה עבור צינורות אחרים עד שכל חרוזים נשטפים. מעבירים את הפתרון הנותר (~ 4 מ&quot;ל) ל 10 מ&quot;ל צינורות הזכוכית ולמקם אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 10 מ&quot;ל צינורות זכוכית על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה קלינית ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות. מעבירים את supernatant מצינור לצינור 10 מיליליטר חרוטי זכוכית נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף כימי, מוסיף נפח שווה של הקסאן לכל שפופרת זכוכית 10 מ&quot;ל. לדוגמה, הוסף הקסאן מ&quot;ל 3.5 מ&quot;ל לאצטון / תמיסת מלח 3.5. מערבולת במהירות המרבית למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 10 מ&quot;ל צינורות זכוכית על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה קלינית ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות. מחק את השלב העליון המכיל הקסאן ושומנים טעונים ניטראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך לחומצת השלב נמוך יותר ל-pH 3.5 באמצעות 2 חומצה פורמית ז (כ 100 - 150 μl). pH בדיקה באמצעות רצועות pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של כלורופורם לצינור אחד. מערבולת במהירות המרבית למשך 30 שניות וצנטריפוגה הצינורות ב 4 ° C אניצנטריפוגות קליניות נה ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק את השלב העליון המימית. הכנס קצה פיפטה דרך כל שלבי ביניים חלביים שיורי לשלב כלורופורם הנמוך, הימנעות ביניים. לאסוף את השלב נמוך יותר מכל אחד 4 הצינורות לצינור זכוכית חרוטי נקי 15 מ&quot;ל. דגירה ב -20 ° C במשך לפחות 24 שעות. בשלב זה, ניתן לאחסן את התמצית ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התמצית מהמקפיא וזורקים את השכבה העליונה המימית החלבית שנותרה, אם הוא קיים. מעבירים את שלב כלורופורם לבקבוקון זכוכית ½-דראם כותרת טפלון מרופד באמצעות pipet חדש פסטר. במנדף כימי, תתאדה חלק קטן המסיס בכלורופורם ליובש מתחת לזרימה עדינה של גז N 2. ניתן לאחסן התמצית מיובשת ב -20 ° C עד 2 שבועות. תכנית כוללת המשמשת להפקה וניתוח PG מוצגת באיור 1. </li></ol> 3. ניתוח פרוסטגלנדין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מנייתפתרונות של פרוסטגלנדינים התייחסות בודדים, כגון PGF 2α או PGF 2 α-D4 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במתנול ולדלל עם מתנול: מים (08:02 V / V) כדי להשיג פתרון עובד. הכן סדרה של דילולים (100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng / ml) כדי ליצור עקומה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מתנול μl: מים (08:02 V / V) לג המיובש תמצית elegans שומנים (ים) ומערבבים היטב. אם פחות מ -6 גרם של רקמת תולעת היה שחולץ, התמצית מיובשת יש resuspended בפחות נפח של מתנול: פתרון מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השלב הנייד בהיקף של 0.1% חומצה פורמית במים [] ואצטוניטריל המכיל חומצה פורמית 0.1% [B]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת autosampler על 4 מעלות צלזיוס ומניח את הבקבוקונים מדגם במעמד בקבוקון 1.5 מ&quot;ל 70-ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את עמודת RP-C18 סינרגיה הידרו עם חומצה פורמית 0.1% בקצב זרימה של 0.2 מ&quot;ל / דקה במשך כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק המדגם (20-50 μl) לעמודה. לבצע שיפוע elution התחלהing עם 10% ב &#39;והולך עד 80% B מ 0-11 דק&#39;, ב &#39;80-100% 11-14 דקות, וחוזר חזרה ל10% ב&#39; ב 16 דקות. סה&quot;כ זמן הריצה הוא 20 דקות. זמני השמירה של 13 תקנים אותנטיים מוצגים בטבלה מס &#39;1 לעיון 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את עמודת השפכים לספקטרומטר המסה באמצעות הפעלה ממשק ESI במצב היונים השלילי. חנקן משמש כnebulizer וגז וילון (נוכ = 10). התנגשות הגז, האנרגיה התנגשות, והטמפרטורה נקבעים בגיל 10, ו-35 eV 600 מעלות צלזיוס, בהתאמה. פוטנציאל Declustering (DP), התנגשות אנרגיה (CE), ופוטנציאל יציאת תא (CXP) נקבעים ב-90, -35 ו -10, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור סריקות סקר (סריקות רבעון 1), השתמש במצב יון שלילי בטווח המסה של m / z 315-360 עבור רוב PGs (איור 2). ניתן לשנות את הטווח, בהתאם למסה של המתחם (ים) של עניין. לחלץ יונים מיון נוכחי כולל (עוית) של chromatograms יון LC-MS ולקבוע אם extracיוני טד מתאים ליוני deprotonated או adduct, או ליונים שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסויים של MRM, מעבר המוני מ &#39;/ z 355/311 משמש כדי לזהות את מעמד F1, מ&#39; / z 353/193 משמש לכיתת F2 ו&#39;/ z 351/193 או 351/191 משמש לכיתת F3 (איור 3). MRM משמש גם כדי לזהות את התקן הפנימי (לדוגמה, מ &#39;/ z 357/197 לPGF 2α-D4) ועל מנת ליצור את העקומה הסטנדרטית. ראה מרפי et al. לקבלת מידע נוסף על מעברים המוניים PG 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניסויי MS / MS, השתמש מ &#39;/ z 355 לכיתת F1, F2 כיתת 353for מ&#39; / z, וPGs מ &#39;/ z 351for F3 ייצוגית. ג נתוני elegans MS / MS לPGs F-Series זמין באיור 4 וטבלה 2 3,16. נתונים MS / MS לeicosanoids יונקים זמין <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">בwww.lipidmaps.org.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את נתוני האנליטיות באמצעות analysתוכנה לא (גרסת 1.4.2, יישומי Biosystems). </li></ol>

<ol>
	<li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans.">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).</li><li>Marza, E., Lesa, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+and+neurotransmission+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).</li><li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/FOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction.">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li><li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP(3)-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans.">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).</li><li>Kosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eicosanoid+formation+by+a+cytochrome+P450+isoform+expressed+in+the+pharynx+of+Caenorhabditis+elegans.">Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. J. 435, 689-700 (2011).</li><li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo.">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473, 226-229 (2011).</li><li>Gerisch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bile+acid-like+steroid+modulates+Caenorhabditis+elegans+lifespan+through+nuclear+receptor+signaling.">A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).</li><li>Edison, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+pheromones+regulate+multiple+complex+behaviors.">Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).</li><li>Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandins+and+leukotrienes:+advances+in+eicosanoid+biology.">Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.</a> Science. 294, 1871-1875 (2001).</li><li>Wang, D., Dubois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eicosanoids+and+cancer.">Eicosanoids and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).</li><li>Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+prostanoids:+deciphering+the+developmental+functions+of+cyclooxygenase-derived+prostaglandins.">Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins.</a> Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).</li><li>Hata, A. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+and+signaling+of+prostaglandin+receptors:+multiple+roles+in+inflammation+and+immune+modulation.">Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation.</a> Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).</li><li>Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+function+of+prostanoid+receptors:+studies+from+knockout+mice.">Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.</a> Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).</li><li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprostanes:+novel+bioactive+products+of+lipid+peroxidation.">Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation.</a> Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).</li><li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogenous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+C.+elegans+reproductive+tract.">A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).</li><li>Golovko, M. Y., Murphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+LC-MS/MS+procedure+for+brain+prostanoid+analysis+using+brain+fixation+with+head-focused+microwave+irradiation+and+liquid-liquid+extraction.">An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction.</a> J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).</li><li>Murphy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+and+tandem+mass+spectrometry+of+eicosanoids.">Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids.</a> Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).</li><li>Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+biochemistry+of+the+isoprostane+pathway.">Human biochemistry of the isoprostane pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).</li><li>Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+metabolism+of+eicosapentaenoic+acid+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li></ol>

יש החוקרים אין ניגודי אינטרסים.

אנו מתארים הליך להפקה וניתוח eicosanoid, תוך התמקדות בPGs F-Series. ישנם כמה חלקים של ההליך שיכול להיות בעייתי. ראשית, זה קריטי, כי תרבויות התולעת לא לגווע ברעב, כמו רעב יכול לשנות את חילוף החומרים PG. להזנה משלימה, NA22 חיידקים מומלצים במקום OP50 חיידקים יותר נפוצה בגלל NA22 מגיע צפיפות גבוהה יותר. עם זאת, מתח NA22 חסר עמידות לאנטיביוטיקה והוא רגיש יותר לזיהום. שנית, תולעים לסנתז איזומרים PG בודדים בשפע נמוך יחסית לרקמות יונקים. זה יכול להיות בגלל בחלקו ליתירות בין איזומרים רבים. אנו ממליצים על 6 גרם של רקמה לניתוח מקיף ואותות חזקים יותר. רקמה פחות (1-2 גרם) יכולה לשמש אם התמצית מיובשת היא resuspended בפחות מתנול: פתרון מים כדי להגדיל את ריכוז PG. עם זאת, יכולות להתבצע רק 01:59 זריקות. גבול הגילוי של מערכת LC-MS/MS שלנו הוא כ -10 PGPGF 2α / מ&quot;ל. מ&quot;ל אחד של תולעים בשלבים מעורבים בצפיפות (כ 1 ז) מניב בערך 25-50 PG של CePGF2. מערכות ספקטרומטריית מסה יותר רגישות יכולות להפחית את כמות רקמת תולעת נדרשת לניתוח. שלישית, הבדלים ביעילות שאיבת PG בין דגימות יכולים לגרום לתוצאות משתנות. מצאנו כי יעילות שאיבה דומה מאוד כאשר רקמות המחולצות במקביל. כדי לקבוע את היעילות, להוסיף 1.0 ננוגרם של PGF 2α-D 4 בצעד homogenization כבקרה פנימית. MRM באמצעות מעבר המוני מ &#39;/ z 357/197 משמש למדידת ריכוז PGF 2α-D4 יחסית לng 1 / מיליליטר פתרון סטנדרטי. כמות PGF 2α-D 4 איבד במהלך החילוץ ולאחר מכן מחושבת. ניתן לשנות את פרמטרי כרומטוגרפיה והמעברים המוניים שכוללים לזהות PGS וeicosanoids אחרים. למרות מאמצים רבים, לא הצליחו לזהות D-סדרה או E-series PGS בתמציות 17. יתר על כן, יש לנו לא זוהה 8-ISO PGF 2α ו8-ISO PGE 2 שאופייניים לחמצון רדיקלי ביוזמת חופשי, אשר יוצר תערובת לא סלקטיבי של PG stereoisomers 19. בין אם תולעים לסנתז סוגי PG אחרים אינו ידוע. Endocannabinoids מטבוליטים אפוקסי והידרוקסי שונים של הארכידונית וחומצות eicosapentaenoic כבר נמצאו בג elegans מחלץ 5,7,20,21. אנו ממליצים על השימוש בשני MRM ו-MS / MS בהשוואה לסטנדרטים אותנטיים לכימות וזיהוי, בהתאמה. לeicosanoids הרומן, צריכים להיות בשילוב עם ניתוחים אלה מחקר השוואתי של מוטציות שומן, שהם חסרים PUFA סינתזה 22 אנזימים, כמו גם assay פונקציונלי, במידת האפשר. אזהרה לניתוח מוטציות שומן היא שהכמויות זעירות של PUFAs בהווה בתולעים מספיקות לסינתזת PG. לדוגמה, בשומן (2 wa17) מוטנטיםיש כמות קטנה של פעילות desaturase D12 (~ 5% מהסוג בר 22) ומוטציות אלה עדיין מייצרים 6 PGs. שומן 3 (wa22) ושומן-4 (wa14) מוטנטים מצליח לסנתז PGs נגזר מהארכידונית וחומצות eicosapentaenoic 16 . אנחנו גם מצאנו כי מוטציות שומן לפצות על האובדן של כיתות PUFA בשיעור של עד ויסות סינתזת PG מכיתות שנותרו. לדוגמה, בשומן 3 (wa22) מוטנטים מצליח לסנתז רוב PGs נגזר מPUFAs 20 פחמן. במקום זאת, הם מופיעים למעלה להסדיר PGs הרומן נגזר מ18 פחמן PUFAs 16. נכון להיום, יש לנו לא זיהינו את ג elegans זן שהוא חסר לחלוטין בסינתזת PG. יתכן כי PGs חיוני לצמיחה או התפתחות.

פרוסטגלנדינים (PGS) הם מעמד חשוב של הורמוני שומנים שנחקרו בהרחבה ומעורבת בויסות רבייה, חסינות, ופיתוח במגוון רחב של אורגניזמים 12-14. PGs מתאים בצורה אידיאלית לניתוחי ביולוגיה מערכות מקיפים משום שהם מהווים סדרה של שומנים שמקורם מבשר נפוצה (ים). נמטודות ג elegans הוא אחד מיצורי המודל הנפוץ ביותר כדי לענות על שאלות בסיסיות בגנטיקה וביולוגיה של מערכות. אנחנו הוכחנו כי ג elegans מסנתז PGs F-Series שמדריך ניעתי זרע לביציות 3,6,16. PGs F-Series נגזר מPUFAs 20 פחמן עם שלוש, ארבע, וחמישה קשרים כפולים, הכוללים את F1, F2, F3 וכיתות, בהתאמה זוהה 3,16. PGs אלה מסונתזים עצמאי של אנזימי cyclooxygenase, עדיין stereoisomers 2α 1α וPGF PGF עדיין generated. עבור ניתוחים איכותיים וכמותיים של ג elegans PGs, LC-MS/MS הוא טכניקה אנליטית חזקה ורגישה. לפני ביצוע ניתוח זה, חשוב לפתח שיטת חילוץ אופטימלית בגלל ביצועים של התהליך האנליטי תלויים בכבדות על איכות התמצית. כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה יכולות רק לספק המונית צפוי לחייב את היחס (מ &#39;/ z), כמו גם את הצורה רצויה לשיא וזמן שמירה של יון הורה PG. פרופיל מטבולי של PGs בג elegans הוא משימה מאתגרת הדורשת אסטרטגיות רכישת MS שונות. סריקת סריקה או סקר מלאה LC-MS (סריקת Q1) יש את היתרון של הבטחת PGs ionizable ביותר יגרור תגובת ספקטרומטריה. תוך סריקת הסקר מספקת מידע שימושי על פרופיל כולל של PGs ביחס לפראי סוג ומוטצית ג elegans, גילוי של PGs קטין נפגעת בשל רגישות נמוכה. Nevertheפחות, סריקת סקר LC-MS יכולה לתת ראיה גלובלית של PGS ושימושי במיוחד לניתוח חזו מוטציות משפיעים על חילוף חומרים של אוכלוסיית PG גדולה. יש להציג התעודה מזהה המטבוליט, ניתוח LC-MS/MS של תקני PG מסונתזים כימי מבוצע ראשון לקבל ספקטרום יון המוצר שלהם כתרכובות התייחסות. ספקטרום אלה יכולים להיות בהשוואה לספקטרום של המטבוליט לא ידוע. ניטור מצב תגובה מרובה (MRM) משמש לרגישות וסגוליות משופרים. ניסוי MRM מושגת על ידי ציון המעבר המוני יון יון / מוצר האב של מתחם. אם ידע את המסה והמבנה של analytes היעד, ניתן לחזות מעברי MRM תיאורטיים למטבוליטים רבים לא ידועים. שיטת LC-MS/MS מותאמת לפרופיל PGs isomeric בג elegans לא דווח. כאן אנו מתארים חילוץ וגישת ספקטרומטריית מסה משולבת בהיקף של LC-MS וLC-שיטות MS / MS לאיתור, כימות, וחוקר ג מטבוליטים PG elegans. גישה זו יכולה להיות מיושמת על eicosanoids אחר.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-large (16 cm) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875714</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain NA22</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>NA22</td>
			<td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, 399.5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A928-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butylated Hydroxytoluene</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101162</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, 399%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC27048-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC26832-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2&alpha;-d4</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>316010</td>
			<td>Cayman has a wide array of standards available for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile screw cap self-standing 5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-651</td>
			<td>For use with Bullet Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>ZrOB05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes</td>
			<td>Kimble Kimax</td>
			<td>45200-10</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml glass conical tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>8082-15</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote (Siliconizing reagent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V1235C-TFE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentraSL2 Clinical Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>2517N92-TS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender 5 blue homogenizer</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>BBY5MB</td>
			<td>A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergi 4 &mu;m Hydro-RP 80 &Aring; LC Column 250 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>00G-4375-B0</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>AJ0-7510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Guard Cartridges Kit</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>KJ0-4282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler</td>
			<td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 4000 triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">M9 buffer recipe (4 liter)</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>12 g</td>
						<td>KH2PO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 g</td>
						<td>Na2HPO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>20 g</td>
						<td>NaCl</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Up to 4 liter</td>
						<td>Deionized water</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool.</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>0.5 ml/bottle</td>
						<td>1 M MgSO4</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prostaglandin extraction and analysis in caenorhabditis elegans

elegans Caenorhabditis מתגלה כמודל חיה רב עוצמה כדי לחקור את הביולוגיה של שומני 1-9. פרוסטגלנדינים הם מעמד חשוב של eicosanoids, שהם אותות שומנים שמקורם בחומצות שומן רב בלתי רוויות (PUFAs) 10-14. מולקולות האיתות הללו הן קשים ללמוד בגלל השפע הנמוך שלהם והאופי תגובתי. התכונה האופיינית של פרוסטגלנדינים היא מבנה טבעת cyclopentane ממוקם בתוך עמוד השדרה חומצות השומן. ביונקים, יכולים להיווצר באמצעות פרוסטגלנדינים cyclooxygenase מסלולים ועצמאיים 10,15 אנזים התלויים. ג elegans מסנתז מגוון רחב של פרוסטגלנדינים עצמאיים של cyclooxygenases 6,16,17. מעמד גדול של פרוסטגלנדינים F-Series זוהה, אבל המחקר של eicosanoids הוא בשלב מוקדם עם מספיק מקום לגילויים חדשים. כאן אנו מתארים הליך להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים וeicosanoids אחרים. שומנים טעוניםים מופק מתרבויות תולעת ההמוניות באמצעות טכניקת מיצוי נוזלית נוזלית ונותח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים את electrospray יינון טנדם ספקטרומטריית המסה (LC-ESI-MS/MS). הכללתו של אנלוגים deuterated של פרוסטגלנדינים, כגון PGF 2 α-D 4 כסטנדרט פנימי מומלץ לניתוח כמותי. ניטור תגובה מרובה או MRM יכול לשמש כדי לכמת ולהשוות סוגי פרוסטגלנדין ספציפיים בין חיות בר מסוג והמוטציה. פירוק מושרה מהתנגשות או MS / MS יכול לשמש כדי לקבל מידע על תכונות מבניות חשובות. כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה (LC-MS) סריקות סקר של טווח מסה שנבחר, כגון מ &#39;/ z 315-360 ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים הגלובליים ברמות פרוסטגלנדין. אנו מספקים דוגמאות לכל שלושת הניתוחים. שיטות אלה יספקו לחוקרים עם כלים לגילוי eicosanoids רומן והתוויית המסלולים מטבוליים שלהם.

הכנת מדגם בוצעה על ידי שאיבת נוזל נוזל מותאמת Golovko ומרפי 17. היא סיפק התאוששות מצוינת של התקן הפנימי (PGF 2α-D4). התכנית הכללית להפקת PG מג elegans מוצג באיור 1. תנאים כרומטוגרפי היו מותאמים כדי לספק הפרדה בסיסית של&gt; 30 תקני eicosanoid (טבלה 1 מציגה 13 תקנים). טור הידרו-RP (250 x 2.0 מ&quot;מ id) עם מים ואצטוניטריל המכילים חומצה פורמית 0.1% סיפק את ההפרדה ואת הרגישות הטובה ביותר. סריקות סקר של תמציות מוטציה wild-type ושומן 3 שמוצג ב2 רמות גלובליות מסמכי דמותו של יונים בטווח המסה של 315-360 יחידות מסה אטומיות. שומן 3 (wa22) מוטנטים חסרים PUFAs ביותר של 20 פחמן. כיתת PG F3 מודגשת. באיור 3, ניתוחי MRM של תמצית פראי סוג להראות איזומרים PG מרובים של F1 (איור 3 א </stro<html> ng&gt;), F2 (איור 3), וF3 (האיורים 3C ו3D) כיתות. כיתת F3 יכולה להיות מזוהות עם אחד משני מעברים המוניים, מ &#39;/ z 351/193 או מ&#39; / z 351/191. CePGF2 מורכב בעיקר מenantiomer 2α PGF. CePGF1 צפוי להיות PGF 1α או enantiomer. איור 4 מראה את הפירוק מושרה התנגשות של CePGF2 (RT = 11.8), בהשוואה לPGF2 α הסטנדרטי (RT = 11.8). הבדלים קלים ביוני המוצר צפויים בשל שפע CePGF2 נמוך ותרכובות שיתוף משחררי בתמצית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> איור 1. תרשים סכמטי של ג elegans PGs חילוץ וניתוחי LC-MS. שים לב שאצטון / מלוח וכלורופורם יש גם BHT 0.005% כדי למזער את חמצון שומנים בדם. מתייחס לטקסט לקבלת פרטים נוספים.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <img alt="איור 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> איור 2. סריקות סקר מ &#39;/ z 315-360 של תמציות מוטציה wild-type ושומן 3 (wa22). זמן שמירת כרומטוגרפיה נוזלי (RT) מוצגת בלוח []. יונים שחולצו ב RT = 11.3 מוצגים לטבע מסוג [b] ושומן 3 (wa22) ג [] תמציות. כיתת PG F3 עם מסת m / z 351 מודגשת. CPS, ספירות / sec; האמו, יחידת מסה אטומית. <img alt="איור 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> תאנהיור 3. ניתוחי MRM של תמציות wild-type. PGS כיתת F1 מזוהים עם מעבר המוני מ &#39;/ z 355/311 [א]. שים לב שמספר תרכובות הידרופוביות (RT&gt; 14 דק &#39;), שאינן צפויים להיות PGs, גם מזוהות עם המעבר הזה. PGs כיתת F2 מזוהים עם מעבר המוני מ &#39;/ z 353/193 [ב&#39;]. PGs כיתת F3 מזוהים גם עם מעבר המוני מ &#39;/ z 351/193 [ג] או מ&#39; / z 351/191 [ד]. שים לב שהתמציות מכילות איזומרים PG מרובים של כל כיתה. מספרים מתאים לPGs מוצג בטבלה 2. הריכוז של CePGF2 הוא 1.8 ng / ml. RT, זמן שמירה; CPS, ספירות / sec. <img alt="איור 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> איור 4. פירוק מושרה מהתנגשות של סינטיסייזר כימיesized PGF 2α וCePGF2. חיצים בפנל [] מצביע יוני מוצר או פיצול משותף בין PGF 2α וCePGF2 (RT = 11.8). את יוני המוצר במ &#39;/ z 309 ו&#39;/ z 193 נוצרים מביקוע אתרים המצוינים (מסומן A ו-B), המתאימים למבנים שמוצגים, ואופייניים לPGs F-Series [B]. CPS, ספירות / שני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סטנדרטי </td><td> RT (דקות) </td><td> [MH] - מ &#39;/ z </td><td> יוני מוצר עיקריים ב-MS / MS </td></tr><tr><td> 20-הידרוקסי PGE 2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> Thromboxane ב &#39;2 </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> 1 PGF - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoxin B 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> PGD ​​2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271,203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - Lipoxin 4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Leukotriene B 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HpETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> טבלת מס &#39;1. פעמים שייר ויונים מוצרים עיקריים של 13 תקני eicosanoid משיטת LC-MS/MS 3. למעלה מ -30 תקנים שמשו לפיתוח תכנית LC-MS/MS. זמני שמירת chromatographic (RTS) שונים, גם בקרב PGs דומה מאוד. יוצא מן הכלל הוא 2α 1α וPGF PGF. עם זאת, אלה הם PGs דistinguished ידי המוניהם הוריים יון ([MH] - מ &#39;/ z) והתנגשות המושרה ספקטרום פירוק (MS / MS). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כיתת פרוסטגלנדין </td><td> מס באיור 3 </td><td> [MH] - מ &#39;/ z </td><td> יוני מוצר עיקריים ב-MS / MS </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> טבלת 2. יוני מוצר פירוק מושרה מהתנגשות עבור מספר ג הגדול elegans F1, F2, F3 וPGs מוצגים באיור 3. MS / MS של איזומרים פחות שפע אחרים אינם מוצג. נתונים אלה הם מן הניתוחים מרובים וכל יוני המוצר לא יכולים להיות גלויים לעין בטווח נתון. בהתחשב במורכבות של התמציות, יוני מוצר פחות שפע מסוימים יכולים לנבוע מיון הורה אחר עם זמן שמירה דומה או כתוצאה מהפרעה. שיא 2 סביר stereoisomer של CePGF1 והשיא 4 עשוי stereoisomer של CePGF2. ראה אדמונדס, et al. (2010) עבור נתונים נוספים 3.

Watch this Scientific Journal Video about Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

במאמר זה, אנו מתארים הליך אופטימלי להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים ואחרים מeicosanoids<em&gt; ג elegans</em&gt; באמצעות LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

prostaglandin-extraction-and-analysis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

19.4K Views.  University of Alabama at Birmingham. במאמר זה, אנו מתארים הליך אופטימלי להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים ואחרים מeicosanoids ג elegans באמצעות LC-MS/MS.

Video: Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...