אנו מודים EUROSARF ששלח לנו פלסמידים ביטוי השמרים TAP. אנו מודים גם למערכת עזרה מLabadens ריאן. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NINDS (R01NS070962) לCW

1. צור כטב&quot;מ-מתויג TAP זבובים טרנסגניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור pUAST-מתויג TAP בונה DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט באיזה צד (N-או C-סופית) של חלבון פיתיון תג TAP יש התמזגו, המבוסס על המבנה / התפקוד של החלבון. ראה דיון לפרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone אזור קידוד cDNA של הגן של עניין לאתרים המרובים שיבוט (MCS) של וקטורי pUAST-NTAP או pUAST-CTAP ליצור transgenes כטב&quot;מ-TAP N-או C-מסוף מתויג, בהתאמה. ראה איור 1 עבור מפות מפורטות ואתרי הגבלה שמישים ומסגרות קריאה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור כטב&quot;מ-מתויג TAP זבובים מהונדסים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור זבובים מהונדסים הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים באמצעות P-תיווך אלמנט ההחדרה 11. מספר שירותי הזרקה הוא זמינים באופן מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות נהג GAL4 עצבי (כלומר BG380-GAL4) לכל שורה מהונדס בודדת ולקבוע את רמות ביטוי החלבוןכל שורה על ידי כתם מערבי (עם נוגדני Anti-Peroxidase Peroxidase) ו / או immunostaining (עם נוגדן אנטי TAP). באופן כללי, קו מהונדס עם רמת ביטוי חלבון שהוא קרוב לחלבון אנדוגני מומלץ לנהלים ברז. ראה דיון לפרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PerformGAL4/UAS-based ניסויי הצלה כדי לאשר את הפונקציונליות של transgenes מתויג TAP אם מוטציות פסד של פונקציה של גנים של עניין זמינות. בחר transgene שיכול באופן משמעותי להציל את פנוטיפים מוטציה לניסויי TAP הבאים. </li></ol></li></ol> 2. הכן דוגמאות לנוהל TAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מניית זבוב שנושא שני נהג עצבי GAL4 (למשל BG380-Gal4) וtransgene מתויג TAP נבחר על מנת להקל על ההתרחבות של דגימות לטוס. לאסוף progenies F1 של נהג GAL4 וצלב כטב&quot;מ-transgene במקרים נדירים שבם השילוב הנ&quot;ל גורם לחסרון הישרדות וצמיחה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות בקנה מידה קטנות ולייעל את מצב תמוגה לsolubilizing החלבון מתויג TAP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות סדרה של מאגרי תמוגה באמצעות שילוב של חומרי ניקוי nonionic NP-40 (0.1-1%), NaDOC (0.1-1%) וטריטון X-100 (0.05-.5%). ראה טבלת 1 ודיון לקבלת מידע נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גבי משטח CO2, השתמש # 5 מלקחיים לנתח 20 ראשים בוגרים מtransgene TAP להביע זבובים ולאסוף אותם בצינור 1.5 מיליליטר לבדוק כל תנאי מאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ תמוגה בדיקות 100 ul לצינור וhomogenize הראשים ידי מלטף את מעלה ומטה עם העלי פלסטיק, ולאחר מכן להוסיף עוד חיץ בדיקות 100 ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין lysate הראש ב21,500 XG עבור 10 דקות (4 מעלות צלזיוס), ולהפריד את supernatant וגלולה לאחר צנטריפוגה. הוסף 25 חיץ טעינת ul 2x SDS לגלולה וחיץ טעינה 10 ul 4x SDS ל30 ul של supernatant בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים שתי דגימות למשך 5 דקות ולנתח אותם בצד על ידיבצד באמצעות SDS-PAGE ולאחר מכן כתם מערבי עם נוגדן PAP. לקבוע את המסיסות על ידי היחס בין רמות TAP-החלבון בsupernatant לעומת גלולה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם בקנה מידה גדולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב ולאסוף זבובים בוגרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב את מניית neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene בבקבוקים ולהעיף את הבקבוקים כל 3 ימים עד 250 בקבוקים מצטברים משמשים לאיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוגר ישן לאסוף 1-3 ימים עף לתוך 50 צינורות חרוטי מיליליטר, לשים את הצינור בחנקן נוזלי באופן מיידי להקפאה עמוקה את הזבובים. אחסן את הזבובים ב-80 ° C במקפיא. שים לב שהנפח של הזבובים לא יעלה על 2/3 מצינור 50 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ראשים לטוס (לבצע שלב זה על גבי קרח יבש אבקה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מסננות prechilled ומכתש ועלי מ-80 ° C במקפיא ולשים אותם על קרח יבש, באופן אידיאלי בתוך דלי קרח גדול. סטאק שתי הנפות מבחן סטנדרטיות בארה&quot;ב עם מס &#39;25 על העליון דואר ומס &#39;40 בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הזבובים הקפואים החוצה ושחרר אותם בחנקן נוזלי ולשמור על הזבובים שביש ל10 דקות בערך. מערבולת או לנער את הצינורות במרץ כדי לשבור את הראש, ברגליים, וכנפיים מהגופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת למסננת העליונה, ולאחר מכן ללחוץ הנפות נמרצות תוך החזקת שני מסננות יחד. לאחר סינון, הגופים יישארו במסננת העליונה, לעוף ראשים יישמרו על המסננת התחתונה, ורגליים, כנפיים, ופסולת אחרת ייפלו על הקרח היבש. להפריד בין שתי הנפות ובזהירות להעביר את הראשים לטוס מרגמה הקרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ראשי הזבוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גבי קרח יבש, לטחון את הראשים עם המכתש והעלי לחלקיקי אבק, ולאחר מכן להעביר את האבקה למטחנת רקמת Dounce זכוכית מיליליטר 15 שprechilled על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשקל של המטחנה לפני ואחרי דגימת הראש נמזגה לתוכה, ולאחר מכן לחשב כמה samp הראשle שוקל. כולל של 6-15 גרם של ראשי זבוב יהיה מספיק עבור כל ניסוי TAP התאמה בהתאם לרמות הביטוי של החלבון. הוסף 15 מיליליטר של חיץ המגון קר כקרח (מאגר תמוגה מותאם בשלב 2.2) לאבקה ולאחר מכן שבץ עם העלי הסיקול הגדול עד שהוא קל לעלי ללכת למעלה ולמטה. שמור את המטחנה מזכוכית על קרח בכל העת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את supernatant לTAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את homogenate לצינור צנטריפוגות במהירות גבוהה וספין ל20 דקות ב ~ 50,000 XG (4 ° C). מעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות במהירות גבוהה חדש וחזור צנטריפוגה עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור ultracentrifuge ולבצע 40 דקות ~ 250,000 ספין XG כדי לנקות את supernatant נוסף. Supernatant מוכן להליכי טיהור זיקת טנדם לאחר ultracentrifugation. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. טיהור TAP </p&gt; הסעיפים הבאים נגזרו מברז המעבדה Seraphin protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע טיהור זיקת חרוז IgG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חרוז sepharose IgG תוך הדגימות נמצאים centrifuged. שטוף 400 μl 3x חרוז IgG בצינור פלקון 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר חיץ כביסה IgG קר. לכל שטיפה, לטלטל את הצינור בעדינות במשך 2 דקות, ולאחר מכן ספין למטה חרוזים XG ב 1000 לעוד 2 דקות. בסוף לשטוף השלישי, להסיר את החיץ ולהשאיר רק את חרוזים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את supernatant פינה (~ 15 מיליליטר) לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל חרוזים IgG. דגירה חרוזים ותמהיל lysate המוח ב4 º C על nutator במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עמודת מיקרו נקייה וריקה עם -15 מיליליטר נפח כולל בחדר הקר. טען את תערובת חרוז IgG ידי בהתמדה לשפוך את התערובת לתוך הטור; מנסה לא מלכודת כלבועות אוויר בתוך העמודה. לאפשר חרוזים להתיישב בעמודה והחיץ כדי לנקז באיטיות על ידי זרימת כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה ביסודיות עם 10 מיליליטר של חיץ הכביסה IgG הקר אחרי כל lysate המוח זרם דרך עמודת IgG התיישבה. חזור על 2x לשטוף. שים לב: לא לתת יבש חרוז באוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מחשוף TEV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף השלישי, לשטוף את העמודה שוב עם 10 חיץ מחשוף מיליליטר TEV. צעד זה מכין את חרוז IgG שsequestrates מורכב פיתיון למחשוף TEV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממש לפני שהטיפה האחרונה של חיץ TEV עומדת לטפטף החוצה, לשים כובע בחלק התחתון של העמודה כדי לחסום את הזרימה, להוסיף 1.3 חיץ מיליליטר TEV מכיל 130 יחידות של אנזים TEV לעמודה, ולאחר מכן באופן מאובטח מכסה את החלק העליון של העמודה. ודא שהעמודה אטומה היטב בשני הקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העמודה ב18 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 כדי לאפשר לאנזים TEV לדבוק פפטיד באתר TEV ולשחרר WHI החלבון המורכבle השאיר מאחוריו את החלבון פפטיד תחום חייב חרוזים sepharose IgG. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע טיהור זיקת חרוז Calmodulin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חרוזים Calmodulin תוך חרוזים IgG מודגרת עם אנזים TEV. שטוף 200 חרוזים Calmodulin μl ב15 מיליליטר 3x צינור פלקון, בכל פעם עם 10 מיליליטר של Calmodulin הקר מחייב חיץ. לכל שטיפה, נער בעדינות את הצינור למשך 2 דקות על nutator, ולאחר מכן לסובב את חרוזים ב1,000 XG במשך 2 דקות. בסוף לשטוף השלישי, להוציא את כל החיץ ולהשאיר רק את חרוזים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה TEV (צעד 3.2.3), להחזיר את טור IgG חזרה לחדר הקר ולהגדיר ישר אותו. בואו חרוזים להסתפק 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה העליון ולאחר מכן את המכסה התחתון, ולאחר מכן לאסוף את מוצר מחשוף מיליליטר TEV 1.3 בצינור פלקון 15 מיליליטר. בואו החיץ לנקז לחלוטין. הוספת חיץ 200 TEV μl נוסף לעמודה לדחוף את הנפח המת של הטור, לאסוף את fנמוך באותו הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 4.5 מיליליטר של Calmodulin מחייב חיץ ו4.5 μl 1 M CaCl 2 למוצר מחשוף 1.5 מיליליטר TEV נאסף לעיל. CaCl 2 משמש כדי לכיל EDTA במאגר TEV. מעביר את תערובת 6 מיליליטר לשפופרת המכילה חרוזים Calmodulin ולסובב את הצינור ב 4 º C על nutator במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים עוד עמודת מיקרו נקייה וריקה עם כ -10 מיליליטר נפח כולל בחדר הקר. טען את תערובת חרוז Calmodulin לעמודה ולאפשר לו לרוקן על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הפתרון זרם דרך עמודת Calmodulin התיישבה, לשטוף את העמודה שתי פעמים, כל אחד עם 10 מיליליטר של Calmodulin הקר מחייב חיץ. שים לב: לא להפריע חרוזים Calmodulin ולנסות לשמור את פני השטח של חרוזים שטוחים ככל האפשר בזמן הכביסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המורכב פיתיון מעמודת Calmodulin. מייד לאחר כביסה, elute עמודת Calmodulin עם חמישה שברים של 200 μl Calmodu הקרמאגר elution לין. לכל שבר, בעדינות להוסיף 200 μl של חיץ elution לעמודה ולאסוף את eluate עם 1.5 מיליליטר צינור Eppendorf מסומן. חזור על 4x זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את החלבון המורכב ידי-SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot קטן מכל אחד מחמשת שברים (כ 30 μl) ולהוסיף חיץ טעינת SDS. מרתיחים את הדגימות למשך 5 דקות ולטעון את הדגימות Side-by-צד עם סמנים מולקולריים חלבון בשיפוע (4-15%) ג&#39;ל SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות פתרו באופן מלא בג&#39;ל, להפסיק אלקטרופורזה ולהכתים את הג&#39;ל עם כל הליכים המבוססים על ה-G-250 רגישים colloidal Coomassie מכתים כגון &#39;כסף כחול &quot;מכתים 13. צביעת כסף היא אופציונלית, אך לא עדיפה משום שהיא אינה תואמת באופן מלא עם ניתוח ספקטרומטריית מסה שלאחר מכן. אחסן את שאר eluate במקפיא -80 ° C לניתוח נוסף כגון ספקטרומטריית מסה לחשיפת הזהות המולקולרית של החלבון המורכב המטוהרים. Seדיון בדואר. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).</li><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+survey+reveals+modularity+of+the+yeast+cell+machinery.">Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.</a> Nature. 440, 631-636 (2006).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Forler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protein+complex+purification+method+for+functional+proteomics+in+higher+eukaryotes.">An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes.</a> Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).</li><li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+technology:+an+overview.">The tandem affinity purification technology: an overview.</a> Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).</li><li>Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+proteomics:+characterization+of+protein+complexes+using+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+method:+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification.">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bachmann, A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+P-element+transposons+to+generate+transgenic+flies.">The use of P-element transposons to generate transgenic flies.</a> Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+a+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ubiquitin-mediated+pathways+in+regulating+synaptic+development,+axonal+degeneration+and+regeneration:+insights+from+fly+and+worm.">The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm.</a> J. Physiol. , (2013).</li><li>Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction:+spatial,+structural,+and+temporal+requirements.">Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements.</a> J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).</li><li>Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DFsn+collaborates+with+Highwire+to+down-regulate+the+Wallenda/DLK+kinase+and+restrain+synaptic+terminal+growth.">DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth.</a> Neural Dev. 2, 16 (2007).</li><li>Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rae1+controls+the+abundance+of+the+ubiquitin+ligase+Highwire+in+post-mitotic+neurons.">Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).</li><li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).</li><li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+in+Drosophila:+the+advantages+of+the+GS-TAP+system.">Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system.</a> Fly. 2, 229-235 (2008).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+Angelman+syndrome.">A Drosophila model for Angelman syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).</li><li>Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics+in+neuroscience.">Shotgun proteomics in neuroscience.</a> Neuron. 63, 12-26 (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שיטת טיהור זיקת טנדם (TAP) מציעה פרוטוקול טיהור כפול המאפשר בידוד והעשרה של קומפלקסי חלבונים באמצעות שני צעדי טיהור זיקה עצמאיים. העיצוב של תג TAP אינו מוגבל למה שמוצג בפרוטוקול זה, תחומים אחרים חלבון מחייב ומוטיבים חלים גם אם תנאי חיץ מותאמים בהתאם. דוגמא טובה לתגי TAP אח...

הגדרת מסלולים או רשתות המולקולריים שמתווכים תהליך ביולוגי מסוים היא אחת המטרות האולטימטיבית של מחקר ביו. גנטיקאים טוסו הסתמכו רבים על גנטיקה קדימה, במיוחד מתקנים מסכי גנטיים (שניהם משפר והמסכים המדכאים), כדי לזהות גורמים שפועלים יחד, במקביל, או במעלה הזרם או במורד הזרם של גן של עניין. עם זאת, מסכי גנטיקה קדימה לעתים קרובות פעמים לא מצליחים לזהות את הגנים חיוניים אשר, כאשר מוטציה, לגרום הקטלניות בשלבי התפתחות מוקדמים, או גנים עם יתירות פונקציונלית ופיצוי אובדנה של פונקציה היחידה לגרום למומים עדינים שקשה להבקיע. דרך אחת להתגבר על קושי זה היא מסך עבור אינטראקציות בין חלבונים ישירים. במשך יותר מעשור, רשימה הולכת וגדלה של שיטות ביוכימיות, כולל שמרי שני היברידיות, להציג הפאג, cross-linking הכימי, Co-IP, טנדם זיקה טיהור (TAP), וכו &#39;. היה בשימוש כדי לחקור חלבוןחלבון אינטראקציות. כל אחת מהגישות הללו יש סט של נקודות חוזק וחולשה בכל הקשור לרגישות וסגוליות משלו. ביניהם, את שיטת TAP מאפשרת זיהוי של אינטראקציה פיזית בתנאים כמעט פיסיולוגיים, שומרת על ייחוד ועקביות 2 וכוללת את היכולת להרחיב לתפוקה גבוהה ניתוח 3,4. שיטת TAP פותחה בשמרים במקור על ידי עמיתי Rigautand 1. בשיטה זו, חלבון של העניין בא לידי ביטוי עם תג TAP. תג TAP מטפח שני תחומים עצמאיים מחייב זיקה: חלבון תחום שנקשר לנוגדנים ומחייב רישום calmodulin. שני תחומים מופרדים על ידי אתר מחשוף TEV (וירוס Etch טבק). שילוב כזה מאפשר לשני סיבובים עצמאיים של purifications זיקה כדי להפחית במידה מספקת איגודים ספציפיים ולהעשיר איגודים ספציפיים 1. למשל זה, שיטת TAP היא metho חזק מאודד לזהות באינטראקציות vivo של חלבון נתון, אם כי ביתר את חלבון אקסוגני יכול לעשות את זה יותר נוטה לקשר עם חלבונים שעושים בדרך כלל אינו מורכב עם עמיתו אנדוגני שלה. מאז הפיתוח שלה, שיטת TAP כבר מיושמת במערכות רבות אחרות, כוללים תאים המבוסס על תרבות מערכות 5,6 ובמערכות מודל vivo אחרות 6-9. כאן אנו מתארים את העיבוד של שיטת TAP בדרוזופילה. אנחנו מייצרים ראשון וקטורי pUAST-NTAP וpUAST-CTAP כדי להקל על שיבוט והיתוך של תג TAP לאו N-או C-המסוף של הגן של עניין. -מתויג TAP כטב&quot;מ transgene לאחר מכן בא לידי ביטוי במערכת העצבים בשליטתו של נהג GAL4 עצבי 10. בשלב הבא, מספר גדול של ראשי זבוב בוגרים ייאסף, שבו יש תכולה גבוהה של תאים עצביים וקלים להיפרד מחלקי גוף אחרים לאחר הקפאה המבוסס על הבדלים בגודל. הראשים הבוגרים ב הומוגני ופינהcentrifugations y הרציף, ואת supernatant כפוף להליך TAP המתואר להלן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">U.S.A. standard test sieve No. 25</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-881-18&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">U.S.A. standard test sieve No. 40</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-881-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885300-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG sepharose beads</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td style="width:119px;">17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-column 0.7 cm x 20 cm</td>
			<td style="width:104px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">737-4721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-column 0.5 cm x 15 cm</td>
			<td style="width:104px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">737-4716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calmodulin beads</td>
			<td style="width:104px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">214303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coors Mortar and Pestle</td>
			<td style="width:104px;">CoorsTek</td>
			<td>60311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AcTEV Protease</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:104px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Mix</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying protein-protein interaction in drosophila adult heads by tandem affinity purification (tap)

מסכי גנטיים שנערכו באמצעות דרוזופילה melanogaster (זבוב פירות) יש תגליות אבן דרך רבות בהתקדמות של מדעים ביולוגיים. עם זאת, השימוש במסכים ביוכימי שמטרתה להרחיב את הידע שנצבר מניתוח גנטי שנחקר רק לאחרונה. כאן אנו מתארים שיטה לטיהור החלבון המורכב שמקורביו עם כל חלבון של עניין מראשי זבוב בוגרים. שיטה זו מנצלת את מערכת דרוזופילה Gal4/UAS לבטא חלבון פיתיון התמזגו עם תג טנדם זיקה הטיהור (TAP) בנוירונים זבוב in vivo, ולאחר מכן מיישמת את שני סבבים של טיהור באמצעות הליך TAP דומה לזה שהוקם במקור בשנת שמרי 1 כדי לטהר את החלבון מורכב אינטראקציה. בסופו של הליך זה, תערובת של קומפלקסי חלבונים מרובים מתקבלת אשר מולקולרי זהויות יכולים להיקבע על ידי ספקטרומטריית מסה. אימות של חלבוני המועמד תיהנה מresource וקלות ביצוע מחקרי אובדן של פונקציה בזבובים. ניתן ליישם גישות דומות לרקמות זבוב אחרות. אנו מאמינים כי השילוב של מניפולציות גנטיות וגישת proteomic זה במערכת מודל זבוב בעל פוטנציאל אדיר להתמודדות עם בעיות יסוד בתחום הנוירוביולוגיה ומעבר.

כאן אנו מדגימים המאמץ שלנו בזיהוי חלבוני Highwire-אינטראקציה במוח הזבוב. Highwire (hiw) וhomologues החוליות וחסרי חוליות שלה הם ligases היוביקוויטין ענק המווסתים את ההתפתחות ותיקון של מערכת העצבים 14. הם חולקים מספר תחומים פונקציונליים השמורים ביותר. עם זאת, הפעולות מולקולריות ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP at JoVE.com

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

identifying-protein-protein-interaction-drosophila-adult-heads-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

13.8K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center.  דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר. 

Video: Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...