Este trabalho foi financiado pelo Centro de Tumores Cerebrais Hermelin, Hospital Henry Ford.

1. Suspensão celular única do espécime glioblastoma cirúrgico fresco para a cultura da neurosfera
<ol><li>Com consentimento por escrito dos pacientes e de acordo com as diretrizes institucionais, colete amostras de tumores para cultura celular imediatamente após a cirurgia de ressecção de glioma de alto grau.</li>
	<li>Confirme o diagnóstico da amostra de tumor pela histopatologia. Transporte imediatamente o espécime da sala de operação para a capa de cultura de tecido de fluxo laminar, para processamento dentro de 1 hora da cirurgia. NOTA: Para cirurgias em um local remoto, corte a amostra de tumor em fragmentos menores e coloque em um tubo contendo DMEM/F12 (mantenha no gelo). O tumor pode ser processado várias horas após a cirurgia.</li>
	<li>Começando com 200-500 mg de tecido (ótimo), pique a amostra do tumor usando uma lâmina de bisturi, e transfira para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de ml de meio livre de soro DMEM/F12. Misture invertendo várias vezes, deixe que os pedaços tumorais sedimentem por gravidade, removam o meio e repitam conforme necessário.</li>
	<li>Prepare a solução de dissociação de tecido enzimático e stop solution fresco.<ol>
<li>Solução de Dissociação de Tecidos Enzimáticos: 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA, 2,5 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) solução de cálcio e magnésio, 2,5 ml Solução de estoque de colagenase IV (2.000 U/ml em HBSS com cálcio e magnésio).</li>
		<li>Solução stop: solução inibidora de trypsin de 5 ml, 5 ml DMEM/F12, 2 μl de 5.000 U/ml DNAse I (fabricada em HBSS sem cálcio e magnésio).</li>
	</ol></li>
	<li>Remova o meio e adicione solução de dissociação de tecido enzimático à amostra de tumor picado, utilizando 2 ml para cada tecido de 0,5 g. Misture suavemente invertendo.</li>
	<li>Incubar o tecido em solução a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidual em rotação por 30 minutos.</li>
	<li>Triturar com uma pipeta de 2 ml e parar a digestão ou retornar à incubadora para outra incubação de 15-30 min, dependendo do nível de digestão.</li>
	<li>Pare a digestão adicionando 2 volumes de Stop Solution e triturar mecanicamente com uma pipeta sorológica de 5 ml.</li>
	<li>Filtre o material não digerido através de um coador de células de 40 μm. Pelota as células a 800 x g para 5 min na temperatura da sala, seguida pela lavagem de 3x em 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspense a última pelota celular em 5 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Camada lenta da suspensão celular acima de 5 ml de Linfolito-M e pelota a 1.300 x g por 20 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira a camada de interface contendo as células nucleadas para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de DMEM/F12.</li>
	<li>Pelota as células a 800 x g por 5 min a temperatura ambiente. Repita a lavagem com DMEM/F12 2x a mais.</li>
	<li>Criopreserve as células únicas resultantes para uso posterior, reutilizando a pelota no Meio de Congelamento de Células de Recuperação, aliquoting em criovias, congelamento lento e armazenamento em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Para a cultura, resuspenque as células em Neurosphere Medium suplementada com Fatores de Crescimento (NMGF), e placa em densidade relativamente baixa (<1 x 105 células/ml) em um frasco regular de cultura tecidual T25 sob condições padrão, 5% CO2, 37 °C, incubadora de cultura tecidificada(Figura 1A).<ol>
<li>Prepare o NMGF usando a seguinte receita<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">Por 500 ml de DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Solução de estoque</td>
					<td>volume</td>
					<td>concentração final</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Suplemento N2 (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Solução de estoque BSA de 250 mg/ml</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Reagente gentamicina de 10 mg/ml</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibiótico/antimíctico</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml EGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira neuroesferas que se formam ao longo de 1-3 semanas(Figuras 1B-E) para frascos frescos, para separar de células e detritos anexados. Realize alterações parciais na mídia a cada 3-4 dias. NOTA: Se dissociar o tumor de xenoenxerto ortotópico usando o protocolo acima, as etapas 1.11-1.13 podem ser omitidas.</li>
</ol>2. Manutenção da Cultura da Neurofera glioblastoma e aplicações a jusante
<ol><li>
Dissociação: Monitore as culturas da neurosfera e realize alterações médias parciais a cada 3-4 dias. Quando a maioria das neuroesferas multicelulares no frasco atingir 100 μm de diâmetro, dissocia-se em uma única suspensão celular:<ol>
<li>Transfira o meio contendo as neurosferas para um tubo de 15 ml, sedimento gravitacional as neuroesferas por cerca de 5 minutos, remova o meio e resuspenda a pelota celular em 10 ml de DPBS sem cálcio e magnésio.</li>
		<li>Misture e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, como as células sedimentam por gravidade.</li>
		<li>Remova 7-8 ml de DPBS e dissociar as neurosferas mecanicamente com uma pipeta sorológica pré-enlatado.</li>
		<li>Pelota as células dissociadas a 800 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passagem: Resuspenque as células dissociadas (etapa 2.1.) no NMGF e divida no número necessário de frascos (1:3) e incuba em condições padrão. Neuroesferas secundárias se formarão, e devem ser posteriormente dissociadas para a formação de esferas terciárias.</li>
	<li>
Avaliação da auto-renovaçãoa longo prazo : Repita o procedimento de dissociação até que a cultura da neurosfera atinja pelo menos 10 passagens, o equivalente a um mínimo de 2 meses de cultura.</li>
	<li>
Congelamento: Para criopreservar as neurosferas, dissociar as neurosferas (passo 2.1.) e resuspensar a pelota celular no Meio de Congelamento celular de recuperação, alíquota em criovial, congelamento lento e armazenar em nitrogênio líquido.<ol>
<li>Para cultivar células da neurosfera a partir de um estoque congelado: descongelar as células a 37 °C e transferir imediatamente para um tubo de 15 ml contendo 10 ml DMEM/F12. Misture o tubo suavemente e gire as células a 800 x g por 5 min a 4 °C. Lave a pelota celular mais uma vez e resuspenja as células em NMGF e transfira para um frasco de cultura tecidual T25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Suspensão celular para implante intracraniano em camundongos imunocomprometidos:<ol>
<li>Dissociar as neuroesferas (passo 2.1.) e resuspensar a pelota celular em DPBS livre de cálcio e magnésio. Conte células viáveis usando um hemócito e exclusão azul trypan.</li>
		<li>Calcule o número de células necessárias para o implante, tipicamente 3 x 105 células/rato, transfira o número desejado de células para um frasco e pelota as células a 1.000 x g.</li>
		<li>Resuspenque a pelota celular em um volume apropriado para implante (5 μl/mouse) tocando suavemente o tubo de microcentrifuge. Coloque a suspensão da célula no gelo e use dentro de 2 horas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Protocolo Alternativo para Culturing Tumorigenic Glioblastoma Cells (para os casos em que a cultura da neurosfera falha)
<ol><li>Suplemente o meio NMGF com soro bovino fetal a uma concentração final de 2% FBS/NMGF.</li>
	<li>
Começando com células na cultura NMGF: Colher células viáveis do frasco NMGF(Figura 1F),resuspend em 2% FBS/NMGF e placa em densidade relativamente baixa (<1 x 105 células/ml) em um frasco regular de cultura tecidual T25, e cultura em condições padrão, 5% CO2, 37 °C, incubadora de cultura tecidificada(Figura 1G).</li>
	<li>
Começando com células nunca cultivadas congeladas (passo 1.14.): Descongelar as células, lavar em meio e placa sem soro em 2% FBS/NMGF e cultura como descrito na etapa 3.2. A cultura no NMGF por 3 dias antes de transferir células viáveis para 2% FBS/NMGF é uma alternativa para pré-selecionar células diferenciadas.</li>
</ol>4. Análise morfológica e molecular das neuroesferas por imunohistoquímica
<ol><li>Cultue as neuroesferas até que a maioria dos esferoides multicelulares flutuantes atinjam 100 μm de diâmetro.</li>
	<li>Remova os frascos de cultura da incubadora e pelota imediatamente as neurosferas, remova o meio e adicione 10 ml de DPBS sem perturbar a pelota. Remova o DPBS, resuspend em formalina tamponada 10% neutra e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Pelota os esferoides, resuspense em 30% etanol e incuba por 30-45 min.</li>
	<li>Substitua 30% de etanol por 50% de etanol, incuba por 15 min e substitua por 50% de etanol fresco, incubar mais 30 min.</li>
	<li>Repita (passo 4,4.) com 70% de etanol.</li>
	<li>Substitua por 95% de etanol duas mudanças de 10-20 min cada, e repita com etanol absoluto até que os esferoides sejam brancos brilhantes e condensados.</li>
	<li>Faça um pequeno cone de papel filtro do papel da lente e coloque-o em um pequeno funil em um béquer. Molhe o papel da lente com álcool absoluto.</li>
	<li>Solte ligeiramente a pelota com etanol fresco 100%, despeje o excesso de etanol e despeje os esferoides através do cone de papel da lente, certificando-se de que eles vão para a ponta do cone. Enxágüe o tubo com etanol absoluto adicional e despeje todos os esferoides restantes através do cone de papel da lente.</li>
	<li>Retire o cone de papel do funil e mova cuidadosamente os esferoides para a parte inferior do cone. Dobre o papel em um quadrado e certifique-se de que os esferoides estejam o mais bem incluídos possível.</li>
	<li>Transfira as neuroesferas embaladas para um e transfira para um processador automático de tecido.</li>
	<li>Programe o processador automático de tecido da seguinte forma: etanol absoluto, 10 min, xileno, 15 min (2x), parafina, 10 min (4x).</li>
	<li>Remova o do processador e coloque-o na parte aquecida de um sistema de incorporação de parafina. Certifique-se de que toda a superfície está livre de fragmentos, poeira ou outros detritos e sifão para fora toda a parafina dos poços de aquecimento fórceps. Asseps livres de parafina quente e adicione uma pequena quantidade de parafina a um molde de base aquecido.</li>
	<li>Abra o, remova o pacote e coloque-o na parte aquecida do sistema de incorporação. Abra cuidadosamente o cone de papel até que os esferoides estejam visíveis. Reúna o máximo possível do material com fórceps pré-armados e transfira para a parafina líquida no molde base.</li>
	<li>Repita o necessário para recuperar o maior número possível de esferoides. Raspe suavemente o papel de tecido com uma lâmina de barbear limpa pré-armada que foi limpa com etanol para coletar quaisquer esferoides residuais sem colocar qualquer papel no bloco.</li>
	<li>Quebre cuidadosamente qualquer aglomerado esferoide com fórceps quentes. Mova os esferoides para longe dos cantos em uma camada central uniforme. Mova o molde base para a área de resfriamento para fixar os esferoides no lugar, adicione o, encha lentamente com parafina e esfrie bem.</li>
	<li>O bloco de parafina da neurosfera pode ser usado para secção normal e imunohistoquímica.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li><li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro.">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+implications+of+CD133-positive+and+CD133-negative+cells+in+glioblastomas.">Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas.</a> Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).</li><li>Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSEA-1+is+an+enrichment+marker+for+tumor-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma.</a> Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).</li><li>deCarvalho, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo.">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma.">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li><li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria.">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li><li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours.">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li><li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype.">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li><li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells.">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A dissociação adequada das células tumorais enzimáticas é um passo crítico neste protocolo. O tecido deve ser picado bem antes da incubação na solução de dissociação celular a 37 °C em rotação, por um mínimo de 30 min, quando o tecido deve ser triturado mecanicamente e a extensão da dissociação verificada. Dependendo do grau de coesão tecidual, a incubação pode ser estendida por mais 15-30 minutos, conforme necessário para completar a dissociação em células únicas. A incubação na solução de dissociação por mais de 1 hora não é recomendada devido à diminuição da viabilidade celular. Embora a quantidade ideal de tecido inicial seja de 200-500 mgs, este protocolo levou a culturas neuroferas bem sucedidas de apenas 50 mg de tecido tumoral.
O NMGF sem soro é um meio seletivo, e uma porcentagem de células neoplásicas que compõem a maior parte do tumor, bem como as células hospedeiras, não sobreviverão, enquanto outras se ligarão à cultura tecidual tratada após o revestimento. É fundamental que as neurosferas que se formarão ao longo de 1-3 semanas (Figuras 1B-E) sejam transferidas para frascos frescos, para separar-se das células tumorais e detritos diferenciados.
Células GBM enzimáticamente dissociadas e nunca cultivadas (passo 1.10) podem ser criopreservadas como fonte de backup das células para a cultura em mídia alternativa, caso a cultura da neurosfera falhe. Conseguimos com sucesso culturas da neurosfera a partir de tais estoques congelados, bem como células monocamadas crescendo em 2% FBS/NMGF.
Conceitualmente, "célula-tronco do câncer" é um trabalho em andamento e este campo emergente se beneficiará de esclarecimentos adicionais, uma vez que as implicações clínicas são consideráveis, particularmente na geração de heterogeneidade tumoral, plasticidade e resistência à terapia19,20. Além de serem vitais para a geração de modelos animais GBM específicos do paciente, as culturas da neurosfera também são valiosas para estudos in vitro, como alteração na sinalização celular e expressão genética em resposta a fatores de crescimento, hipóxia e agentes farmacológicos11,21. Optamos por utilizar seções transversais de neuroesferas fixas e parafinas, preservando a arquitetura 3D, para estudar a expressão proteica e modificações pós-translacionais por imunohistoquímica11,devido à localização subcelular superior em relação ao método mais comum de rotulagem e imagem de toda a esfera.
Foi demonstrado que nem todas as células dentro das neurosferas derivadas do cérebro adulto são células-tronco22. Da mesma forma, as neuroesferas cultivadas a partir de tumores GBM provavelmente não são clonais, devido à presença de células progenitoras de câncer mais diferenciadas e auto-agregação, conhecida por ocorrer em altas densidades celulares23, o que é considerado uma limitação desse método por alguns. Para favorecer o enriquecimento de células-tronco auto-renovadoraes de longo prazo, em oposição a apenas progenitores que podem crescer transitoriamente como neuroesferas22, as neurosferas primárias são dissociadas para formação da neurosfera secundária, e ainda mais transitadas por um mínimo de 10 passagens, aproximadamente equivalente a 2 meses em cultura contínua, o que é uma indicação de uma população enriquecida em células-tronco22. Em nossa experiência, as culturas da neurosfera GBM que atingem essa marca podem continuar a ser expandidas como neuroesferas indefinidamente. O grau do tumor importa, uma vez que obtivemos culturas bem sucedidas de GBMs e astrócitos anaplásticos, grau IV e III da OMS, respectivamente, mas não de gliomas de menor grau.
O método mais prevalente de cultivar células de glioblastoma, em meio de crescimento tradicional suplementado com 10% de FBS, leva a considerável divergência genômica e fenotípica dos tumores originais 4. Por outro lado, as culturas da neurosfera são uma fonte estável e de longo prazo de células que apresentam fenótipo de células-tronco cancerosas4. O método da neurosfera tornou-se cada vez mais popular para o enriquecimento do CSC em culturas de longo prazo para modelos de xenoenxerto de rato ortotópico, apesar de não ter sido bem sucedido para todas as amostras de astrocitoma de alto grau, o que representa a principal fraqueza deste método. Estudos para entender como as características moleculares dos tumores parentais podem afetar a formação da neurosfera estão em andamento. A exploração de métodos alternativos práticos para a cultura de gliomas de alto grau, seguidas de ampla validação, dadas as vantagens importantes de ter modelos GBM específicos do paciente, à medida que avançamos para uma era de medicina personalizada, alimentada pela acessibilidade de informações "omics" e aumento do número de potenciais terapias-alvo.

Glioblastoma (GBM), um astrocitoma grau IV da OMS, é o tumor cerebral primário mais prevalente e agressivo. Diversos fenótipos de desenvolvimento são adotados por células tumorais GBM, incluindo células que apresentam características de "células-tronco cancerosas", como a expressão de marcadores de células-tronco neurais (NSC), a auto-renovação a longo prazo e o potencial de dar origem a células mais diferenciadas expressando marcadores astrócitos e formando a maior parte do tumor1-3. Embora ainda seja necessário esclarecimento sobre a identidade molecular do CSC e as implicações clínicas, o foco do presente trabalho está na definição operacional de CSC: autoconexão de longo prazo in vitro e a capacidade de diferenciar e reproduzir o tumor original após implantação ortotópica em roedores imunocomprometidos.
As células glioblastoma têm sido cultivadas por décadas em meio tradicional contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e várias altas passagens comercialmente disponíveis linhas celulares GBM cultivadas são tumorigênicas em roedores imunocomprometidos, mas há considerável divergência genômica e molecular do tumor original4, limitando seu uso como modelos clinicamente relevantes. Mais recentemente, foram identificadas células com fenótipo stem/progenitor responsivo ao EGF e bFGF nos GBMs2. Posteriormente, as amostras de tumorES GBM dissociadas foram cultivadas em um meio livre de soro3, originalmente formulado para a seleção e expansão de células-tronco neurais do cérebro adulto mamífero5. Essas condições culturais dificultam o crescimento da maioria das populações de células tumorais não inoplásticas e mais diferenciadas, ao mesmo tempo em que favorecem o crescimento de células-tronco e progenitoras como esferoides multicelulares flutuantes, ou neurosferas3,imitando o comportamento das células-tronco neurais de mamíferos adultos5. Comparação abrangente lado a lado das células GBM primárias cultivadas em ambos os meios da neurosfera suplementadas com fatores de crescimento (NMGF) ou no meio de crescimento tradicional complementadas com 10% de FBS, revelou que as neurosferas GBM eram tumorigênicas, apresentavam potencial de diferenciação multilineagem e preservavam o genótipo do tumor original, em contraste com as culturas de 10% de FBS que não eram tumorigênicas em passagens baixas e divergiram consideravelmente dos tumores originais nas passagens tardias4.
Também foi proposto o isolamento do CSC de tumores GBM dissociados por triagem celular com base na expressão do marcador CSC putativo CD133 também foi proposto6,7, mas outros trabalhos indicaram que o fenótipo CSC não está definitivamente associado à expressão de tais marcadores8-10, diminuindo o entusiasmo inicial para essa estratégia, enquanto novos marcadores ainda estão sendo testados10. A indisponibilidade até o momento de um conjunto validado de marcadores que definem csc, juntamente com o objetivo de amplificação em larga escala dessas células para estudos pré-clínicos, torna o uso de classificação celular impraticável para culturas rotineiras enriquecidas com CSC. Células GBM selecionadas pela capacidade de crescer como neurosferas no NMGF invariavelmente expressam marcadores de células-tronco neurais. Observamos que Sox2 e nestin são onipresentemente expressos em culturas da neurosfera, enquanto a proteína CD133 está presente em um subconjunto das neuroesferas GBM (dados inéditos e referência11).
Vários laboratórios estão buscando culturas neuroferas a partir de tumores glioblastoma usando a mesma abordagem geral de dissociação enzimática e cultivo em meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento3,4,11-14, enquanto outros colegas relataram tentativas de cultivar culturas neuroferas de longo prazo a partir de amostras de GBM sem sucesso. O método geral de dissociação enzimática e cultura neurosfera de gliomas de alto grau apresentados aqui é semelhante ao que foi descrito nas publicações acima. Otimizamos o protocolo com base em nossa experiência de dissociar e culminar mais de 100 amostras gbm. A eficiência da obtenção de culturas neuroferas de longo prazo a partir de amostras de GBM frescas aplicando o protocolo aqui apresentado é superior a 40%, semelhante aos poucos relatórios que mostram dados de eficiência3,15, levando à exploração de protocolos alternativos como células de cultivo contínua ou intermitente em meio livre de soro na presença de EGF e bFGF como monocamadas em superfícies revestidas com proteína ECM16,17. As culturas da neurosfera ainda são a abordagem mais validada e cada vez mais popular para preservar os tumores GBM características moleculares e potencial tumorigênico3,4,11-14, portanto nossa abordagem é tentar culturas neuroferas primeiro, enquanto testa concomitantemente métodos alternativos para a cultura de células GBM que não conseguem formar neuroesferas auto-renovadores de longo prazo(Figura 1),para aumentar a representação de tumores GBM que podem ser usados em modelos animais. Aqui apresentamos um protocolo para a cultura de neuroesferas de GBMs. Para as células que não conseguem formar neurosferas, mostramos uma simples modificação no meio de crescimento, como a primeira tentativa de cultivar células tumorigênicas da nonneurosphere formando GBMs, com resultados promissores e ainda passando por ampla validação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin - EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14170-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type 4</td>
			<td style="width:143px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Albumin from Bovine Serum, cell culture grade</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lympholyte-Mouse</td>
			<td style="width:143px;">Cedarlane Laboratories Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">CL5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:143px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histoplex Tissue Cassettes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-146-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#160;Supplement</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KnockOut D-MEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stem Pro Neural Supplement&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>A1058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in  clinically relevant animal models and 3d immunochemistry

Os glioblastomas, a forma mais comum e agressiva do astrocitoma, são refratários à terapia, e molecularmente heterogêneos. A capacidade de estabelecer culturas celulares que preservem o perfil genômico dos tumores parentais, para uso em modelos in vitro e in vivo específicos do paciente, tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento pré-clínico de novos tratamentos para glioblastoma adaptados às características moleculares de cada tumor.
Começando com novos tumores de astrocitoma de alto grau dissociados em células únicas, usamos o ensaio da neurosfera como um método de enriquecimento para células que apresentam fenótipo de células-tronco cancerosas, incluindo expressão de marcadores de células-tronco neurais, auto-renovação de longo prazo in vitro,e a capacidade de formar tumores de xenoenxerto ortotópico. Este método foi previamente proposto, e agora está em uso por vários investigadores. Com base em nossa experiência de dissociar e culminar 125 espécimes de glioblastoma, chegamos ao protocolo detalhado que apresentamos aqui, adequado para a cultura da neurosfera de rotina de astrocitomas de alto grau e expansão em larga escala de células tumorigênicas para estudos pré-clínicos. Relatamos a eficiência de culturas de longo prazo bem sucedidas usando este protocolo e sugerimos alternativas acessíveis para cultivar células dissociadas de glioblastoma que não crescem como neurosferas. Também descrevemos em detalhes um protocolo para preservar a arquitetura 3D das neuroferas para a imunohistoquímica. Culturas celulares enriquecidas em CSCs, capazes de gerar modelos ortotópicos de xenoenxerto que preservam as assinaturas moleculares e a heterogeneidade dos GBMs, estão se tornando cada vez mais populares para o estudo da biologia dos GBMs e para o melhor desenho de testes pré-clínicos de terapias potenciais.

Aplicamos o protocolo descrito acima para dissociar e cultivar 125 amostras de glioblastoma cirúrgico fresco(Figura 1),88 recém-diagnosticados e 37 tumores recorrentes(Tabela 2),com consentimento aprovado pelo paciente e sob diretrizes institucionais. A eficiência do protocolo para o estabelecimento de culturas neuroferas de longo prazo foi de 41,6%, e semelhante para tumores recém-diagnosticados e tumores recorrentes(Tabela 2). Para algumas amostras de GBM, as neurosferas formam-se nos primeiros dias(Figuras 1B e 1C),enquanto para outras é necessário tempo de cultivo mais longo(Figuras 1D e 1E).
A eficiência da formação da neurosfera não dependia exclusivamente do nível de necrose no tecido, conforme exemplificado pelos resultados de um tumor recém-diagnosticado com alta densidade celular (GBM1) e um tumor recorrente e necrosado (GBM2) processado de acordo com os Protocolos 1 e 2, ambos produzindo culturas neuroferas(Figura 2).
Testar o potencial tumorigênico de cada cultura neurofera em camundongos imunocomprometidos é a validação crucial dessa abordagem para o enriquecimento dos CSCs. Utilizando um protocolo semelhante ao descrito anteriormente18,neuroferas GBM1 e GBM2 foram implantados no cérebro de camundongos imunocomprometidos, sob diretrizes institucionais e de cuidados com animais do IACUC. Os tumores de xenoenxerto apresentam características morfológicas de GBMs, como invasão ao parênquimo cerebral e necrose(Figura 2).
O GBM3 foi dissociado (Figura 1A) e cultivado em meio neurosfera(Figuras 1D e 1E), e em 2% FBS/NMGF (Figuras 1D, 1G e 1H). As células monocamadas cultivadas em 2% FBS/NMGF e células neurosferas cultivadas em NMGF foram dissociadas e o mesmo número de células foram implantadas em camundongos nus, utilizando o mesmo procedimento da Figura 2. Não foram observadas diferenças na sobrevida, dinâmica de crescimento do tumor ou morfologia entre os dois métodos de culturapré-implantação ( Figuras 3A-C). As características de crescimento tumoral não mudam até a última passagem testada, P20 para neurosferas e P10 para 2% FBS/NMGF. Enquanto os marcadores de células-tronco neurais, incluindo o Sox2, são regulados na maioria das células GBM primárias cultivadas em 10% FBS 3,4,11, NMGF suplementado com 2% FBS permite a retenção da expressão Sox2(Figura 3D).
As neuroesferas foram processadas de acordo com o Protocolo 4, e rotuladas com H&E (Figura 4A),anticorpo anti-Sox2, mostrando localização nuclear(Figura 4B),e anticorpo EGFR, localização da membrana celular(Figura 4C). Este protocolo foi aplicado para acessar alterações dependentes de estímulos na expressão de nestin, GFAP e no marcador de proliferação Ki6711.
Mesa 2. Eficiência de derivar culturas de neurofera auto-renovador a longo prazo de GBMs.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Patologia</td>
			<td>n</td>
			<td>Porcentagem de amostras que produzem neuroesferas autoconexantes de longo prazo (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - não tratada, primeira cirurgia</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - recorrente</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Figura 1. Cultura celular a partir de amostras cirúrgicas de glioblastoma frescos. Tumores frescos são enzimaticamente dissociados em células únicas. A interface celular nucleada do meio de separação de densidade é então banhada em NMGF. Neuroesferas dissociadas são banhadas em NMGF, e tipicamente 1 dia após o revestimento há células mortas, detritos, células únicas anexadas e células divisórias ocasionais em suspensão(A). A formação da neurosfera é mais rápida para alguns casos(B,C)e mais lenta para outros(D,E). Todas as neurosferas são dissociadas e remarcadas por pelo menos 10 passagens, 41,6% GBMs produzem neuroesferas auto-renovados a longo prazo. Células dissociadas GBM viáveis que não crescem como neurosferas (F) podem ser transferidas para condições alternativas de cultura, por exemplo 2% FBS/NMGF(G,H). Barra (A),100 μm, aplica-se a todas as imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Figura 2. Geração de neurosfera e xenoenxertos ortotópicos de camundongos gbm. Uma amostra de tumor que apresentava alta densidade celular (GBM1) e um tumor com alto teor necrosado (GBM2) foram dissociadas e neuroferas cultivadas por 10 passagens de acordo com os Protocolos 1 e 2. Camundongos imunocompromoizados foram implantados com 3 x 105 células da neurosfera dissociadas e sacrificados quando moribundos. Os cérebros de camundongos foram formados fixos e parafina incorporada para a coloração de H&E e detecção imunohistoquímica de marcadores humanos, mitocôndrias humanas (hMit) ou principal classe histocompatibilidade I subunit HLA-A (MHC-I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Figura 3. Crescimento de tumores semelhantes em camundongos implantados intracranianamente com células GBM3 cultivadas como neurosferas em NMGF ou como monocamadas em 2% FBS/NMGF. (A) As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para GBM3 cultivadas como neurosferas em NMGF ou monocamadas em 2%FBS/NMGF (ambas as passagens <10) não mostram diferença na sobrevivência (n=10, p=0,7174, teste de log-rank). (B) O crescimento tumoral monitorado por imagem de bioluminescência ao vivo (BLI) não mostra diferença significativa na dinâmica de crescimento do tumor entre os dois grupos. (C) A morfologia tumoral é indistinguível para xenergraftos de 4 GBM3, 2 cultivados em NMGF e 2 cultivados em 2% FBS/NMGF. Mancha MHC-I como descrito para a Figura 2. Escala, 600 μm. (D) Mancha ocidental mostrando a expressão sox2 fabricante de células-tronco retida em culturas 2% FBS/NMGF usadas para iniciar os tumores de xenoenxerto(A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Figura 4. Análise da expressão proteica em seções da neurosfera por imunohistoquímica. As culturas da neurosfera foram fixadas em formalina e parafinas incorporadas como descrito no Procedimento 4, e manchadas com H&E(A),anticorpo anti-Sox2(B)e anticorpo anti-EGFR(C). O substrato DAB foi usado para visualizar(B,C). Bar, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>

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Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

optimization-high-grade-glioma-cell-culture-from-surgical-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K visualizações.  Henry Ford Hospital. Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Vídeo: Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

Uso de Modelo Animal de Sepse para avaliar novas terapias à base de plantas

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

Medicina

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

De alta frequência Ecografia de mouse linfonodos cervicais

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Uso de ultra-alta MRI campo em pequeno roedor modelos de doença renal policística para<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipagem and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Modelos cirúrgicos de refluxo gastroesofágico com Ratos

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

A desnervação cirúrgica cutânea: um método para testar o requisito para os nervos no mouse modelos de doença de pele

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Um modelo para simular hipóxia clinicamente relevantes em humanos

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolamento e Cultura de Macrófagos Cardíacos Residentes do Nó Sinoatrial e Atrioventricular Murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...