Name: tandem affinity purification of protein complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iv&#225;n D'Orso.

1. תאי ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני transfection, צלחת 3.5 x 10 6 תאים HEK293T ב 10 מ&quot;ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית (FBS) ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יח &#39;/ מ&quot;ל ​​המניות) לכל צלחת 100 מ&quot;מ. פלייט 3 - 5 100 מנות מ&quot;מ לכל ניסוי / מצב כדי להבטיח התאוששות מספיק חלבון. הערה: מספר הצלחות יש לקבוע עבור כל ניסוי / מצב, אשר יסתמך על רמות הביטוי המסיס של מתחם החלבון של עניין. לחלופין, אם טיהור בקנה מידה גדול יותר יש צורך, שורות תאים ניתן להתאים לגדול השעיות צלוחיות טווה 2, אך שיטה זו לא תעבוד עבור transfections חולף. </li></ol> 2. Transfecting תאים או גרימת שורות תאים יציבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. התאים חייבים להיות 70 - 80% ומחוברות לפני proceeding. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים עם תערובת הכוללת 7 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד ו -21 μl של מגיב transfection לכל צלחת 100 מ&quot;מ. תאים Transfect עם GFP להביע וקטור (טבלה 1) כביקורת על יעילות transfection. הערה: אם אתה משתמש HEK293-T-Rex או שורת תאים יציבה דומה התופעה אשר עלול לגרום הביטוי של שתיים או יותר מורכבי יחידות משנה בתגובת דוקסיציקלין 14, 15, inducer יצטרך להתווסף התאים וטופח במשך 48 שעות. בדומה לכך, שורת תאים יציבה תופעה אשר עלולה לגרום ביטוי GFP על תוספת של inducer יהיה דרוש גם ולאמת אותם. עבור לשלב 2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת transfection לכל צלחת 100 מ&quot;מ. בתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge, לערבב 500 μl של DMEM unsupplemented עם 7 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד הכולל (המקביל ל שניים או יותר פלסמידים). בתוך צינור microcentrifuge נפרד, לערבב 500 μl של wi unsupplemented DMEM21 μl ה של מגיב transfection. חזור על הפעולה עבור כל תגובה transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הפתרון מגיב transfection לתוך פתרון ה- DNA פלסמיד (לא לערבב פתרונות בסדר הפוך). מערבבים על ידי pipetting לפחות 4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 - 15 דקות, אך לא יותר מ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את הצלחת ליצור מאגר תקשורת ובזהירות פיפטה תערובת transfection ירידה מבחינת על הצד הפנימי של הצלחת מבלי להפריע את התאים. מחזירים את המנה למצב שטוח המקורי ו מערבולת בעדינות כדי לפזר את התערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאי humidified עם 2 5% CO (תנאי זה להלן המכונה &quot;חממה בתרבית רקמה&quot;). החזר את שלאחר transfection hr תקשורת 5 (אופציונאלי). </li></ol> 3. Transfection סימון או יעילות אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 24 שעות שלאחר transfection, לדמיין את התאים תחת שפעתמיקרוסקופ orescent כדי לבדוק יעילות transfection (או אינדוקציה של שורת תאים יציבים השליטה HEK293T-REX להביע GFP). דגירה של 24 שעות אחרות. </li></ol> 4. סטרפטוקוקוס טיהור זיקה (סטרפטוקוקוס AP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 שעות שלאחר transfection, להסיר את המדיה ולהוסיף 8 מ&quot;ל של 1x קר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק תאים מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ&quot;ל ומסובב את התאים למטה ב 800 XG במשך 4 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant PBS. חזור על ספין למטה (800 XG דקות 1 ב 4 ° C) כדי לחסל כל PBS שיורית. אחסן את התא גלולה ב -80 ° C לשימוש עתידי או פעל לפי הנוהל שלהלן כדי להמשיך טיהור חלבונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysing התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי התא באמצעות 5 × נפח תא גלולה (~ 250 μl לכל צלחת) של הצפת תמוגה פסיבי(PLB: 20 mM Tris-HCl 7.5 pH, 150 מ&quot;מ NaCl, 1.5 מ&quot;מ 2 MgCl, 1 מ&quot;מ DTT, לוח קוקטייל מעכב פרוטאז, 5% v / גליצרול נ, ו -1.0% NP-40) ולהעביר את ההשעיה התא 1.5 מ&quot;ל צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת ההשעיה nutate למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה השעית תא XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את lysates המסיס לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש וזורק כדורי התא. חסוך 10% של הנפח הסופי של lysate המסיס כמו &quot;קלט AP סטרפטוקוקוס.&quot; חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Equilibrating חרוזי סטרפטוקוקוס הערה: השתמש סטרפטוקוקוס חרוזים עבור שלב AP הראשון! המכלולים הורידו עם חרוזי סטרפטוקוקוס לשחזר חלבון גבוה יותר מאשר אלו משכו מטה עם חרוזי FLAG. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא (n × 40 μl) + n μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °. הערה: השתמש רחב-מ &#39;טיפים outhed חרוזים פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של PLB על חרוזים. Nutate התערובת חרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. Resuspend את החרוזים PLB לנפח סופי של n × 40 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס לטעום כל lysate התא nutate עבור שעה 2 ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרפטוקוקוס AP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה פתרון ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant וחנות בשם &quot;סטרפטוקוקוס AP זרימת הדרך (FT)&quot; על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של סטרפטוקוקוס AP הצפת לשטוף לי (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 מ&quot;מ NaCl, 1.5 מ&quot;מ 2 MgCl, 1 מ&quot;מ DTT, גליצרול 5% ו -0.2% NP-40) על חרוזים. Nutate התערובת חרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °. בטל supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף. <br/&gt; הערה: לפני בכביסה הרביעית, להעביר את הפתרון החרוז לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש כדי להפחית את רקע החלבון. צעד זה חיוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl לשטוף הצפת השנייה (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ&quot;מ NaCl, ו 1 mM EDTA) לאזן את החרוזים על ידי היפוך הצינורות. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבון של עניין עם 50 μl של סטרפטוקוקוס הצפת elution (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA, ו -2.5 מ&quot;מ Desthiobiotin). וורטקס ב 800 סל&quot;ד במשך 15 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים ב 1500 XG במשך 1 דקות ב 4 ° C. איסוף supernatant. חלק זה תואם המדגם &quot;סטרפטוקוקוס AP Elution&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החלק יחסי חרוז על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופת elution שני, אשר יכול להניב עד מחצית כמות החלבון שהושגה עם elution הראשון. Aliquot 10% של סטרפטוקוקוס AP Elution עבור צביעת כסף ו / או המערבי סופג16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Equilibrating חרוזי FLAG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא (NX 16 μl) + n μl של פתרון חרוזים FLAG (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °. הערה: השתמש בעצות פעורות פה חרוז פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 500 μL של חיץ לשטוף FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.1% NP-40) על חרוזים. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. חזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים חיץ לשטוף FLAG לנפח סופי של μl 16 NX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 16 μl של slurry חרוז הדגל elution סטרפטוקוקוס AP הנותרים ולינה nutate על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה השעית חרוזי FLAG ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant וחנות בשם &quot;הדגל IP הזרימה דרך&quot; (FT) בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 50081; l של חיץ FLAG לשטוף לפתרון. Nutate במשך 5 דקות ב 4 ° C ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף ולהסיר את supernatant לאחר כל שטיפה. הערה: לפני בכביסה הרביעית, להעביר את פתרון חלבון-חרוז לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש כדי להפחית את הרקע. צעד זה חיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מן הסיבוב האחרון ולהוסיף 30 μL של חיץ לשטוף FLAG המכיל 200 ng / μl של פפטיד FLAG לתוך חרוזים. וורטקס ב 800 סל&quot;ד במשך שעה 2 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ההשעיה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. קציר supernatant וחנות ב 4 ° C כמו &quot;FLAG IP Elution.&quot; הערה: דגימות elution יכולות להיות מאושרות על ידי כתם כסף ו / או כתם מערבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 16, והם מוכנים מבחני חלבון נוספים. בעת הגדרת כתם מערבי, להפעיל את כל הדגימות הבאות: (1) קלט AP סטרפטוקוקוס, (2) סטרפטוקוקוס AP FT, (3) סטרפטוקוקוס AP Elutiעל, (4) דגל IP FT, ו (5) דגל IP Elution. כרכים הטעונים יצטרכו להיקבע עבור כל ניסוי. כל הדגימות וחרוזים שנאספו ניתן לאחסן ב 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. דגימות TAP יכולות להיות מנותחות על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לאמת את הזהות ומרכיביהן, לזהות שינויים שלאחר translational רומן (PTMs), ו / או לגלות כל אינטראקצית חלבון רומן עם המורכבות המטוהרות 2, 17. לשם כך, אחרי ריצת כתם ג&#39;ל או כסף coomassie, להקות ניתן ניכרו מן ג&#39;ל באמצעות אזמל נקי. ביקורות מצוינות כמה דנים בשיטות ספקטרומטריית מסה פורסמו בעבר 18, 19. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-based+prediction+of+protein+function.">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li><li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes.">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li><li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+two-hybrid+system:+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system.">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li><li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coimmunoprecipitation+assay.">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes.">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li><li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-TEFb,+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II.">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li><li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb.">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li><li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation.">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).</li><li>D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=7SKiing+on+chromatin:+move+globally,+act+locally.">7SKiing on chromatin: move globally, act locally.</a> RNA Biol. 13, 545-553 (2016).</li><li>McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex:+Releasing+the+Pause.">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li><li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+repressor,+tetR,+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives,+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells.">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II.">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).</li><li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline.">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li><li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics.">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li><li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology.">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li><li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins:+the+PEST+hypothesis.">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המתואר כאן לביטוי והבידוד של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים אינו מוגבל באפיון ביוכימי של מכלולים מולקולריים כזה, אבל יכול גם להיות מנוצל לצורך זיהוי של interactors רומן שלאחר translational שינויים שיכולים לווסת את תפקידם. הניצול של תגי קרבה אינו מוגבל למה מוזכר בפ...

<html> אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן קריטיות להסדרה המדויקת של תהליכים ביולוגיים 1, ומחקרים נוספים על PPIs אלה יכולים להודיע על תפקידם 2. גישות כמה כבר המציאו לחקר ואפיון של PPI כמו גם לזיהוי דה נובו של רכיבי חלבון הרגולציה הרומן. בשנת 1989, סטנלי פילדס ועמיתיו דיווחו על השנייה היברידי השמרים (Y2H) assay 3. גישה זו מאפשרת זיהוי המשוחדת ומקיפה של interactors (פושט) עבור חלבון מוגדר של עניין (פיתיון) ב שמר אפייה. בנוסף השירות המדהים שלה לגילוי PPIs, assay Y2H יכול לשמש לאפיון זוגות חלבון בתאי שמרים, הגדרה מינימאלי תחומי אינטראקציה, וזיהוי מוטציות לבטל אינטראקציות כאלה. על ידי שינוי assay Y2H, PPIs יכול להיות גם למד בתאי יונקיםclass = &quot;Xref&quot;&gt; 4. וריאציות של assay Y2H (למשל, מערכת תלת-היברידית שמרים) יכול להיות מיושם גם ללמוד חלבון-רנ&quot;א אינטראקציות ליגנד אורגני-קטן חלבונים בתאים. כלי נוסף נפוץ ללמוד PPIs במערכת הומולוגית הוא immunoprecipitation שיתוף (שיתוף IP) assay 5. באמצעות נוגדן כדי immunoprecipitate חלבון של עניין, assay שיתוף IP מאפשר לחוקרים לעקוב אחר PPIs בתאים עבור תנאים סביבתיים שונים ומצבים ניסיוניים. השימוש-tagged חלבונים epitope (למשל, דגל, Myc, סטרפטוקוקוס, ו HA, בין היתר) טיהור זיקה (AP) שיטות יש להקל את הבידוד של חלבונים מתערובות חלבון מורכב במשך כמה מבחני במורד הזרם, כולל כתם המערבי, כתם כסף , וניתוח האנזימטית. עם זאת, אף אחד הגישות הקודמות אלה מאפשרים הבידוד של כמויות גדולות של קומפלקסי חלבונים עבור אפיון נוסף כולל במבחנהssays, גילוי יחידות משנת רגולציה על ידי ספקטרומטריית מסה, וזיהוי שלאחר translational שינויים. גרסה משופרת של שיטת AP נקראת טנדם AP (TAP), שהיא טכניקת טיהור ללימוד PPIs על ידי יצירת חלבון היתוך עם שני אפיטופים כי הוא מטוהר באמצעות שתי נקודות גישה עוקבות 6, 7. במאמר זה, אנו מציגים וריאציה של שיטת TAP עבור קומפלקסי חלבוני טיהור שבו שתי תת יחידות מתויגות עם אפיטופים שונים וטהרו מכן דרך שתי נקודות גישה סדרתית (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAG IP). אנחנו ראשונים לספק סקירה מינימליסטי של TAP (איור 1) ולאחר מכן תיאור מפורט של כל שלבי הניסוי (איור 2), כך חוקרים יכולים ליישם אותם על מורכבות עניין החלבון שלהם. כדי להדגים את תחולתה של שיטת TAP, בחרנו היטב מאופיין cyclin-CDK מורכב (המכונה PTEFB קינאז), אשר מורכב של T1 cyclin למקטע רגולטוריות (CycT1) ו קינאז (CDK9), והוא מעורב בוויסות שעתוק על ידי RNA פולימראז II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb phosphorylates תחום מסוף-C של Pol II וגורם ההתארכות השלילית הקשורות אליו, ובכך יקל שהשהיה תעתיק בבית האמרגן ובכך מקלת התארכות שעתוק 11, 12, 13. עם אינטראקציה ידועה זה בחשבון, סטרפטוקוקוס-מתויג CycT1 ו CDK9 מתויג FLAG היה מעל לידי ביטוי בתאי HEK293T. ניסוי TAP גומלין בוצע עם FLAG-מתויג CDK9 ו מתויג סטרפטוקוקוס CycT1 לאמת נוסף שאינטראקצית החלבון היא עצמאית של אפיטופים מנוצלים. תאים נאספו lysed 48 transfection שעות שלאחר. את lysate המסיס היה מטוהר על ידי TAP (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAGIP). קלט חלבונים מטוהרים נותחו על ידי כתם המערבי כתם כסף (איור 3).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>STREP-tag elution buffer</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm &amp;times; 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>48 hole micro tube foam rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Labquake shaker rotisserie&amp;nbsp;</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>415110</td><td></td></tr></tbody></table>

tandem affinity purification of protein complexes from eukaryotic cells

טיהור חלבונים פעילים ומכלולים חומצות גרעין חלבון חיוני לאפיון של פעילות אנזימטית ו דה נובו זיהוי של יחידות משנה רומן שלאחר translational שינויים. מערכות בקטריאלי לאפשר ביטוי וטיהור של מגוון רחב של פוליפפטידים יחיד קומפלקסי חלבונים. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת טיהור של יחידות משנה חלבון המכילים שלאחר translational שינויים (למשל, זירחון acetylation), ואת ההזדהות של יחידות משנה הרגולציה רומן כי הם רק בהווה / הביעו במערכת איקריוטיים. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של רומן, חזק, וטיהור זיקת טנדם יעילה (TAP) שיטה באמצעות STREP- וחלבונים מתויג FLAG המאפשר הטיהור של קומפלקסי חלבונים עם זמני או ביציבות הביע-tagged חלבוני epitope מתאי איקריוטיים. ניתן ליישם פרוטוקול זה לאפיין protein פונקציונליות מורכבות, לגלות שלאחר translational שינויים על יחידות משנה מורכבות, ולזהות רכיבים מורכבים רגולטוריות רומן על ידי ספקטרומטריית מסה. יש לציין, שיטת TAP זה ניתן להחיל ללמוד קומפלקסי חלבונים שהוקמו על ידי איקריוטיים או פתוגניים (נגיפיים וחיידקיים) רכיבים, ובכך מניב מגוון רחב של הזדמנויות ניסיון במורד זרם. אנו מציעים כי חוקרי עובדים עם קומפלקסי חלבונים יכולים לנצל גישה זו בדרכים רבות ושונות.

במאמר זה, אנחנו מדגימים את תחולתה של שיטת TAP למתחם CycT1-CDK9 היטב מאופיין (הידוע גם בשם קינאז P-TEFb). פלסמידים קידוד Cyclin T1-סטרפטוקוקוס (CycT1: S) ו-FLAG CDK9 (CDK9: F), או CDK9-סטרפטוקוקוס (CDK9: S) ו Cyclin T1-FLAG (CycT1: F) (טב...

Watch this Scientific Journal Video about Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

tandem-affinity-purification-protein-complexes-from-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.9K Views.  The University of Texas Southwestern Medical Center. We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Video: Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Biology

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Source: Ma, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55236">Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates tandem affinity purification &#8212; a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Source: Ma, Z., et al. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates tandem ...

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video