מחקר במעבדה גאנם נתמכה על ידי מענק מחקר לא. 908-42.12/2006 מהקרן הגרמנית ישראלית (GIF), מענק לא. IS-4062-07 מארצות הברית וישראל דו הלאומית קרן החקלאות ארצות המחקר ופיתוח (BARD), ומענק מחקר לא. 884/07 מקרן הלאומית למדע (ISF) לMG

1. הכנות כלליות כנימות, צמח, ווירוס לניתוח FISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנימות עש האחורי B ו-Q biotype על שתילי גפן (Gossypium hirsutum ל קורות חיים. Acala) ולשמור בתוך כלובי חרקים הוכחה וחדרי צמיחה בתנאים סטנדרטיים של 25 ± 2 מעלות צלזיוס, 60% לחות יחסית, ואור 14-HR / photoperiod הכהה 10-HR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR לבדיקת זיהום עם endosymbionts באמצעות פריימרים endosymbiont ספציפי כמו 15-19 שתואר קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש שתילי עגבניות (Solanum esculentum קורות חיים. אומצה) ממשתלה מסחרית או זרעי עגבניות צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור באותם תנאי הגידול שתוארו לעיל, עד הצמחים מגיעים לשלב אמיתי עלה ארבעה, הגיל המתאים ביותר עבור חיסון בתיווך כנימות של 15 ירליות (ראה סעיף 4.1 בהמשך). </li></ol> 2. טיפול בחרקים, קיבוע, Probe עיצוב, הכלאה, ויזואליזציה לאנדוFISH סימביונט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10 כנימות עש בוגר על ידי שאיפה מצמחי כותנה, או לבחור 10 -3 או 4 נימפות instar ה מעלי גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לטבול במקבע של Carnoy (חומצת כלורופורם אתנול-אצטית קרחונית, 06:03:01, כרך / כרך) בתוך צינורות Eppendorf. תקן עבור 2 שעות ללילה (רצוי למשך לילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר לחלוטין את מקבע והדהות ב6% H 2 O 2 באתנול במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמר את הדגימות באתנול מוחלט במשך כמה ימים עד מספר שבועות בטמפרטורת חדר, או להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקות עיצוב פריימרים DNA הפוך משלימים המבוססים על גנים RNA ריבוזומלי 16s של כל חיידק. לעיצוב הבדיקות, לקחת בחשבון אותם השיקולים לעיצוב primers PCR. השתמש בבדיקות oligonucleotide BTP1 5&#39;-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 &#39;, RB1 5&#39;-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3&#39;, BTH 5&#39;-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 &quot;וars2 5&#39;-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 &quot;למיקוד ספציפי של Portiera, Rickettsia, Hamilonella, וArsenophonus, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה ניאון להכליא דגימות לילה בחושך במאגר הכלאה (20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.9 M NaCl, 0.01% [wt / כרך] נתרן גופרתי dodecyl, [כרך / כרך] פוראמיד 30%) המכיל 10 pmol לכל מיליליטר . שלב את הבדיקה יותר מפעם אחת עם צבעי ניאון שונים במידת צורך. השתמש whiteflies noninfected עם החיידק הממוקד ודגימות ללא בדיקה בקרות שליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את הדגימות כולה, בשקופית מיקרוסקופ, בחיץ ההכלאה הכיל עם חוסם נוזלי, מכסים בפיסת כיסוי, חותמים עם לק, ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal. </li></ol> 3. כנימות האיברים Dissection, קיבוע, הכלאה, ויזואליזציה לדגי ירליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כנימות עש בוגרים שגדלו ברציפות על צמחי עגבנייה נגועות ב-ירליות על ידי שאיפה וanesthetize על ידי חשיפה למגבת נייר ספוגה באצטון. לחשוף whiteflies רק 1-2 דקות כמו חשיפה ארוכה מדי לאצטון יכולה לתקן רקמות כנימות עש. השתמש whiteflies nonviruliferous גדל על שיחי עגבניות noninfected ולא דגימות בדיקה עבור פקדים כדי לאשר הכלאה ספציפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנימות עש ההר במיקרוסקופ הדיכאון מחליק לנתיחה איברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משכו ממנו את הראש החרק מprothorax ולנתח בלוטות רוק ב1x PBS בתוספת כתם כחול toluidine 1% להדמיה טובה יותר, בשל גודלם הקטן. לאפשר ספיגת הכתם במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את החרקים לגזרים בצומת שבין בית החזה והבטן להתבונן ולגרש את midgut. לגרש את התוכן של הבטן על ידי דחיפה עם מלקחיים בקצה הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את PBS וtoluidine כחול ומניתוחים מוצלחים ובעדינות להוסיף 300 μl של המקבע של Carnoy לתקן האיברים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">dd מקבע מצד אחד של גם בדיכאון ולא מהחלק העליון כדי למנוע תנועה בלתי מבוקרת של האיברים גזורים. ברגע שנוגע במקבע, האיברים ידבק הזכוכית, וכל התהליך שהם לא יזוזו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולהוסיף 500 μl של חיץ הכלאה בתוספת 10 pmol של חללית ניאון DNA Cy5-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &quot;, אשר משלים רצף בגן חלבון מעיל ירליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכליא לילה בטמפרטורת חדר בחושך על ידי דוגרים השקופית עם הדגימה בתוך תא לח קטן מורכב מקופסא פלסטיק הקטנה עם נייר מגבת רטוב בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ההכלאה, להרים את האיברים עם כלי לנתיחה קנס ומהירות להעביר אותם לשקופית מיקרוסקופ טרי המכילה 30 μl של חיץ הכלאה חדש בתוספת DAPI (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר ב 1x PBS) והכיל עם חוסם נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את הדגימות עם תלוש כיסוי, לאטום שנינותמסמר h פולני ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal. </li></ol> 4. טיפול בצמח, יד חתך, קיבוע, וכלאה לדגי ירליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן שתילי עגבניות עם ירליות באמצעות חיסון בתיווך כנימות viruliferous. ניתן לאתר את הנגיף בשיטת FISH זה בצמחי symptomless שבוע לאחר חיסון. תסמיני מחלה אופייניים הם לאחר חיסון שלושה שבועות נראה לעין. השתמש בצמחי עגבניות noninfected ולא דגימות בדיקה עבור פקדים כדי לאשר הכלאה ספציפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין גילוח חד היסטולוגית להכנת 2-4 סעיפי יד לחתוך סנטימטר אורך או רוחב של עגבניות גבעולים ועלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינורות Eppendorf, לתקן את הסעיפים במקבע של Carnoy לשעה 2 בלילה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשמר את החלקים באתנול מוחלט במשך כמה ימים עד מספר שבועות בטמפרטורת חדר, או להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלקיםשלוש פעמים, 1 דקות כל אחד, בחיץ הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכליא חלקים עם 500 μl של חיץ הכלאה בתוספת 10 pmol של חללית ניאון oligonucleotide Cy3-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &quot;אשר משלים רצף בגן חלבון מעיל ירליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלקים שלוש פעמים, 1 דקות כל אחד, בחיץ הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי הר שלם בחיץ הכלאה בתוספת DAPI (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר ב 1x PBS) והכילו עם חוסם נוזלי, לכסות עם coverslip, חותמים עם לק ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Czosnek, H., Laterrot, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+worldwide+survey+of+Tomato+yellow+leaf+curl+viruses.">A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses.</a> Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).</li><li>Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+Tomato+Yellow+Leaf+Curl+Virus+in+South+Carolina.">First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina.</a> Plant Dis. 90, 379 (2006).</li><li>Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+Florida+and+implications+for+the+spread+of+this+and+other+geminiviruses+of+tomato.">Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato.</a> Plant Dis. 83, 984-988 (1999).</li><li>Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+North+Carolina.">Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina.</a> Plant Dis. 86, 73 (2002).</li><li>Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogeographical+analysis+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex+based+on+mitochondrial+DNA+markers.">A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers.</a> Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+translocation+in+the+circulative+transmission+pathway+of+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Phytopathology. 91, 188-196 (2001).</li><li>Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestive++salivary+and+reproductive+organs+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+Hemiptera:+Aleyrodidae)+B+type.">Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type.</a> J. Morphol. 248, 22-40 (2001).</li><li>Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+geminiviruses+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci+(Homoptera:+Aleyrodidae).">Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae).</a> Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).</li><li>Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pathway+of+geminivirus+in+whitefly+extracts,+saliva,+hemolymph+and+honeydew.">Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew.</a> Phytopathology. 89, 239-246 (1999).</li><li>Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circulative+pathway+of+begomoviruses+in+the+whitefly+vector+Bemisia+tabaci&#8212;insights+from+studies+with+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci&#8212;insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus.</a> Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virusby+the+whitefly+Bemisiatabaciis+correlated+with+the+presence+of+aspecificsymbiotic+bacterium+species.">The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species.</a> J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).</li><li>Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+Rickettsia+spp.+and+organ-specific+infection+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).</li><li>Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).</li><li>Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+and+inexpensive+method+for+localization+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+and+Potato+leafroll+virus+in+plant+and+insect+vectors.">A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors.</a> J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).</li><li>Nirgianaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).</li><li>Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+bacteriocyte-associated+endosymbionts+of+plant+sap-sucking+insects.">Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects.</a> Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+(Homoptera)+Aleyrodidae).">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae).</a> App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).</li><li>Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Wolbachia+infection+in+Bemisia+tabaci.">Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).</li><li>Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+localization+of+bacterial+symbionts+in+three+whitefly+species+(Hemiptera:+Aleyrodidae)+from+the+east+coast+of+the+Adriatic.">Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic.</a> Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן ללוקליזציה של וירוס צמח במארח מפעלה ווקטור חרקים, חיידקים וendosymbiotic במארח הכנימות הספציפיים שלהם, יכול להיות מותאם ללוקליזציה של וירוסים אחרים בצמחים ואפילו ברקמות של בעלי חיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי למקם חיידקים פתוגניים endosymbiotic ומי...

כאשר לומדים את יחסי הגומלין בין וירוסי צמח ופתוגנים אחרים עם המארחים הצמח הנגועים שלהם, זה חשוב כדי להמחיש את גורמי המחלה וחומצות הגרעין שלהם באתר, ללא קשר אם הם גורמים להשפעות שליליות על מארחיהם. זה חשוב ביותר כאשר לומד תנועת הפתוגן בתוך ובין תאי צמח. בלוקליזציה באתרו של תוצרי גנים של הפתוגן הוא צעד חיוני שמשלים את גישות אחרות ללימוד תהליך פתוגניות. פתוגנים צמח רבים, בעיקר וירוסים, המועברים על ידי חרקים, שיש יחסי גומלין מורכבים ואינטימיים עם הווקטורים שלהם. לוקליזציה של וירוסים אלו בווקטורים שלהם היא חשובה ללימוד בדרך לשידור, ואתרי אינטראקציה האפשריים בתוך הווקטור. העברת של וירוסים מסוימים צמחים וקטורי חרקים נעזרת בחיידקי endosymbiotic הנמצאים בתוך חרקים אלה. כדי לחקור את העברת וירוסי צמח ב האלה טובים יותרy הווקטורים שלהם, הוא גם חיוני כדי להמחיש את חיידקי endosymbiotic באופן כללי, ואלה שהיו מעורבים בהעברת נגיף, בפרט. Colocalization של חיידקי הווירוסים וendosymbiotic וכך רצוי לחוקר את הקשרים האפשריים בין אורגניזמים אלה בתוך מארח החרק שלהם. מלבד העברת נגיף, חיידקי endosymbiotic להשפיע על מספר היבטים של הביולוגיה של וקטורי חרקים, לוקליזציה וכך המרחבי של חיידקים אלה בחרקים היא של ריבית גבוהה וחשיבות. וירוס סלסול עלים צהובים עגבניות (ירליות) (Begomovirus, Geminiviridae) הוא מורכב החשובה ביותר נגיפית המחלה של עגבניות מעובדות בעולם 1-4. ירליות היא וירוס מוגבל השיפה והווקטורים באופן בלעדי על ידי Bemisia tabaci כנימות 5,6. מודל המתאר את טרנסלוקציה של begomoviruses בוקטורי כנימותיהם הוצע 6-9. שני מחסומים ספציפיים הם חצו באופן פעיל during שידור circulative זה: midgut / hemolymph ומחסומי בלוטת hemolymph / רוק. תהליך העברת זה השערה הוא שמתווך על ידי קולטנים ידועים אשר מזהים את הקופסית הווירוס. הוא חשב ירליות לחצות ב &#39; midgut tabaci 6,10, והוא נספג דרך בלוטת הרוק העיקרית 6 לפני שהוא מוזרק לתוך הצמח. בhemolymph הכנימות, ירליות אינטראקציה עם חלבון GroEL מיוצר על ידי חיידק endosymbiotic המשני החרקים Hamiltonella. אינטראקציה זו מבטיחה הובלה בטוחה של ירליות בhemolymph, ומגנה עליו מפני התקפה של המערכת החיסונית החרקים 11. Hamiltonella וPortiera, endosymbiont העיקרי של כנימות עש, הם שוכנו בbacteriocytes, חרק תאים הנמצאים בחיידקי hemolymph וendosymbiotic בית 11. B. tabaci נמלי חיידקי endosymbiotic נוספים כולל Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, ופריטשEA, אשר יכול להיות מקומי בתוך או מחוץ לbacteriocytes, ויש להם השפעות מגוונות על הביולוגיה של החרקים 12. מספר דיווחים, ניסו ללמוד את הלוקליזציה של ירליות בצמחים וכנימות עש באמצעות פרוטוקולים זמן רב ויקרים, כגון הילוכים מיקרוסקופית אלקטרונים (TEM), נוגדנים ו-RNA באתרם על סעיף בעובי מיקרוסקופי 10,13, מחקר שנערך לאחרונה תאר את הלוקליזציה של וירוסי צמח בתוך המארחים הצמח ווקטור שלהם על ידי שימוש בפרוטוקול פשוט 14. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט ללוקליזציה של ירליות בB. tabaci גזור midguts ובלוטות רוק, ובסעיפים שהוכן מצמחים נגועים ב-ירליות. בנוסף, אנו מתארים את הלוקליזציה של Portiera, endosymbiont העיקרי של B. tabaci, וendosymbionts המשני שלה Hamitonella, Rickettsia וArsenophonus. פרוטוקול זה מבוסס על שימוש בבדיקות דנ&quot;א קצרים, כישכותרתו fluorescently ב -5 בסופו של הדבר &#39;שלהם, ובאופן ספציפי להכליא רצפים משלימים ברצפי גנים נגיפיים או חיידקים. עיבוד הדגימה הוא קל יחסית ואת האות המתקבלת היא מאוד ספציפית. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי למקם וירוסים, חיידקים ומזיקים אחרים במארחי צמחים, בעלי החיים וחרקיהם, והוא יכול עוד לשמש בתרגום ה-mRNA בכל רקמה נתון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Fluorescently labeled&#160; Probes</td>
			<td style="width:95px;">Metabion</td>
			<td style="width:129px;">20 bp HPLC purified</td>
			<td style="width:212px;">Sequence designed by customer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Toluidine blue</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">89640</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">L3771</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Formamide</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">F9037</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">T5941</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">320099</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Blocker</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>22309</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridizations (fish) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues

הקרינה הכלאה באתרו (FISH) היא שם שניתן למגוון רחב של טכניקות המשמשות בדרך כלל להמחשת תעתיקי גנים בתאי אוקריוטים ויכול להיות שונה יותר לדמיין רכיבים אחרים בתא, כגון הידבקות בוירוסים וחיידקים. לוקליזציה ויזואליזציה של וירוסים וחיידקים, במהלך תהליך ההדבקה המרחבי היא צעד חיוני שמשלים ניסויי פרופיל ביטוי כגון microarrays וRNAseq בתגובה לגירויים שונים. הבנת זיהומי spatiotemporal עם סוכנים אלה משלים ניסויים ביולוגיים להבנת האינטראקציה שלהם עם מרכיבים תאיים. כמה טכניקות להדמית וירוסים וחיידקים כגון מערכות גן כתב או שיטות immunohistochemical הן זמן רב, וחלקם מוגבלים לעבודה עם אורגניזמים מודל וכרוכים במתודולוגיות מורכבות. FISH, כי מטרות מיני RNA או DNA בתא הוא לי קל ומהיר יחסיתthod ללימוד לוקליזציה spatiotemporal של גנים ולמטרות אבחון. שיטה זו יכולה להיות חזקה וקלה יחסית ליישום, כאשר הפרוטוקולים להעסיק הכלאה קצרה, חלליות מסחריות שנרכשו, שאינן יקרים. זה חזק במיוחד כאשר הכנת מדגם, קיבעון, הכלאה, ולהדמיה מיקרוסקופית אינן כרוך בפעולות מורכבות. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללוקליזציה של חיידקים ונגיפים ברקמות חרקים וצמחים. השיטה מבוססת על הכנה פשוטה, קיבעון, והכלאה של mounts כל חרקים ואיברים מבותרים או חלקי צמח בעבודת יד, עם 20 זוגות בסיסי בדיקות דנ&quot;א קצרים מצומדת לצבעי ניאון על 5 &#39;או 3&#39; שלהם מסתיימת. פרוטוקול זה יושם בהצלחה במספר רקמות חרקים וצמחים, והוא יכול לשמש כדי לנתח את הביטוי של mRNAs או מיני RNA או DNA אחרים בתא.

המערכת למדה בכתב היד הזה מוצגת באיור 1 וכוללת צמח נגוע עם ירליות, מבוגרים ונימפה של B. הכנימות tabaci, והתמונות של האנטומיה הפנימית של הכנימות המראות את הדרך לטרנסלוקציה ירליות בחרקים. איור 2 מראה דגים כפולים בכנימות בוגרות לסימביונט העיקרי ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues at JoVE.com

Fluorescence in situ הכלאות FISH עבור לוקליזציה של וירוסים וחיידקים אנדוזימביוטיים ברקמות צמחים וחרקים | אימונולוגיה וזיהום | וִידֵאוֹ

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

fluorescence-situ-hybridizations-fish-for-localization-viruses

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

23.3K Views.  Volcani Center.  אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים. 

Video: Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו</emהכלאה> (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. Considering the extensive damage caused by begomoviruses to crop production worldwide, it is imperative to understand the interaction between begomoviruses and their whitefly vector. To do so, localization and quantification of the virus in the vector tissues is crucial. Here, using tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) as an example, we describe a detailed protocol to localize begomoviruses in whitefly midguts, primary salivary glands, and ovaries by immunofluorescence. The method is based on the use of specific antibodies against a virus coat protein, dye-labeled secondary antibodies, and a confocal microscope. The protocol can also be used to colocalize begomoviral and whitefly proteins. We further describe a protocol for the quantification of TYLCV in whitefly midguts, primary salivary glands, hemolymph, and ovaries by quantitative PCR (qPCR). Using primers specifically designed for TYLCV, the protocols for quantification allow the comparison of the amount of TYLCV in different tissues of the whitefly. The described protocol is potentially useful for the quantification of begomoviruses in the body of a whitefly and a virus-infected plant. These protocols can be used to analyze the circulation pathway of begomoviruses in the whitefly or as a complement to other methods to study whitefly-begomovirus interactions.

We describe an immunofluorescence and quantitative PCR method for the localization and quantification of begomoviruses in insect tissues. The immunofluorescence protocol can be used to colocalize viral and vector proteins. The quantitative PCR protocol can be extended to quantify viruses in whole whitefly bodies and virus-infected plants.

לוקליזציה וקוונפיקציה של וירוסים באגאוטיות ברקמות Whitefly על ידי Immunofluorescence ו-PCR כמותי

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...