אנו מודים EUROSARF ששלח לנו פלסמידים ביטוי השמרים TAP. אנו מודים גם למערכת עזרה מLabadens ריאן. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NINDS (R01NS070962) לCW

1. צור כטב&quot;מ-מתויג TAP זבובים טרנסגניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור pUAST-מתויג TAP בונה DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט באיזה צד (N-או C-סופית) של חלבון פיתיון תג TAP יש התמזגו, המבוסס על המבנה / התפקוד של החלבון. ראה דיון לפרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone אזור קידוד cDNA של הגן של עניין לאתרים המרובים שיבוט (MCS) של וקטורי pUAST-NTAP או pUAST-CTAP ליצור transgenes כטב&quot;מ-TAP N-או C-מסוף מתויג, בהתאמה. ראה איור 1 עבור מפות מפורטות ואתרי הגבלה שמישים ומסגרות קריאה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור כטב&quot;מ-מתויג TAP זבובים מהונדסים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור זבובים מהונדסים הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים באמצעות P-תיווך אלמנט ההחדרה 11. מספר שירותי הזרקה הוא זמינים באופן מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות נהג GAL4 עצבי (כלומר BG380-GAL4) לכל שורה מהונדס בודדת ולקבוע את רמות ביטוי החלבוןכל שורה על ידי כתם מערבי (עם נוגדני Anti-Peroxidase Peroxidase) ו / או immunostaining (עם נוגדן אנטי TAP). באופן כללי, קו מהונדס עם רמת ביטוי חלבון שהוא קרוב לחלבון אנדוגני מומלץ לנהלים ברז. ראה דיון לפרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PerformGAL4/UAS-based ניסויי הצלה כדי לאשר את הפונקציונליות של transgenes מתויג TAP אם מוטציות פסד של פונקציה של גנים של עניין זמינות. בחר transgene שיכול באופן משמעותי להציל את פנוטיפים מוטציה לניסויי TAP הבאים. </li></ol></li></ol> 2. הכן דוגמאות לנוהל TAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מניית זבוב שנושא שני נהג עצבי GAL4 (למשל BG380-Gal4) וtransgene מתויג TAP נבחר על מנת להקל על ההתרחבות של דגימות לטוס. לאסוף progenies F1 של נהג GAL4 וצלב כטב&quot;מ-transgene במקרים נדירים שבם השילוב הנ&quot;ל גורם לחסרון הישרדות וצמיחה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות בקנה מידה קטנות ולייעל את מצב תמוגה לsolubilizing החלבון מתויג TAP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות סדרה של מאגרי תמוגה באמצעות שילוב של חומרי ניקוי nonionic NP-40 (0.1-1%), NaDOC (0.1-1%) וטריטון X-100 (0.05-.5%). ראה טבלת 1 ודיון לקבלת מידע נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גבי משטח CO2, השתמש # 5 מלקחיים לנתח 20 ראשים בוגרים מtransgene TAP להביע זבובים ולאסוף אותם בצינור 1.5 מיליליטר לבדוק כל תנאי מאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ תמוגה בדיקות 100 ul לצינור וhomogenize הראשים ידי מלטף את מעלה ומטה עם העלי פלסטיק, ולאחר מכן להוסיף עוד חיץ בדיקות 100 ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין lysate הראש ב21,500 XG עבור 10 דקות (4 מעלות צלזיוס), ולהפריד את supernatant וגלולה לאחר צנטריפוגה. הוסף 25 חיץ טעינת ul 2x SDS לגלולה וחיץ טעינה 10 ul 4x SDS ל30 ul של supernatant בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים שתי דגימות למשך 5 דקות ולנתח אותם בצד על ידיבצד באמצעות SDS-PAGE ולאחר מכן כתם מערבי עם נוגדן PAP. לקבוע את המסיסות על ידי היחס בין רמות TAP-החלבון בsupernatant לעומת גלולה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם בקנה מידה גדולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב ולאסוף זבובים בוגרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב את מניית neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene בבקבוקים ולהעיף את הבקבוקים כל 3 ימים עד 250 בקבוקים מצטברים משמשים לאיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוגר ישן לאסוף 1-3 ימים עף לתוך 50 צינורות חרוטי מיליליטר, לשים את הצינור בחנקן נוזלי באופן מיידי להקפאה עמוקה את הזבובים. אחסן את הזבובים ב-80 ° C במקפיא. שים לב שהנפח של הזבובים לא יעלה על 2/3 מצינור 50 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ראשים לטוס (לבצע שלב זה על גבי קרח יבש אבקה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מסננות prechilled ומכתש ועלי מ-80 ° C במקפיא ולשים אותם על קרח יבש, באופן אידיאלי בתוך דלי קרח גדול. סטאק שתי הנפות מבחן סטנדרטיות בארה&quot;ב עם מס &#39;25 על העליון דואר ומס &#39;40 בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הזבובים הקפואים החוצה ושחרר אותם בחנקן נוזלי ולשמור על הזבובים שביש ל10 דקות בערך. מערבולת או לנער את הצינורות במרץ כדי לשבור את הראש, ברגליים, וכנפיים מהגופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת למסננת העליונה, ולאחר מכן ללחוץ הנפות נמרצות תוך החזקת שני מסננות יחד. לאחר סינון, הגופים יישארו במסננת העליונה, לעוף ראשים יישמרו על המסננת התחתונה, ורגליים, כנפיים, ופסולת אחרת ייפלו על הקרח היבש. להפריד בין שתי הנפות ובזהירות להעביר את הראשים לטוס מרגמה הקרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ראשי הזבוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גבי קרח יבש, לטחון את הראשים עם המכתש והעלי לחלקיקי אבק, ולאחר מכן להעביר את האבקה למטחנת רקמת Dounce זכוכית מיליליטר 15 שprechilled על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשקל של המטחנה לפני ואחרי דגימת הראש נמזגה לתוכה, ולאחר מכן לחשב כמה samp הראשle שוקל. כולל של 6-15 גרם של ראשי זבוב יהיה מספיק עבור כל ניסוי TAP התאמה בהתאם לרמות הביטוי של החלבון. הוסף 15 מיליליטר של חיץ המגון קר כקרח (מאגר תמוגה מותאם בשלב 2.2) לאבקה ולאחר מכן שבץ עם העלי הסיקול הגדול עד שהוא קל לעלי ללכת למעלה ולמטה. שמור את המטחנה מזכוכית על קרח בכל העת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את supernatant לTAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את homogenate לצינור צנטריפוגות במהירות גבוהה וספין ל20 דקות ב ~ 50,000 XG (4 ° C). מעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות במהירות גבוהה חדש וחזור צנטריפוגה עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור ultracentrifuge ולבצע 40 דקות ~ 250,000 ספין XG כדי לנקות את supernatant נוסף. Supernatant מוכן להליכי טיהור זיקת טנדם לאחר ultracentrifugation. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. טיהור TAP </p&gt; הסעיפים הבאים נגזרו מברז המעבדה Seraphin protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע טיהור זיקת חרוז IgG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חרוז sepharose IgG תוך הדגימות נמצאים centrifuged. שטוף 400 μl 3x חרוז IgG בצינור פלקון 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר חיץ כביסה IgG קר. לכל שטיפה, לטלטל את הצינור בעדינות במשך 2 דקות, ולאחר מכן ספין למטה חרוזים XG ב 1000 לעוד 2 דקות. בסוף לשטוף השלישי, להסיר את החיץ ולהשאיר רק את חרוזים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את supernatant פינה (~ 15 מיליליטר) לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל חרוזים IgG. דגירה חרוזים ותמהיל lysate המוח ב4 º C על nutator במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עמודת מיקרו נקייה וריקה עם -15 מיליליטר נפח כולל בחדר הקר. טען את תערובת חרוז IgG ידי בהתמדה לשפוך את התערובת לתוך הטור; מנסה לא מלכודת כלבועות אוויר בתוך העמודה. לאפשר חרוזים להתיישב בעמודה והחיץ כדי לנקז באיטיות על ידי זרימת כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה ביסודיות עם 10 מיליליטר של חיץ הכביסה IgG הקר אחרי כל lysate המוח זרם דרך עמודת IgG התיישבה. חזור על 2x לשטוף. שים לב: לא לתת יבש חרוז באוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מחשוף TEV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף השלישי, לשטוף את העמודה שוב עם 10 חיץ מחשוף מיליליטר TEV. צעד זה מכין את חרוז IgG שsequestrates מורכב פיתיון למחשוף TEV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממש לפני שהטיפה האחרונה של חיץ TEV עומדת לטפטף החוצה, לשים כובע בחלק התחתון של העמודה כדי לחסום את הזרימה, להוסיף 1.3 חיץ מיליליטר TEV מכיל 130 יחידות של אנזים TEV לעמודה, ולאחר מכן באופן מאובטח מכסה את החלק העליון של העמודה. ודא שהעמודה אטומה היטב בשני הקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העמודה ב18 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 כדי לאפשר לאנזים TEV לדבוק פפטיד באתר TEV ולשחרר WHI החלבון המורכבle השאיר מאחוריו את החלבון פפטיד תחום חייב חרוזים sepharose IgG. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע טיהור זיקת חרוז Calmodulin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חרוזים Calmodulin תוך חרוזים IgG מודגרת עם אנזים TEV. שטוף 200 חרוזים Calmodulin μl ב15 מיליליטר 3x צינור פלקון, בכל פעם עם 10 מיליליטר של Calmodulin הקר מחייב חיץ. לכל שטיפה, נער בעדינות את הצינור למשך 2 דקות על nutator, ולאחר מכן לסובב את חרוזים ב1,000 XG במשך 2 דקות. בסוף לשטוף השלישי, להוציא את כל החיץ ולהשאיר רק את חרוזים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה TEV (צעד 3.2.3), להחזיר את טור IgG חזרה לחדר הקר ולהגדיר ישר אותו. בואו חרוזים להסתפק 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה העליון ולאחר מכן את המכסה התחתון, ולאחר מכן לאסוף את מוצר מחשוף מיליליטר TEV 1.3 בצינור פלקון 15 מיליליטר. בואו החיץ לנקז לחלוטין. הוספת חיץ 200 TEV μl נוסף לעמודה לדחוף את הנפח המת של הטור, לאסוף את fנמוך באותו הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 4.5 מיליליטר של Calmodulin מחייב חיץ ו4.5 μl 1 M CaCl 2 למוצר מחשוף 1.5 מיליליטר TEV נאסף לעיל. CaCl 2 משמש כדי לכיל EDTA במאגר TEV. מעביר את תערובת 6 מיליליטר לשפופרת המכילה חרוזים Calmodulin ולסובב את הצינור ב 4 º C על nutator במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים עוד עמודת מיקרו נקייה וריקה עם כ -10 מיליליטר נפח כולל בחדר הקר. טען את תערובת חרוז Calmodulin לעמודה ולאפשר לו לרוקן על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הפתרון זרם דרך עמודת Calmodulin התיישבה, לשטוף את העמודה שתי פעמים, כל אחד עם 10 מיליליטר של Calmodulin הקר מחייב חיץ. שים לב: לא להפריע חרוזים Calmodulin ולנסות לשמור את פני השטח של חרוזים שטוחים ככל האפשר בזמן הכביסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המורכב פיתיון מעמודת Calmodulin. מייד לאחר כביסה, elute עמודת Calmodulin עם חמישה שברים של 200 μl Calmodu הקרמאגר elution לין. לכל שבר, בעדינות להוסיף 200 μl של חיץ elution לעמודה ולאסוף את eluate עם 1.5 מיליליטר צינור Eppendorf מסומן. חזור על 4x זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את החלבון המורכב ידי-SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot קטן מכל אחד מחמשת שברים (כ 30 μl) ולהוסיף חיץ טעינת SDS. מרתיחים את הדגימות למשך 5 דקות ולטעון את הדגימות Side-by-צד עם סמנים מולקולריים חלבון בשיפוע (4-15%) ג&#39;ל SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות פתרו באופן מלא בג&#39;ל, להפסיק אלקטרופורזה ולהכתים את הג&#39;ל עם כל הליכים המבוססים על ה-G-250 רגישים colloidal Coomassie מכתים כגון &#39;כסף כחול &quot;מכתים 13. צביעת כסף היא אופציונלית, אך לא עדיפה משום שהיא אינה תואמת באופן מלא עם ניתוח ספקטרומטריית מסה שלאחר מכן. אחסן את שאר eluate במקפיא -80 ° C לניתוח נוסף כגון ספקטרומטריית מסה לחשיפת הזהות המולקולרית של החלבון המורכב המטוהרים. Seדיון בדואר. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).</li><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+survey+reveals+modularity+of+the+yeast+cell+machinery.">Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.</a> Nature. 440, 631-636 (2006).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Forler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protein+complex+purification+method+for+functional+proteomics+in+higher+eukaryotes.">An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes.</a> Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).</li><li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+technology:+an+overview.">The tandem affinity purification technology: an overview.</a> Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).</li><li>Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+proteomics:+characterization+of+protein+complexes+using+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+method:+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification.">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bachmann, A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+P-element+transposons+to+generate+transgenic+flies.">The use of P-element transposons to generate transgenic flies.</a> Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+a+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ubiquitin-mediated+pathways+in+regulating+synaptic+development,+axonal+degeneration+and+regeneration:+insights+from+fly+and+worm.">The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm.</a> J. Physiol. , (2013).</li><li>Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction:+spatial,+structural,+and+temporal+requirements.">Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements.</a> J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).</li><li>Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DFsn+collaborates+with+Highwire+to+down-regulate+the+Wallenda/DLK+kinase+and+restrain+synaptic+terminal+growth.">DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth.</a> Neural Dev. 2, 16 (2007).</li><li>Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rae1+controls+the+abundance+of+the+ubiquitin+ligase+Highwire+in+post-mitotic+neurons.">Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).</li><li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).</li><li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+in+Drosophila:+the+advantages+of+the+GS-TAP+system.">Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system.</a> Fly. 2, 229-235 (2008).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+Angelman+syndrome.">A Drosophila model for Angelman syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).</li><li>Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics+in+neuroscience.">Shotgun proteomics in neuroscience.</a> Neuron. 63, 12-26 (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שיטת טיהור זיקת טנדם (TAP) מציעה פרוטוקול טיהור כפול המאפשר בידוד והעשרה של קומפלקסי חלבונים באמצעות שני צעדי טיהור זיקה עצמאיים. העיצוב של תג TAP אינו מוגבל למה שמוצג בפרוטוקול זה, תחומים אחרים חלבון מחייב ומוטיבים חלים גם אם תנאי חיץ מותאמים בהתאם. דוגמא טובה לתגי TAP אח...

הגדרת מסלולים או רשתות המולקולריים שמתווכים תהליך ביולוגי מסוים היא אחת המטרות האולטימטיבית של מחקר ביו. גנטיקאים טוסו הסתמכו רבים על גנטיקה קדימה, במיוחד מתקנים מסכי גנטיים (שניהם משפר והמסכים המדכאים), כדי לזהות גורמים שפועלים יחד, במקביל, או במעלה הזרם או במורד הזרם של גן של עניין. עם זאת, מסכי גנטיקה קדימה לעתים קרובות פעמים לא מצליחים לזהות את הגנים חיוניים אשר, כאשר מוטציה, לגרום הקטלניות בשלבי התפתחות מוקדמים, או גנים עם יתירות פונקציונלית ופיצוי אובדנה של פונקציה היחידה לגרום למומים עדינים שקשה להבקיע. דרך אחת להתגבר על קושי זה היא מסך עבור אינטראקציות בין חלבונים ישירים. במשך יותר מעשור, רשימה הולכת וגדלה של שיטות ביוכימיות, כולל שמרי שני היברידיות, להציג הפאג, cross-linking הכימי, Co-IP, טנדם זיקה טיהור (TAP), וכו &#39;. היה בשימוש כדי לחקור חלבוןחלבון אינטראקציות. כל אחת מהגישות הללו יש סט של נקודות חוזק וחולשה בכל הקשור לרגישות וסגוליות משלו. ביניהם, את שיטת TAP מאפשרת זיהוי של אינטראקציה פיזית בתנאים כמעט פיסיולוגיים, שומרת על ייחוד ועקביות 2 וכוללת את היכולת להרחיב לתפוקה גבוהה ניתוח 3,4. שיטת TAP פותחה בשמרים במקור על ידי עמיתי Rigautand 1. בשיטה זו, חלבון של העניין בא לידי ביטוי עם תג TAP. תג TAP מטפח שני תחומים עצמאיים מחייב זיקה: חלבון תחום שנקשר לנוגדנים ומחייב רישום calmodulin. שני תחומים מופרדים על ידי אתר מחשוף TEV (וירוס Etch טבק). שילוב כזה מאפשר לשני סיבובים עצמאיים של purifications זיקה כדי להפחית במידה מספקת איגודים ספציפיים ולהעשיר איגודים ספציפיים 1. למשל זה, שיטת TAP היא metho חזק מאודד לזהות באינטראקציות vivo של חלבון נתון, אם כי ביתר את חלבון אקסוגני יכול לעשות את זה יותר נוטה לקשר עם חלבונים שעושים בדרך כלל אינו מורכב עם עמיתו אנדוגני שלה. מאז הפיתוח שלה, שיטת TAP כבר מיושמת במערכות רבות אחרות, כוללים תאים המבוסס על תרבות מערכות 5,6 ובמערכות מודל vivo אחרות 6-9. כאן אנו מתארים את העיבוד של שיטת TAP בדרוזופילה. אנחנו מייצרים ראשון וקטורי pUAST-NTAP וpUAST-CTAP כדי להקל על שיבוט והיתוך של תג TAP לאו N-או C-המסוף של הגן של עניין. -מתויג TAP כטב&quot;מ transgene לאחר מכן בא לידי ביטוי במערכת העצבים בשליטתו של נהג GAL4 עצבי 10. בשלב הבא, מספר גדול של ראשי זבוב בוגרים ייאסף, שבו יש תכולה גבוהה של תאים עצביים וקלים להיפרד מחלקי גוף אחרים לאחר הקפאה המבוסס על הבדלים בגודל. הראשים הבוגרים ב הומוגני ופינהcentrifugations y הרציף, ואת supernatant כפוף להליך TAP המתואר להלן.

<table><tbody><tr><td>U.S.A. standard test sieve No. 25</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-881-18</td><td></td></tr><tr><td>U.S.A. standard test sieve No. 40</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-881-21</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>IgG sepharose beads</td><td>Pharmacia</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 0.7 cm x 20 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4721</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 0.5 cm x 15 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4716</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin beads</td><td>Stratagene</td><td>214303</td><td></td></tr><tr><td>Coors Mortar and Pestle</td><td>CoorsTek</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protease</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Mix</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

identifying protein-protein interaction in drosophila adult heads by tandem affinity purification (tap)

מסכי גנטיים שנערכו באמצעות דרוזופילה melanogaster (זבוב פירות) יש תגליות אבן דרך רבות בהתקדמות של מדעים ביולוגיים. עם זאת, השימוש במסכים ביוכימי שמטרתה להרחיב את הידע שנצבר מניתוח גנטי שנחקר רק לאחרונה. כאן אנו מתארים שיטה לטיהור החלבון המורכב שמקורביו עם כל חלבון של עניין מראשי זבוב בוגרים. שיטה זו מנצלת את מערכת דרוזופילה Gal4/UAS לבטא חלבון פיתיון התמזגו עם תג טנדם זיקה הטיהור (TAP) בנוירונים זבוב in vivo, ולאחר מכן מיישמת את שני סבבים של טיהור באמצעות הליך TAP דומה לזה שהוקם במקור בשנת שמרי 1 כדי לטהר את החלבון מורכב אינטראקציה. בסופו של הליך זה, תערובת של קומפלקסי חלבונים מרובים מתקבלת אשר מולקולרי זהויות יכולים להיקבע על ידי ספקטרומטריית מסה. אימות של חלבוני המועמד תיהנה מresource וקלות ביצוע מחקרי אובדן של פונקציה בזבובים. ניתן ליישם גישות דומות לרקמות זבוב אחרות. אנו מאמינים כי השילוב של מניפולציות גנטיות וגישת proteomic זה במערכת מודל זבוב בעל פוטנציאל אדיר להתמודדות עם בעיות יסוד בתחום הנוירוביולוגיה ומעבר.

כאן אנו מדגימים המאמץ שלנו בזיהוי חלבוני Highwire-אינטראקציה במוח הזבוב. Highwire (hiw) וhomologues החוליות וחסרי חוליות שלה הם ligases היוביקוויטין ענק המווסתים את ההתפתחות ותיקון של מערכת העצבים 14. הם חולקים מספר תחומים פונקציונליים השמורים ביותר. עם זאת, הפעולות מולקולריות ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP at JoVE.com

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

identifying-protein-protein-interaction-drosophila-adult-heads-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

13.8K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center.  דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר. 

Video: Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Biochemistry

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Developmental Biology

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

זיהוי של<em&gt; באתר</em&gt; מכלולי חלבון-חלבון ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Neuroscience

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Source: Ma, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55236">Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates tandem affinity purification &#8212; a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Source: Ma, Z., et al. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates tandem ...

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video