Questo lavoro è stato finanziato dall'Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.

1. Sospensione a cella singola dal campione di glioblastoma chirurgico fresco per la coltura della neurosfera
<ol><li>Con il consenso scritto dei pazienti e in conformità con le linee guida istituzionali, raccogliere campioni di tumore per la coltura cellulare immediatamente dopo l'intervento di resezione di glioma di alta qualità.</li>
	<li>Confermare la diagnosi del campione tumorale per istopatologia. Trasportare immediatamente il campione dalla sala operatoria alla cappa di coltura del tessuto a flusso laminare, per la lavorazione entro 1 ora dall'intervento chirurgico. NOTA: Per gli interventi chirurgici in un sito remoto, tagliare il campione tumorale in frammenti più piccoli e posizionarlo in un tubo contenente DMEM / F12 (tenere sul ghiaccio). Il tumore può essere elaborato diverse ore dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>A partire da 200-500 mg di tessuto (ottimale), tritare il campione tumorale utilizzando una lama bisturi e trasferirlo in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di mezzo privo di siero DMEM /F12. Mescolare invertendo più volte, lasciare che il tumore pezzi sedimentare per gravità, rimuovere il mezzo e ripetere se necessario.</li>
	<li>Preparare la soluzione di dissociazione enzimatica dei tessuti e interrompere la soluzione fresca.<ol>
<li>Soluzione di dissociazione enzimatica dei tessuti: 5 ml 0,05% tripparina-EDTA, 2,5 ml di soluzione di sale bilanciato di Hank (HBSS) priva di calcio e magnesio, soluzione di calcio e magnesio collagenasi IV da 2,5 ml (2.000 U/ml in HBSS con calcio e magnesio).</li>
		<li>Soluzione di arresto: 5 ml Soluzione di inibitore della tripparina, 5 ml DMEM/F12, 2 μl di 5.000 U/ml DNAse I (realizzata in HBSS senza calcio e magnesio).</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere il mezzo e aggiungere la soluzione di dissociazione enzimatica dei tessuti al campione di tumore tritato, utilizzando 2 ml per ogni tessuto da 0,5 g. Mescolare delicatamente invertendo.</li>
	<li>Incubare il tessuto in soluzione a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale in rotazione per 30 minuti.</li>
	<li>Triturato con una pipetta da 2 ml e interrompere la digestione o tornare all'incubatore per un'altra incubazione di 15-30 minuti a seconda del livello di digestione.</li>
	<li>Interrompere la digestione aggiungendo 2 volumi di Stop Solution e triturare meccanicamente con una pipetta sierologica da 5 ml.</li>
	<li>Filtrare il materiale non digerito attraverso un colino cellulare da 40 μm. Pellettizzare le celle a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, seguita dal lavaggio 3x in 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspend il pellet di cellule finali in 5 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Stratare lentamente la sospensione cellulare oltre 5 ml di linfolita-M e pellet a 1.300 x g per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire lo strato di interfaccia contenente le cellule nucleate in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di DMEM/F12.</li>
	<li>Pellettizzare le celle a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio con DMEM/F12 2 volte di più.</li>
	<li>Crioconservare le singole cellule risultanti per un ulteriore utilizzo rimescolando il pellet nel mezzo di congelamento delle cellule di recupero, aliquota in criooviali, congelamento lento e conservazione in azoto liquido.</li>
	<li>Per la coltura, resospendare le cellule in Neurosphere Medium integrato con fattori di crescita (NMGF) e piastra a densità relativamente bassa (<1 x 105 cellule / ml) in un normale pallone di coltura tissutale T25 in condizioni standard, 5% CO2, 37 °C, incubatore di coltura tissutale umidificato(Figura 1A).<ol>
<li>Preparare NMGF utilizzando la seguente ricetta<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">Per 500 ml di DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Soluzione stock</td>
					<td>volume</td>
					<td>concentrazione finale</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Supplemento N2 (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Soluzione di 250 mg/ml di BSA</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml Reagente gentamicina</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibiotico/antimicotico</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml FEG</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire le neurosfere che si formano nell'ordine di 1-3 settimane (Figure 1B-E) in fiasche fresche, per separarsi da cellule e detriti attaccati. Eseguire modifiche parziali dei supporti ogni 3-4 giorni. NOTA: Se si dissocia il tumore dello xenograft ortotopico utilizzando il protocollo precedente, i passaggi 1.11-1.13 possono essere omessi.</li>
</ol>2. Glioblastoma Neurosphere Culture Maintenance e Downstream Applications
<ol><li>
Dissociazione: Monitorare le colture della neurosfera ed eseguire cambiamenti medi parziali ogni 3-4 giorni. Quando la maggior parte delle neurosfere multicellulari nel pallone raggiunge i 100 μm di diametro, dissociarsi in una singola sospensione cellulare:<ol>
<li>Trasferire il mezzo contenente le neurosfere in un tubo da 15 ml, sedimentare la gravità le neurosfere per circa 5 minuti, rimuovere il mezzo e rimpiorsi il pellet cellulare in 10 ml di DPBS privo di calcio e magnesio.</li>
		<li>Mescolare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, poiché le cellule sedimentano per gravità.</li>
		<li>Rimuovere 7-8 ml di DPBS, quindi dissociare meccanicamente le neurosfere con una pipetta sierologica prematistetta.</li>
		<li>Pellettizzare le cellule dissociate a 800 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging: Rimospendare le cellule dissociate (fase 2.1.) in NMGF e dividersi nel numero necessario di fiasche (1:3) e incubare in condizioni standard. Si formeranno neurosfere secondarie, e dovrebbero essere successivamente dissociate per la formazione di sfere terziarie.</li>
	<li>
Valutazione dell'autori ricambioa lungo termine : Ripetere la procedura di dissociazione fino a quando la coltura della neurosfera raggiunge almeno 10 passaggi, equivalenti ad un minimo di 2 mesi in coltura.</li>
	<li>
Congelamento: Per crioconservare le neurosfere, dissociare le neurosfere (fase 2.1.) e rimescolare il pellet cellulare nel mezzo di congelamento cellulare di recupero, aliquota nei criooviali, congelamento lento e conservazione in azoto liquido.<ol>
<li>Per coltura di cellule della neurosfera da uno stock congelato: scongelare le cellule a 37 °C e trasferirsi immediatamente in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di DMEM/F12. Mescolare delicatamente il tubo e quindi far girare le celle a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Lavare il pellet cellulare ancora una volta e rimorsi le cellule in NMGF e trasferirlo in un pallone di coltura tissutale T25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sospensione cellulare per impianto intracraniale in topo immunocompromito:<ol>
<li>Dissociare le neurosfere (fase 2.1.) e rimorsi il pellet cellulare in DPBS privo di calcio e magnesio. Contare le cellule vitali usando un emocitometro e l'esclusione blu del tripano.</li>
		<li>Calcolare il numero di cellule necessarie per l'impianto, in genere 3 x10 5 cellule/mouse, trasferire il numero desiderato di cellule in una fiala e pelletare le cellule a 1.000 x g.</li>
		<li>Rimescolare il pellet cellulare in un volume appropriato per l'impianto (5 μl/mouse) toccando delicatamente il tubo di microcentrifugo. Posizionare la sospensione cellulare sul ghiaccio e utilizzarla entro 2 ore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Protocollo alternativo per la coltura delle cellule del glioblastoma tumorigenico (per i casi in cui la coltura della neurosfera fallisce)
<ol><li>Integrare il mezzo NMGF con siero bovino fetale ad una concentrazione finale del 2% FBS/NMGF.</li>
	<li>
A partire dalle cellule in coltura NMGF: Raccogliere cellule vitali dal pallone NMGF (Figura 1F), resopendire in FBS/NMGF al 2% e piastra a densità relativamente bassa (<1 x 105 cellule/ml) in un normale pallone da coltura tissutale T25 e coltura in condizioni standard, 5% CO2, 37 °C, incubatrice di coltura tissutale umidificata(figura 1G).</li>
	<li>
A partire da cellule congelate mai coltivate (fase 1.14.): Scongelare le cellule, lavare in mezzo e piastra senza siero in FBS/NMGF al 2% e coltura come descritto nel passaggio 3.2. Coltivare in NMGF per 3 giorni prima di trasferire cellule vitali al 2% di FBS/NMGF è un'alternativa per preselezionare le cellule differenziate.</li>
</ol>4. Analisi morfologica e molecolare delle neurosfere mediante immunoistochimica
<ol><li>Coltura delle neurosfere fino a quando la maggior parte degli sferoidi multicellulari galleggianti raggiungono i 100 μm di diametro.</li>
	<li>Rimuovere i contenitori di coltura dall'incubatrice e pelletare immediatamente le neurosfere, rimuovere il mezzo e aggiungere 10 ml di DPBS senza disturbare il pellet. Rimuovere DPBS, resuspend in formalina tamponata neutra al 10% e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pellettizzare gli sferoidi, resopendire in etanolo al 30% e incubare per 30-45 min.</li>
	<li>Sostituire il 30% di etanolo con il 50% di etanolo, incubare per 15 minuti e sostituire con etanolo fresco al 50%, incubare altri 30 minuti.</li>
	<li>Ripetere (fase 4.4.) con 70% di etanolo.</li>
	<li>Sostituire con il 95% di etanolo due cambi 10-20 min ciascuno, e ripetere con etanolo assoluto fino a quando gli sferoidi sono bianchi brillanti e condensati.</li>
	<li>Creare un piccolo cono di carta da filtro dalla carta dell'obiettivo e posizionarlo in un piccolo imbuto in un becher. Bagnare la carta dell'obiettivo con alcol assoluto.</li>
	<li>Allentare leggermente il pellet con etanolo fresco al 100%, versare l'etanolo in eccesso e versare gli sferoidi attraverso il cono di carta dell'obiettivo, assicurandosi che vadano sulla punta del cono. Risciacquare il tubo con etanolo assoluto aggiuntivo e versare eventuali sferoidi rimanenti attraverso il cono di carta dell'obiettivo.</li>
	<li>Rimuovere il cono di carta dall'imbuto e spostare con cura gli sferoidi nella parte inferiore del cono. Piegare la carta in un quadrato e assicurarsi che gli sferoidi siano racchiusi nel modo più sicuro possibile.</li>
	<li>Trasferire le neurosfere confezionate su una cassetta e trasferirli su un processore automatico di tessuti.</li>
	<li>Programmare il processore automatico dei tessuti come segue: etanolo assoluto, 10 min, xilene, 15 min (2x), paraffina, 10 min (4x).</li>
	<li>Rimuovere la cassetta dal processore e posizionarla sulla parte riscaldata di un sistema di incorporamento di paraffina . Assicurarsi che l'intera superficie sia priva di frammenti, polvere o altri detriti e sifonare tutta la paraffina dai pozzi di riscaldamento delle forcep. Pulisci le forcep senza paraffina pulita e aggiungi una piccola quantità di paraffina a uno stampo di base riscaldato.</li>
	<li>Aprire la cassetta, rimuovere il pacchetto e posizionarlo sulla parte riscaldata del sistema di incorporamento. Aprire con cura il cono di carta fino a quando gli sferoidi non sono visibili. Raccogliere il maggior parte del materiale possibile con forcep prebellici e trasferirlo nella paraffina liquida nello stampo di base.</li>
	<li>Ripetere il più possibile per recuperare il maggior numero possibile di sferoidi. Raschiare delicatamente la carta velina con una lama di rasoio pulita prebellita che è stata pulita con etanolo per raccogliere eventuali sferoidi residui senza ottenere carta nel blocco.</li>
	<li>Rompere con cura eventuali ciuffi sferoidi con forceps calde. Allontanate gli sferoidi dagli angoli in uno strato centrale uniforme. Spostare lo stampo di base nell'area di raffreddamento per fissare gli sferoidi in posizione, aggiungere la cassetta, riempire lentamente con paraffina e raffreddare accuratamente.</li>
	<li>Il blocco di paraffina della neurosfera può essere utilizzato per la normale sessazione e immunoistochimica.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li><li>Ignatova, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Leder, K., Holland, E. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells.">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Una corretta dissociazione enzimatica delle cellule tumorali è un passo critico in questo protocollo. Il tessuto deve essere tritato ben prima dell'incubazione in soluzione di dissociazione cellulare a 37 °C in rotazione, per un minimo di 30 minuti, quando il tessuto deve essere triturato meccanicamente e l'estensione della dissociazione verificata. A seconda del grado di coesione tissutale, l'incubazione può essere estesa per ulteriori 15-30 minuti, se necessario per completare la dissociazione in singole cellule. L'incubazione in soluzione di dissociazione per più di 1 ora non è raccomandata a causa della diminuzione della vitalità cellulare. Sebbene la quantità ottimale di tessuto iniziale sia di 200-500 mg, questo protocollo ha portato a colture di neurosfera di successo da appena 50 mg di tessuto tumorale.
L'NMGF privo di siero è un mezzo selettivo e una percentuale di cellule neoplastiche che comprendono la maggior parte del tumore, così come le cellule ospiti, non sopravviverà, mentre altre si attaccheranno al pallone trattato con coltura tissutale dopo la placcatura. È fondamentale che le neurosfere che si formeranno nell'corso di 1-3 settimane (Figure 1B-E) siano trasferite a fiasche fresche, per separarsi da cellule tumorali differenziate e detriti.
Le cellule GBM enzimaticamente dissociate e mai coltivate (fase 1.10) possono essere crioconservate come fonte di backup di cellule da coltura in mezzi alternativi, nel caso in cui la coltura della neurosfera fallisca. Abbiamo ottenuto con successo colture di neurosfera da tali stock congelati, così come cellule monostrato che crescono nel 2% FBS / NMGF.
Concettualmente, "cellula staminale tumorale" è un lavoro in corso e questo campo emergente beneficerà di ulteriori chiarimenti, poiché le implicazioni cliniche sono considerevoli, in particolare nella generazione di eterogeneità tumorale, plasticità e resistenza alla terapia19,20. Oltre ad essere vitali per generare modelli animali GBM specifici del paziente, le colture della neurosfera sono preziose anche per studi in vitro come l'alterazione della segnalazione cellulare e l'espressione genica in risposta a fattori di crescita, ipossia e agentifarmacologici 11,21. Abbiamo optato per l'utilizzo di sezioni trasversali di neurosfere fisse e paraffina incorporate, preservando l'architettura 3D, per studiare l'espressione proteica e le modifiche post-trascilizionali mediante immunoistochimica11,grazie alla localizzazione subcellulare superiore in relazione al metodo più comune di etichettatura e imaging dell'intera sfera.
È stato dimostrato che non tutte le cellule all'interno delle neurosfere derivate dal cervello adulto dei mammiferi sono cellule staminali22. Allo stesso modo, le neurosfere coltivate da tumori GBM probabilmente non clonali, a causa della presenza di cellule progenitrici tumorali più differenziate e dell'auto-aggregazione, nota per verificarsi ad alte densitàcellulari 23, che è considerata una limitazione di questo metodo da parte di alcuni. Per favorire l'arricchimento per cellule staminali autoreno rinnovarsi a lungo termine, al contrario dei soli progenitori che possono crescere transitoriamente come neurosfere22, le neurosfere primarie sono dissociate per la formazione della neurosfera secondaria e ulteriormente passageate per un minimo di 10 passaggi, approssimativamente equivalenti a 2 mesi in coltura continua, che è un'indicazione di una popolazione arricchita in cellule staminali22. Nella nostra esperienza, le culture della neurosfera GBM che raggiungono questo marchio possono continuare ad essere espanse come neurosfere indefinitamente. Il grado tumorale è importante, dal momento che abbiamo ottenuto culture di successo da GBM e astrocitomi anaplastici, rispettivamente di grado IV e III dell'OMS, ma non da gliomi di grado inferiore.
Il metodo più prevalente di coltura delle cellule del glioblastoma, nel mezzo di crescita tradizionale integrato con FBS al 10%, porta a notevoli divergenze genomiche e fenotipiche rispetto ai tumori originali 4. D'altra parte, le colture della neurosfera sono una fonte stabile e a lungo termine di cellule che presentano fenotipo 4 delle cellulestaminali tumorali. Il metodo della neurosfera è diventato sempre più popolare per l'arricchimento del CSC in colture a lungo termine per modelli di xenograft di topo ortotopico, nonostante non abbia avuto successo per tutti i campioni di astrocitoma di alto grado, che rappresenta la principale debolezza di questo metodo. Sono in corso studi per capire come le caratteristiche molecolari dei tumori parentali possano influenzare la formazione della neurosfera. Viene concessa l'esplorazione di metodi alternativi pratici alla cultura di gliomi di alto livello, seguiti da un'ampia convalida, dati i vantaggi epocali di avere modelli GBM specifici per il paziente, mentre avanziamo in un'era di medicina personalizzata, alimentata dall'accessibilità di informazioni "omiche" e dall'aumento del numero di potenziali terapie mirate.

Il glioblastoma (GBM), un astrocitoma di IV grado dell'OMS, è il tumore al cervello primario più diffuso e aggressivo. Diversi fenotipi dello sviluppo sono adottati dalle cellule tumorali GBM, comprese le cellule che presentano caratteristiche di "cellule staminali tumorali" (CSC), come l'espressione di marcatori di cellule staminali neurali (NSC), l'autorinnoto a lungo termine e il potenziale di dare origine a cellule più differenziate che esprimono marcatori astrocitici e formano la maggior parte del tumore1-3. Sebbene sia ancora necessario chiarire l'identità molecolare del CSC e le implicazioni cliniche, il lavoro attuale si concentra sulla definizione operativa del CSC: autorinoto a lungo termine in vitro e capacità di differenziare e riprodurre il tumore originale su impianto ortotopico nei roditori immunocompro compromessi.
Le cellule di glioblastoma sono state coltivate per decenni in mezzo tradizionale contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e diverse linee cellulari GBM coltivate a siero ad alto passaggio disponibili in commercio sono cancerogene nei roditori immunocompromanti, ma c'è una notevole divergenza genomica e molecolare rispetto al tumoreoriginale 4,limitandone l'uso come modelli clinicamente rilevanti. Più recentemente, le cellule con fenotipo staminali/progenitore reattive all'EGF e bFGF sono state identificate nei GBM2. Successivamente, campioni di tumore GBM dissociati sono stati coltivati in un mezzo 3 privo di siero, originariamente formulato per la selezione el'espansionedelle cellule staminali neurali dal cervello di mammiferi adulti5. Queste condizioni di coltura ostacolano la crescita della maggior parte delle popolazioni di cellule tumorali non neoplastiche e differenziate, favorendo al contempo la crescita delle cellule staminali e progenitrici come sferoidi multicellulari galleggianti, o neurosfere3, imitando il comportamento delle cellule staminali neurali dei mammiferi adulti5. Il confronto completo fianco a fianco delle cellule primarie GBM coltivate in mezzo alla neurosfera integrato con fattori di crescita (NMGF) o nel mezzo di crescita tradizionale integrato con FBS al 10%, ha rivelato che le neurosfere GBM erano cancerogene, presentavano un potenziale di differenziazione multilinea e preservavano il genotipo del tumore originale, in contrasto con le colture FBS al 10% che non erano tumorigeniche a passaggi bassi e si differenziavano considerevolmente dai tumori originali ai passaggi4.
L'isolamento del CSC dai tumori GBM dissociati mediante smistamento cellulare basato sull'espressione del marcatore CSC putativo CD133 è stato propostoanche 6,7, ma ulteriori lavori hanno indicato che il fenotipo CSC non è definitivamente associato all'espressionedi tali marcatori 8-10, diminuendo l'entusiasmo iniziale per questa strategia, mentre nuovi marcatori sono ancora in fase di test10. L'indisponibilità fino ad oggi di un insieme convalidato di marcatori che definiscono il CSC, insieme all'obiettivo di amplificazione su larga scala di queste cellule per studi preclinici, rende impraticabile l'uso dello smistamento cellulare per colture arricchite da CSC di routine. Le cellule GBM selezionate dalla capacità di crescere come neurosfere nel NMGF esprimono invariabilmente marcatori di cellule staminali neurali. Abbiamo osservato che sox2 e nenina sono onnipresentemente espressi nelle colture della neurosfera, mentre la proteina CD133 è presente in un sottoinsieme delle neurosfere GBM (dati inediti e riferimento11).
Diversi laboratori stanno perseguendo colture di neurosfera da tumori del glioblastoma utilizzando lo stesso approccio generale di dissociazione enzimatica e coltura in mezzo privo di siero integrato confattori di crescita 3,4,11-14, mentre altri colleghi hanno segnalato tentativi di far crescere colture di neurosfera a lungo termine da campioni GBM senza successo . Il metodo generale per la dissociazione enzimatica e la cultura della neurosfera dei gliomi di alta qualità qui presentati è simile a quello delineato nelle pubblicazioni di cui sopra. Abbiamo ottimizzato il protocollo in base alla nostra esperienza di dissociazione e coltivazione di oltre 100 campioni GBM. L'efficienza di ottenere colture di neurosfera a lungo termine da campioni gbm freschi applicando il protocollo qui presentato è superiore al 40%, simile ai pochi rapporti che mostrano dati diefficienza 3,15,portando all'esplorazione di protocolli alternativi come la coltivazione continua o intermittente di cellule in mezzo privo di siero in presenza di EGF e bFGF come monostrati su superfici rivestite con proteina ECM16,17. Le colture della neurosfera sono ancora l'approccio più convalidato e sempre più popolare per preservare le caratteristiche molecolari dei tumori GBM e il potenziale tumorigenico3,4,11-14, quindi il nostro approccio è quello di tentare prima le colture di neurosfere, mentre testa concomitante metodi alternativi per coltivare cellule GBM che non riescono a formare neurosfere autoreno rinnovarsi a lungo termine ( Figura 1 ), per aumentare larappresentazionedei tumori GBM che possono essere utilizzati nei modelli animali. Qui presentiamo un protocollo per la coltivatorie delle neurosfere dai GBM. Per le cellule che non riescono a formare neurosfere, mostriamo una semplice modifica nel mezzo di crescita, come primo tentativo di coltura di cellule tumorigeniche da nonneurosfera formando GBM, con risultati promettenti e ancora in fase di ampia convalida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin - EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14170-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type 4</td>
			<td style="width:143px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Albumin from Bovine Serum, cell culture grade</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lympholyte-Mouse</td>
			<td style="width:143px;">Cedarlane Laboratories Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">CL5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:143px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histoplex Tissue Cassettes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-146-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#160;Supplement</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KnockOut D-MEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stem Pro Neural Supplement&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>A1058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in  clinically relevant animal models and 3d immunochemistry

I glioblastomi, la forma più comune e aggressiva di astrocitoma, sono refrattari alla terapia e molecolarmente eterogenei. La capacità di stabilire colture cellulari che preservano il profilo genomico dei tumori parentali, da utilizzare in modelli specifici per pazienti in vitro e in vivo, ha il potenziale per rivoluzionare lo sviluppo preclinico di nuovi trattamenti per il glioblastoma su misura per le caratteristiche molecolari di ogni tumore.
A partire da nuovi tumori dell'astrocitoma di alto grado dissociati in singole cellule, usiamo il saggio della neurosfera come metodo di arricchimento per le cellule che presentano fenotipo delle cellule staminali tumorali, compresa l'espressione di marcatori di cellule staminali neurali, l'autorinnoto a lungo termine in vitroe la capacità di formare tumori xenograft ortotopici. Questo metodo è stato precedentemente proposto ed è ora in uso da diversi investigatori. Sulla base della nostra esperienza di dissociazione e coltivazione di 125 esemplari di glioblastoma, siamo arrivati al protocollo dettagliato che presentiamo qui, adatto per la ristrutturazione di routine della neurosfera di astrocitomi di alto grado e l'espansione su larga scala di cellule tumorali per studi preclinici. Riferiamo sull'efficienza delle colture di successo a lungo termine utilizzando questo protocollo e suggeriamo alternative convenienti per coltivare cellule di glioblastoma dissociate che non riescono a crescere come neurosfere. Descriviamo inoltre in dettaglio un protocollo per preservare l'architettura 3D delle neurosfere per l'immunoistochimica. Le colture cellulari arricchite in CSC, in grado di generare modelli di xenograft ortotopici che preservano le firme molecolari e l'eterogeneità dei GBM, stanno diventando sempre più popolari per lo studio della biologia dei GBM e per il miglioramento della progettazione di test preclinici di potenziali terapie.

Abbiamo applicato il protocollo sopra descritto per dissociare e coltura 125 campioni di glioblastoma chirurgico fresco (Figura 1), 88 nuovi diagnosticati e 37 tumori ricorrenti (Tabella 2), con consenso del paziente approvato e secondo le linee guida istituzionali. L'efficienza del protocollo per la creazione di colture di neurosfera a lungo termine era del 41,6%, e simile per i tumori di nuova diagnosi e i tumori ricorrenti (Tabella 2). Per alcuni campioni di GBM, le neurosfere si formano nei primi giorni(figure 1B e 1C), mentre per altri è richiesto un tempo di culto più lungo(figure 1D e 1E).
L'efficienza della formazione della neurosfera non dipendeva esclusivamente dal livello di necrosi nel tessuto, come esemplificato dai risultati di un tumore di nuova diagnosi ad alta densità cellulare (GBM1) e di un tumore ricorrente e necrotico (GBM2) elaborato secondo i protocolli 1 e 2, entrambi che producono colture di neurosfera(Figura 2).
Testare il potenziale tumorigenico di ogni coltura della neurosfera nei topi immunocompropati è la convalida cruciale di questo approccio per l'arricchimento dei CSC. Utilizzando un protocollo simile alle neurosfere18, GBM1 e GBM2 precedentemente descritte sono state impiantate nel cervello di topi immunocompropati, secondo linee guida istituzionali e iacuc per la cura degli animali. I tumori xenograft presentano caratteristiche morfologiche dei GBM, come l'invasione nel parenchima cerebrale e la necrosi (Figura 2).
Gbm3 è stato dissociato (Figura 1A) e coltivato in mezzo alla neurosfera (figure 1D e 1E), e nel 2% FBS/NMGF(Figure 1D, 1G e 1H). Le cellule monostrato coltivate nel 2% di FBS/NMGF e le cellule della neurosfera coltivate in NMGF sono state dissociate e lo stesso numero di cellule sono state impiantate nel topo nudo, utilizzando la stessa procedura della figura 2. Non sono state osservate differenze nella sopravvivenza, nelle dinamiche di crescita tumorale o nella morfologia tra i due metodi di coltura preimpianto (Figure 3A-C). Le caratteristiche di crescita tumorale non cambiano fino all'ultimo passaggio testato, P20 per le neurosfere e P10 per il 2% FBS / NMGF. Mentre i marcatori di cellule staminali neurali, incluso Sox2, sono downregolati nella maggior parte delle cellule GBM primarie coltivate in FBS 3,4,11del 10%, NMGF integrato con FBS al 2% consente la ritenzione dell'espressione Sox2(Figura 3D).
Le neurosfere sono state elaborate secondo il protocollo 4 ed etichettate con anticorpi H&E (Figura 4A), anti-Sox2, che mostrano la localizzazione nucleare (Figura 4B) e anticorpi EGFR, localizzazione della membrana cellulare (Figura 4C). Questo protocollo è stato applicato per accedere ad alterazioni dipendenti dagli stimoli nell'espressione di annidcina, GFAP e il marcatore di proliferazione Ki6711.
La tabella 2. Efficienza nel ricavare culture della neurosfera autoreno rinnovarsi a lungo termine dai GBM.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Patologia</td>
			<td>N</td>
			<td>Percentuale di campioni che producono neurosfere autorenonti a lungo termine (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - non trattato, primo intervento chirurgico</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - ricorrente</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>totale</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Figura 1. Coltura cellulare da campioni chirurgici di glioblastoma fresco. I tumori freschi vengono dissociati enzimaticamente in singole cellule. L'interfaccia cellulare nucleata dal mezzo di separazione della densità viene quindi placcata in NMGF. Le neurosfere dissociate sono placcate in NMGF, e tipicamente 1 giorno dopo la placcatura ci sono cellule morte, detriti, singole cellule attaccate e occasionali cellule divisorie in sospensione (A). La formazione della neurosfera è più veloce per alcuni casi (B,C) e più lenta per altri (D,E). Tutte le neurosfere sono dissociate e ritraslate per almeno 10 passaggi, il 41,6% dei GBM produce neurosfere autoreno rinnovarsi a lungo termine. Le cellule dissociate GBM vitali che non riescono a crescere come neurosfere (F) possono essere trasferite in condizioni di coltura alternative, ad esempio 2% FBS/NMGF (G,H). La barra (A), 100 μm, si applica a tutte le immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Figura 2. Generazione di neurosfera e xenografti di topo ortotopici da tumori GBM. Un campione tumorale ad alta densità cellulare (GBM1) e un tumore ad alto contenuto necrotico (GBM2) sono stati dissociati e le neurosfere coltivate per 10 passaggi secondo i protocolli 1 e 2. I topi immunocompromessi sono stati impiantati con 3 x 105 cellule della neurosfera dissociate e sacrificati quando moribondo. I cervelli del topo erano fissi di formalina e la paraffina incorporata per la colorazione H&E e il rilevamento immunoistochimica di marcatori umani, mitocondri umani (hMit) o subunità di istocompatibilità principale HLA-A (MHC-I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Figura 3. Crescita tumorale simile nei topi impiantati per via intracranici con cellule GBM3 coltivate come neurosfere in NMGF o come monostrati nel 2% FBS/NMGF. (A) Le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier per GBM3 coltivate come neurosfere in NMGF o monostrati nel 2%FBS/NMGF (entrambi passaggi <10) non mostrano alcuna differenza di sopravvivenza (n=10, p=0,7174, test di log-rank). (B) La crescita tumorale monitorata dall'imaging a bioluminescenza viva (BLI) non mostra alcuna differenza significativa nelle dinamiche di crescita tumorale tra i due gruppi. (C) La morfologia tumorale è indistinguibile per 4 xenoinnesti GBM3, 2 coltivati in NMGF e 2 coltivati nel 2% FBS/NMGF. Macchia MHC-I come descritto per la figura 2. Scala, 600 μm. (D) Macchia occidentale che mostra l'espressione sox2 del produttore di cellule staminali mantenuta nelle colture FBS/NMGF al 2% utilizzate per avviare i tumori xenograft (A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Figura 4. Analisi dell'espressione proteica nelle sezioni della neurosfera mediante immunoistochimica. Le colture della neurosfera erano fisse come la formalina e la paraffina incorporata come descritto nella procedura 4, e macchiata con anticorpi H&E (A), anti-Sox2 (B) e anti-EGFR (C). Il substrato DAB è stato utilizzato per visualizzare (B,C). Bar, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>

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Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

optimization-high-grade-glioma-cell-culture-from-surgical-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K Views.  Henry Ford Hospital. Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.