המחברים מודים לחברי בעבר ובהווה של המעבדה על תרומתו לפיתוח מתודולוגיה המפורטים כאן לאלן Cochrane עצה. בלוס אנג&#39;לס הוא מקבל מכוני מחקר קנדי ​​הבריאות (CIHR) מלגת דוקטורט AJM נתמך על ידי פרס פרייזר, Monat ו מקפרסון קריירה. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מטעם CIHR (מענק # MOP-56974).

1. בדיקה הכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר 1 מיקרוגרם של של וקטור שעתוק במבחנה, PKS (+) pol 236nt 9 עם האנזים Kpn1 על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולהפעיל את מוצר ה-DNA לינארית על ג&#39;ל agarose. שבר צריך להיות כ 2500 BP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קטע מתוך ג&#39;ל ולטהר באמצעות מיקרו רוש Elute ערכת חילוץ ג&#39;ל (כל חומרים כימיים המשמשים מפורטים טבלה 1). בצע elution האחרון חיץ 30 elution μl. הפעלה 5 μl של המוצר על ג&#39;ל agarose לאמת טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בתגובה שעתוק במבחנה (ראו מתכון בהמשך) באמצעות ה-DIG רוש RNA תיוג ערכת דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li></ol> בתגובה שעתוק במבחנה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לינארית DNA </td><td> 23 μl </td></tr><tr><td> 1X DIG-RNA תיוג תערובת (Roche) </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 1X Transcription חיץ </td><td> 8 μl </td></tr><tr><td> 20U RNase OUT </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 80U T7-RNA פולימראז </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 40 μl </td></tr></tbody></table><ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 228 U של DNase אני דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה על ידי הוספת EDTA pH 8.0 לריכוז סופי של 20 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התגובה באמצעות עמודות סיבוב מהיר של רוש כמפורט על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את החללית על ידי משקעים עם 1/10 נפח pH DEPC שטופלו NaOAc 3M 5.2 ו 2.5 כרכים של אתנול קפוא 95%. מערבבים דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה החללית במשך 15 דקות ב 4 ° C על 15,000 X גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף גלולה באתנול קפוא 70%. סרכזת שוב 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס על 15,000 X גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ומייבשים גלולה. Resuspend גלולה ב 50 W μlater (DNase / RNase חינם) המכיל 10 U Invitrogen RNase OUT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הריכוז של בדיקה על ידי spectrophotometry (RNA למדוד ב 260 ננומטר), וכן לדלל את ריכוז של 5 ng / μl. חנות aliquots ב -20 ° C לשימוש לטווח קצר, או -80 מעלות לאחסון ארוך טווח. מומלץ לבצע השוואות בין היתר כדי לחסוך assay aliquot לכך. </li></ol> 2. תא קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב תחילה בתאי זרע חסיד על גבי זכוכית, coverslips שלא טופלו סטריליים כך confluency הסופי על קצירת הוא כ 70-80%. עבור מי שאינם חסיד תאים, לצמוח כרגיל וכאשר מוכן לאסוף, דגירה להם coverslips כי טופלו 0.01% w / v פולי-L-ליזין (Sigma-Aldrich, Inc) במשך שעה 1. על צלחת טיפוסית של 12 גם רקמת תרבות קלקר (3.8 ס&quot;מ 2), 150,000 התאים (למשל הלה) הם מצופה ב 24 שעות לפני transfection. הלא חסיד תאים יכולים להידבק או transfected כרגיל ואיפשר למודעהכאן כיסוי זכוכית תלושי לפני קיבוע 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיה ולשטוף את התאים עם מי מלח 1X פוספט שנאגרו להכין מים מזוקקים פעמיים (DPBS) דקות 1. Diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc)-1X יחס PBS עשוי לשמש גם, PBS מטופל עם זאת לא יכול מכיוון שהוא עלול להכיל אנזימים RNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק PBS ולהוסיף paraformaldehyde 4%, מספיק כדי לכסות את התאים לחלוטין. דגירה של 15-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק paraformaldeyhyde ולשטוף תאים עם 1x DPBS דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את DPBS ולהוסיף 0.1 מ &#39;גליצין (מומס 1x DPBS). דגירה של 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק גליצין ולשטוף את התאים עם 1x DPBS דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את DPBS ולהוסיף 0.2% Triton-X (מומס 1x DPBS). דגירה למשך 5-10 דקות. אם מכתים עבור חלבונים המעטפה nucleolar או גרעיני, permeabilize עם טריטון X-100 דקות לא יותר מ 5 או לוקליזציה חלבון יהיה מפוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק טריטון X-100 ולשטוף פעם1X DPBS דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אחסון לטווח ארוך, להחליף PBS עם אתנול 70% וחנות על 4 מעלות צלזיוס במשך עד ארבעה חודשים. לחלופין, לשטוף שוב עם 1x DPBS ולהמשיך לדוג. </li></ol> 3. הקרינה של הכלאה באתרו (דגים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם coverslips אוחסנו אתנול, תחליף אתנול עם 1x DPBS ולאפשר לתאים rehydrate למשך 30 דקות. להחזרת נוזלים ניתן לעשות זאת בן לילה אם coverslips מאוחסנים 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את coverslips עם 1x DPBS דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שקופיות כדי לדגור על coverslips על, מקפיד לנקות לתייג אותם היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור coverslip 18mm, הוסף 50 μl של פתרון DNase (25 יחידות / coverslip, זמינים מסחרית) לשקופית. הוסף coverslip, להיות בטוח למקם אותו בצד התא למטה, דגירה אותו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את coverslips עם 1x DPBS דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl תערובת ההכלאה (ראו מתכון בהמשך) לכל coverslip עלשקופיות דגירה בצד התא coverslip למטה H 16-18 ב 42 ° C. הדגירה יש לבצע במגש המכיל לפוראמיד 50%, 2X SSPE תערובת (12.5 לפוראמיד deionized מ&quot;ל, 2.5 מ&quot;ל 20X SSPE, 10 מ&quot;ל מים). </li></ol> מערבבים ההכלאה (למשל coverslip, 50 μl): <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כמות המניות </td><td> חומר (בריכוז הסופי) </td></tr><tr><td> 25 μl </td><td> לפוראמיד, 50% (deionized, כל מקור) </td></tr><tr><td> 5 μl (של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> tRNA, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 μl (של 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 μl (של 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0.125 μl (5 יחידות) </td><td> RNase OUT </td></tr><tr><td> 5 μl (25 ng של 5 ng / μl) </td><td> בדיקה </td></tr><tr><td> 5 μl </td><td> H 2 O DEPC, כדי להפוך את סופינפח 50 μl </td></tr></tbody></table><ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips בצד התא למטה לפוראמיד 50 50% μl (מדולל 1x DPBS) במשך 15 דקות על 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את coverslips פעמיים 2X SSPE ידי דוגרים עליהם בצד התא למטה 50 μl 2X SSPE (20X SSPE מדולל 1x DPBS) 5 דקות כל אחד ב 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את coverslips ב 1X DPBS דקות 1. </li></ol> 4. Immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את coverslips ידי הצבתם לצד התא למטה 50 μl פתרון 1X חסימת רוש (Roche 10X פתרון חסימת מדולל 1x DPBS) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בצד התא coverslips את בתמיסה הנוגדן μl 50 ראשונית במשך שעה 1 ב 37 ° C. Anti-DIG נוגדנים יש לדלל לפי הכיוון של היצרן בפתרון 1X חוסם. אם נוגדנים אחרים נמצאים בשימוש כדי להכתים חלבונים, הם יכולים להוסיף בריכוז הנכון בתנאי שכל נוגדנים המשמשים נגזרות המפרט שורה אחרתies. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את coverslips 10 דקות ב 1X DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בצד התא coverslips את בתמיסה הנוגדן μl 50 משנית שעה 1 ב 37 ° C. Alexa פלואוריד, מצומדות נוגדנים (Invitrogen) ניתן להשתמש כדי ליצור מגוון של צבעים והם משמשים ב 1:500 ב 1X, חסימת DPBS פתרון 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את coverslips פעמיים 10 דקות כל אחד DPBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את הצד תא coverslips על נייר Whatman. יש להקפיד לכסות את coverslips כדי להימנע מחשיפה לאור הלבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל הנוזל מתאדה, הר coverslips על שקופיות טריים באמצעות 8 ImmunoMount μl (Thermo Scientific, Inc). לטפוח בעדינות את coverslip לחסל את כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לק לקצות coverslip לאבטח אותו במקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויזואליזציה של רנ&quot;א וחלבונים על ידי שיטות מיקרוסקופיה הוא גם קריטי להצלחה של טכניקה זו. הגדרות מיקרוסקופ המשמש יכול לעזור או להפריע להדמיה כך מפתחהגדרות מיקרוסקופ להיות נכונה ולהיות עקבית ממדגם אחד למשנהו בניסוי נתון. הגדרות מפורטות עבור מיקרוסקופיה, אופטיקה ושילובים נוגדנים ראה הפניות 1,10. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה מכתים RNA נגיפי ניתן לראות באיור 2. RNA ויראלי של HIV-1 הוא ראה בכל הציטופלסמה המוצג diffusely על פי רוב, אם כי punctae cytoplasmic קטנה אינן נדירות. הספציפיות ניתן לראות על ידי השוואת תאים חיוביים לתאים הסמוכים המוצגים לא פלואורסצנטי. כפי שהוזכר במבוא, HIV-1, כי אין את החלבון הרגולטורי Rev מייצרת RNA אשר נשמרת הגרעין: זה יכול להיות דמיינו כאות בהיר בגרעין, וחוסר האות הקרינה RNA בציטופלסמה. ביטוי יתר של חלבונים תאיים הוא גם מסוגל להסיט את ההפצה של HIV-1 RNA ויראלי. באיור 2 </&gt; חזק, ביטוי יתר של חלבונים המעורבים בסחר שלפוחית ​​endosomal (למשל, Rab7-אינטראקציה lysosomal חלבון (RILP) 11 או N-סופני RILP נמחק (RILPN) 11, חלבונים שמפריעים בתפקוד המוטורי dynein [למשל p50/dynamitin 1, 12], להפריע לוקליזציה היציב הרגיל של ה-RNA הגנומי ויראלי כפי שנקבע על ידי ניתוחים דגים ביטוי RILP מוביל לוקליזציה מחדש של RNA הגנומי ויראליים ארגון microtubule מרכז (MTOC) 13;. RILPN מפזר מאוחר endosomes בתוך הציטופלסמה בשל חוסר היכולת לאגד p150 דבוקה של המנוע מורכב dynein 14 וחוסם p50/dynamitin למקטע גדול של dynein המנוע משחרר מאוחר endosomes אלא גם גנטי נגיפי RNA HIV-1 חלבונים מבניים בפריפריה התא 1 (איור 2). מניפולציה של לוקליזציה היציב של RNA הגנומי ויראלי, תורם המפתח מידבק שלחלקיקי נגיף, יהיה המפתח להתפתחות עתידית של הרפוי. בידינו, רנ&quot;א נגיפי מופיע בתא כבר 3 שעות שלאחר transfection וזיהום 10 והופך ניתן לצפות בקלות על ידי טכניקה זו על ידי דג 12 שעות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים זרימה של פרוטוקול של דגים / אם שיתוף ניתוחים. תאים גדלים על coverslips ולאחר מכן קבוע עם paraformaldehyde. טיפולים של גליצין ו-טריטון X מבוצעות לפני התאים משמשים גם עבור דגים / אם או מאוחסנים אתנול 70% לאחסון. תאים מיובשים לאחסון הם rehydrated ב 1X DPBS (DEPC שטופלו PBS) לפני שהמשיכו בדרכם אל דג / אם. תאים מטופלים עם DNase אני והשאירו למשך הלילה כדי להכליא עם החללית. לאחר ההכלאה הושלמה, התאים נשטפים עם לפוראמיד, כמו גם עם SSPE, וכמה האחרונים 1x DPBS לשטוף. פתרון חסימת מוחל על התאים, ואחריו הדגירה עםנוגדנים ראשוניים. לאחר הכביסה, נוגדנים משניים מוחלים. שתי שוטף האחרונים 1x DPBS להשלים את ההליך מכתים שם על coverslips הם מיובשים רכוב על שקופיות הדמיה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> איור 2. התוצאות מייצגות באמצעות דגים / אם שיתוף ניתוחים.) HIV-1 הוא transfected לתאי הלה ובמקרים מסוימים עם מבנים שגורמים ביטוי יתר של חלבונים תאיים (RILP, p50/Dynamitin ו RILPΔN (מחיקה אמינו מסוף מוטציה)) . דגים / אם שיתוף ניתוחים בוצעה: RNA מזוהה עם ירוק או G3BP או LAMP1 (אדום) כדי לבדל. ב) HIV-1 מתבטא הלה שנאסף בנקודות זמן שונות. נגיפי RNA הוא ביטוי במעקב בירוק ואילו חלבון הסלולר, hnRNP A1, מוכתם באדום. ברים הם בגודל 10 מיקרומטר. תמונות שונה מ 1 הפניות (איורים נבחרים מתוך לוח; RILP, p50/Dynamitin, ו RILP deltaN)ו 17 (לוח ב &#39;).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

דגים / אם שיתוף ניתוח היא שיטה אמינה לחזות רנ&quot;א נגיפי בתאים אשר עכשיו שוכללה 9,15,16. במשך מספר שנים, פיתחנו שיטה מעודנת של מכתים עבור RNA. טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים בתנאי בדיקה ספציפית היעד RNA 17. על ידי תיוג בדיקה עם DIG, אנו מסוגלים לדמיין את הרנ&quot;א על ​​ידי צביעה פשוטה. כאשר מכתים עבור רנ&quot;א וחלבונים אחרים משולבים, דגים / אם שיתוף ניתוחים להיות כלי רב עוצמה לבחון מבנים סלולריים חלבון / RNA לוקליזציה. הספציפיות של זיהוי RNA הוא גבוה למדי. זו באה לידי ביטוי באיור 2. בחלק מן היצירה המקורית שהתמקדה לוקליזציה נגיפי RNA הגנומי, דגים קבע כי חוסר Rev לכודים רנ&quot;א נגיפי בגרעין 18. מאז זה, המידע החדש בשפע על לוקליזציה נגיפי RNA הגנומי שהושג באמצעות techniquדואר שמתואר כאן. על ידי חלבונים overexpressing סלולריים, אוכלוסיות והן ספציפיות לא הכל של רנ&quot;א נגיפי ניתן לכפות בתרגום לאזורים שונים של התא. Overexpression RILP, אשר דומה פנוטיפ להשיג כאשר hnRNP A2 תיגמר ידי siRNA ב-HIV-1-להביע תאים 13, גורם RNA כדי לצבור בעליל על MTOC. RNA הגנומי ויראלי יכול להיות דחף לפריפריה התא על ידי השבתת חלבון מינוס סוף המנוע, dynein: overexpression מציאה p50/Dynamitin או של כבדות dynein 1 תוצאות שרשרת שחרורו של RNA הגנומי ויראלי מתחומי תאיים לפריפריה נייד ( איור 2). מוטציה של RILP, RILPΔN, אשר לא נקשר מנוע dynein, מתפזר endosomes (מסומן על ידי LAMP1) לתוך הציטופלסמה, כי הם כבר לא פעיל מקומי בדומיינים juxtanuclear. תוצאות אלו מצביעות על הרעיון של האוכלוסייה פלסטיק של HIV-1 RNA הגנומי ובעיקר, כי בריכות שונות של הגנום-1-HIVRNA להתקיים עם התפקידים המזוהים לפעמים במחזור השכפול הנגיפי. מושגים אלה אותם כבר זיהו את החלבון המקודד על ידי ה-mRNA זה, איסור פרסום 19. יש מגבלות על השימושים של דגים / אם שיתוף ניתוחים הקשורים הבחירה נוגדנים וזמינות. אופטימיזציה של השילוב הטוב ביותר של נוגדנים ראשוניים ומשניים, וריכוזים שלהם, ייקח זמן לבצע אופטימיזציה (ראה לוח 1 &amp; 2). נוגדנים עשוי היברידיים או מיוצר על ידי חברות גדולות יכולות להיות ריכוזי המשתנות בכל מקום בין 01:02 ל 1:2000, אבל כדי להיות בטוח בצע את ההנחיות המסופקות על ידי היצרן לקבלת התוצאות הטובות ביותר. מארח בו את הנוגדן מיוצר צריך גם לקחת בחשבון. כבשים ערבוב עם נוגדנים עזים כמו כן, יש להימנע נוגדנים ראשוניים ומשניים כמו זה תוצאות השילוב ברקע גבוהה בשל בין המינים הכרה (מידע לא מוצג). ל-Alexa פלואוריד secondaנוגדנים ר&quot;י, ריכוז ניתן להשתמש ב 1:500 על נוגדנים כמעט לכל קבוצה. החיסרון השני דגים / אם שיתוף ניתוחים כמתואר בדוח זה היא שהוא מתאר את RNA במיקום שלה בבית היציב, לאחר התאים תוקנו ו permeabilized באמצעות paraformaldehyde וחומרי ניקוי (איור 1). עם זאת, RNA הדמיה בתאים חיים הושגה באמצעות מגוון רחב של אמצעי 20-22, בעיקר באמצעות וריאציות של נגיפי RNA כי הגנום מתויגים על ידי חלבוני ניאון כגון ה-GFP. עם זאת, אמצעים נוספים כדי לזהות לוקליזציה RNA בתאים חיים ממשיכים פני השטח. אלה שיטות חדשות לערב את RNA תיוג באמצעות 23 תרד, SNAP 24 או MTRIP 2. טכניקות אלו סובלים גם כמה חסרונות, כולל הדרישה permeabilize תאים לפני הוספת מצעים או מחצית חייבים להיות מהונדסים לתייג את ה-mRNA, כדי לזהות את ה-mRNA באמצעות מיקרוסקופ. אכן, אדוה גדולntage של ניתוחים דגים המפורטים בדוח זה נעוצה בעובדה כי RNA הוא יליד ללא שינוי שמוביל את התוצאות הרלוונטיות ביותר מבחינה פיזיולוגית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 18mm coverslips </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyde </td><td> JT בייקר </td><td> S898-07 </td><td> כדי להפוך את 4%: להמיס 20 גר &#39;ב 1XDPBS 500 מ&quot;ל ב 60 ° C עם 5 טיפות NaOH. pH 7.2 כדי חום וחנות ב -20 ° C. אין לעבור על 70 מעלות צלזיוס! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרו Elute ג&#39;ל ערכת חילוץ </td><td> רוש </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG-RNA Labelling Mix </td><td> רוש </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> תמלול T7-RNA פולימראז </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> ספין עמודות מהירים </td><td> רוש </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> לפוראמיד </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן Enhancer פלורסנט הגדר עבור איתור DIG # 4 (פתרון חסימת) </td><td> רוש </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד נוגדנים משניים </td><td> Invitrogen </td><td> ר &#39;טבלה 2 </td><td></td></tr><tr><td> ההכלאה תנור </td><td> Boekel מדעentific </td><td> דגם 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. זיהוי של חומרים כימיים מסוימים וציוד <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מינים של נוגדנים נגד DIG (דילול, החברה מס &#39;קטלוגי) </td><td> צבעים </td><td> Alexa פלואוריד משמש (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> עכבר (1:500, Sigma, B7405) </td><td> ירוק </td><td> Alexa פלואוריד 488 חמור נגד העכבר (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> אדום </td><td> Alexa פלואוריד 594 חמור נגד העכבר (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> כחול </td><td> Alexa פלואוריד 647 חמור נגד העכבר (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> כבשה (1:200, רוש, 11376623) </td><td> ירוק </td><td> Alexa פלואוריד 488 חמור נגד כבשים (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> אדום </td><td> Alexa פלואוריד 594 חמור נגד כבשים (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> כחול </td><td> Alexa פלואוריד 647 חמור נגד כבשים (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> לוח 2. שילובים של נוגדנים משניים וחופרים נגד מופיע עם מספרים קטלוג וריכוזים.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

וירוסים להדביק תאים לעורר שינויים ספציפיים פונקציות תאים רגילים המשמשים להסיט את האנרגיה והמשאבים לצורך שכפול נגיפי. היבטים רבים של תפקוד התא המארח הם השתלטו על ידי וירוסים, בדרך כלל על ידי ביטוי של מוצרים גנים ויראלי סלולריים לגייס המארחות חלבונים מנגנונים. יתר על כן, וירוסים ספציפיים מהנדס האברונים קרום או תג על מנת שלפוחית ​​ניידים וחלבונים רכב למקד אזורים של התא (בזמן זיהום דה נובו, וירוסים משתלטים חלבונים רכב מולקולריים כדי למקד את הגרעין, לאחר מכן, במהלך הרכבת הנגיף, הם יוכלו לחטוף את הסלולרי מנגנונים שיסייעו באסיפה של וירוסים). פחות מובן כיצד וירוסים, במיוחד אלו עם הגנום RNA, לתאם את הסחר תאיים של חלבונים ושל רכיבים רנ&quot;א וכיצד להשיג הרכבה של חלקיקים זיהומיות בבית לוקוסים ספציפיים בתא. המחקר של לוקליזציה RNA החלה במחקר מוקדם. לפתח אותם האיקריוטים נמוכותbryos תאים עצביים סיפק מידע ביולוגי חשוב, וכן הדגיש את החשיבות של לוקליזציה RNA בתכנות של מפלי ביטוי גנים. מחקר באורגניזמים אחרים ומערכות תאים הניב מידע חשוב דומה. וירוסים הם טפילים המחייבות וחייבים לנצל את התאים המארחות לשכפל. לכן, חשוב להבין כיצד וירוסים RNA לכוון את הגנום שלהם רנ&quot;א מהגרעין, דרך נקבוביות הגרעין, דרך הציטופלסמה ועל לאחד היעדים הסופיים שלה, אל תוך חלקיקי וירוס צאצאי 1. דגים משמש ככלי יעיל לזיהוי שינויים לוקליזציה היציב של רנ&quot;א נגיפי. בשילוב עם immunofluorescence (IF) ניתוח 22, דגים / אם שיתוף ניתוחים יספק מידע על איתור משותף של חלבונים עם RNA ויראלי 3. ניתוח זה ולכן מהווה נקודת התחלה טובה לבדוק RNA אינטראקציות חלבון ידי ביוכימי אחר או Biophysicalבדיקות 4.5, מאז לוקליזציה שיתוף כשלעצמו אינו מספיק ראיות כדי להיות בטוח של אינטראקציה. בחקר נגיפי RNA לוקליזציה באמצעות שיטה כמו זו, מידע בשפע כבר זכה בשני אירועים נגיפיים הסלולר רנ&quot;א סחר 6. לדוגמה, HIV-1 מייצר רנ&quot;א בגרעין של תאים נגועים אבל RNA מתורגם רק בציטופלסמה. כאשר חלבון נגיפי המפתח חסר (חזור) 7, דג של רנ&quot;א נגיפי גילה כי לחסום את התרבות הנגיף בשל החזקת של HIV-1 RNA הגנומי בגרעין 8. כאן, אנו מציגים את שיטת ניתוח ויזואלי של RNA הגנומי ויראלי באתרו. השיטה עושה שימוש בדיקה RNA שכותרתו. בדיקה זו נועדה להיות משלים את RNA הגנומי ויראלי. במהלך בסינתזה חוץ גופית של RNA antisense בדיקה, ribonucleotide כי הוא שונה עם digoxigenin (DIG) נכלל במבחנה transcription התגובה. לאחר בדיקה יש הכלאה כדי mRNA המטרה בתאים, לאחר תיוג נוגדנים שלבים (איור 1) יגלה לוקליזציה של ה-mRNA, כמו גם חלבונים בעלי עניין בעת ביצוע דגים / אם.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; (דגים) שיטת ההכלאה פותח כדי לזהות ויזואלית RNA הגנומי ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדיקה הוא עשה עם סגוליות על RNA ויראלי ניתן לזהות באמצעות שילוב של הכלאה וטכניקות immunofluorescence. טכניקה זו מציעה את היתרון של זיהוי לוקליזציה של רנ&quot;א נגיפי או דנ&quot;א על ​​המצב היציב, מתן מידע על שליטה של ​​אירועים הסחר תאיים וירוס.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.5K Views.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. הקרינה באתרו (דגים) שיטת ההכלאה פותח כדי לזהות ויזואלית RNA הגנומי ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדיקה הוא עשה עם סגוליות על RNA ויראלי ניתן לזהות באמצעות שילוב של הכלאה וטכניקות immunofluorescence. טכניקה זו מציעה את היתרון של זיהוי לוקליזציה של רנ"א נגי...

Video: Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell level to detect the spatial dynamics of RNA localization with simultaneous insight into the localization of proteins, epigenetic modifications and other details which can be highlighted by immunofluorescence. X-chromosome inactivation is a paradigm for long non-coding RNA (lncRNA)-mediated gene silencing. X-inactive specific transcript (Xist) lncRNA accumulation (called an Xist cloud) on one of the two X-chromosomes in mammalian females is a critical step to initiate X-chromosome inactivation. Xist RNA directly or indirectly interacts with various chromatin-modifying enzymes and introduces distinct epigenetic landscapes to the inactive X-chromosome (Xi). One known epigenetic hallmark of the Xi is the Histone H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) modification. Here, we describe a simple and quick immuno-FISH protocol for detecting Xist RNA using RNA FISH with multiple oligonucleotide probes coupled with immunofluorescence of H3K27me3 to examine the localization of Xist RNA and associated epigenetic modifications. Using oligonucleotide probes results in a shorter incubation time and more sensitive detection of Xist RNA compared to in vitro transcribed RNA probes (riboprobes). This protocol provides a powerful tool for understanding the dynamics of lncRNAs and its associated epigenetic modification, chromatin structure, nuclear organization and transcriptional regulation.

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

המהיר פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

זיהוי של רנ"א נגיפי על ידי הקרינה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט

הר כולו RNA פלורסנט

רנ"א

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה

DNA-RNA בשילוב פלורסנט

המהיר פלורסנט

שיטה פשוטה DNA הקרינה