עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי (סטרפטוקוקוס פרויקט 241,577 &quot;לב גדול&quot;, תכנית 7 במסגרת אירופאית, CP), Menarini הבינלאומי תפעול לוקסמבורג (PM), Telethon GGP07133 (CP) וגלעד למדעים (בבוקר).

פרוטוקולי הניסוי ברקמות אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת Careggi-החולים (2006 / 0,024,713; מאי מחודש 2009). כל מטופל נתן הסכמה מדעת בכתב. 1. פתרונות וציוד הכנה פתרונות מתוארים בטבלה 1. תרשים זרימה פשוטה של הליך בידוד התא נמצאת באיור 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> פתרון </td><td> CP </td><td> DB </td><td> KB </td><td> שחפת </td><td> נ.ב. </td><td> EB1 </td><td> EB2 </td></tr><tr><td rowspan="23"> מגיב (מ&quot;מ) </td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 50 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 MgSO </td><td> 8 </td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אדנוזין </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 140 </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> מניטול </td><td> 100 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> טאורין </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 113 </td><td></td><td> 136 </td><td></td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td> KCl </td><td></td><td> 4.7 </td><td> 85 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td> 30 </td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td></td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td></td><td> 12 </td><td></td><td></td><td></td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KHCO 3 </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Na-פירובט </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> BDM </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BHBA </td><td></td><td></td><td> 5 &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חומצת succinic </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> K-2-ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חומצת pyruvic </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> קריאטין </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KMES </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 115 </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> אנזימים (U / ml) </td><td> Collagenase סוג V </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 250 &lt;/ Td&gt; <td> 250 </td></tr><tr><td> פרוטאז סוג XXIV </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td></td></tr><tr><td> pH </td><td></td><td> 7.4 KOH </td><td> 7.3 NaOH </td><td> 7.1 KOH </td><td> 7.35 NaOH </td><td> 7.2 KOH </td><td> 7.3 NaOH </td><td> 7.3 NaOH </td></tr></tbody></table> . טבלה 1 פתרונות המשמשים לאיסוף דגימה, בידוד תא ואפיון פונקציונלי של myocytes = פתרון cardioplegic CP.; DB = חיץ ניתוק; KB = פתרון קראפט-Bruhe; TB = חיץ Tyrode; נ.ב. = פתרון פיפטה; EB1 = חיץ אנזים 1; EB2 = אנזים חיץ 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן cardioplegic פתרון (CP). פתרון CP יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע עד 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את Ca 2 חיץ ניתוק ללא + (DB). יש להשתמש בפתרון זה בתוך היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון קראפט-Bruhe (KB). פתרון KB יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך הקטנות של הלילה עד 1k. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את Ca 2 חיץ ללא + Tyrode (TB). יש להשתמש בפתרון זה בתוך היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את כל הפתרונות באמצעות מסנני מזרק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשיר העיכול (איור 2), מיכל גירוד עשוי שתי מברשות מול של אלסטומר סיליקון, שאחד מהם מסובבים על ידי מנוע חשמלי. מכשיר העיכול מורכב מותאם אישית. פרטים על מכשיר העיכול הם באיור 8; תמונות של המכשיר הן באיורים 2 C ו 2D. שטוף את חדר הרקמות עם 70% אתנול ומים. </li></ol> 2. איסוף ועיבוד של דוגמאות שריר הלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 40 מיליליטר של cardiplegic פתרון (CP) בצינור 50 מ&quot;ל ולאחסן אותו בקרח לתחבורה דגימה מחדר הניתוח למעבדה בידוד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את דגימת שריר הלב חדרית מחדר הניתוח באופן מיידי לאחר כריתה, לשטוף אותו עם קרח קרפתרון CP ולאחסן אותו בצינור. השתמש בדגימות endocardial נכרתה מן מחצה העליונה בין חדרית במהלך ניתוח לב פתוח, שקלול&gt; 100 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להעביר את הדגימה לאזור המעבדה; להתחיל עיבוד דגימה בתוך 10 דקות מכריתת דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על הדגימה במאגר CP הקר כקרח, להסיר בזהירות את שכבת fibrotic endocardial באמצעות מספריים עדינים תחת סטראו; לאחר מכן, חותך את רקמת שריר הלב לחתיכות קטנות (2-3 מ&quot;מ אורך). בהתאם לגודל דגימת רקמה, לקצץ בסכום כולל של שריר הלב חדרית בין 100 מ&quot;ג ו 1 גרם לכל בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת מתייפייפת רקמה, להעביר את נתחי שריר הלב לתוך מכשיר העיכול, עם פתרון CP קרח הקר ונקי. הימנע ממילוי כל הנפח שבין שתי מברשות סיליקון (3-4 מיליליטר) עם נתחי שריר הלב, באמצעות לא יותר מ 1 גרם של רקמה בסך הכל. </li></ol> 3. כביסה ועיכול של שריר הלב גושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בירכתי הספינהאה נתחים מועברים לתוך תא הגירוד של מכשיר העיכול, לשנות את חיץ CP בתא עם 2 חיץ Ca הקר + ללא ניתוק (DB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מכשיר העיכול באמבט תרמוסטטי, על מנת שהחדר יהיה במגע עם המים מחוממים באמבטיה (איור 1). הגדר את האמבטיה ל37.5 ° C ולהפעיל אותו, על מנת להעלות את הטמפרטורה של חדר הרקמות לאט. הפעל את המנוע של מכשיר העיכול, קביעת מהירות הסיבוב עד 1 מהפכה / שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 מחזורי כביסה עם DB, שינוי הפתרון בתא עם DB הנקי בכל 8 דקות. DB הוא התחמם (37 מעלות צלזיוס) וחמצן רווי לפני מקבל במגע עם נתחי שריר הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ אנזים 1 (EB1) על ידי הוספת 250 U / מיליליטר של Collagenase סוג V ו4 U / ml פרוטאז סוג XXIV לפתרון DB. הכן את אנזים חיץ 2 (EB2) על ידי הוספת 250 U / ml Collagenase סוג V לפתרון DB. להתחמם (37 מעלות צלזיוס) וoxygenatEB1 הדואר וEB2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שני מחזורי 12 דקות של עיכול במכשיר העיכול מסתובב עם 100% EB1 מחומצן (על 37 מעלות צלזיוס). בכל מחזור, השתמש ~ 3 מיליליטר של EB1. הסר את הפתרון על ידי שאיפה פיפטה וזורקים אותו אחרי כל מחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 6 15 מיליליטר צינורות לאיסוף תא ו~ 80 מיליליטר של תמיסת KB (4 ° C) קרה למשחררי המאגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מחזור עיכול 15 דקות ראשונה עם 100% EB2 חומץ 3 מיליליטר ב 37 ° C. לאחר מחזור העיכול, לאסוף את התמיסה המכילה myocytes ניתק הראשון בצינור 15 מ&quot;ל ולדלל את ההשעיה התא עם פתרון KB הקר 12 מיליליטר. אחסן את שטוח צינור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרון EB2 שנותר עם כמות שווה של DB על מנת לקצץ בחצי את הריכוז של V collagenase למחזורים הבאים העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מחזורי 5 עיכול דקות 12 אחרים עם 3 EB2 מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס; לאחר כל אחד מהם לאסוף של myocyte המכיל חיץ בצינור חרוטי 15 מיליליטר ולדלל אותו עם 12 פתרון KB מיליליטר. אחסן את 6 צינורות תא המכיל בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li></ol> 4. Resuspension הנייד וCa 2 + Readaptation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מ&quot;ג / אלבומין 1 מיליליטר שור בסרום (BSA) ל20 מיליליטר חיץ 2 Tyrode + ללא Ca (TB). סנן את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שישה צינורות חרוטי myocyte המכיל בדקות 5 100 XG לכפות myocytes להתיישב. הסר את supernatant ו resuspend התאים בצינור אחד עם כמות משתנה (1-3 מיליליטר, תלוי בתשואה) של BSA המכילה TB ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגה להגדיל את Ca 2 + ריכוז בחיץ התא המכיל על ידי הוספת aliquots הקטנים של 100 CaCl מילימול / ליטר 2 פתרון. בשלבים הראשונים והשני Ca 2 + ריכוז עולה עד 50 μmol / L ו100 μmol / L, בהתאמה. שלבי 2 + התוספת הבאה Ca מבוצעים כל 5 דקות והריכוז הוא העלה 100 μmol / L בכל t צעדהריכוז הסופי של OA 0.9 מילימול / ל &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את התשואה של הליך הבידוד. העבר 0.5 מיליליטר של תמיסה המכיל myocyte על חדר תחתית הזכוכית של מיקרוסקופ. להעריך 15 שדות מיקרוסקופ בהגדלה 10x אובייקטיבי ולחשב את אחוז myocytes בריא (תאים למשל מוט מעוצב עם פסים ברורים ואין תכלילים משמעותיים, איור 2). התשואה הצפויה היא בסביבות 20%. </li></ol> 5. הערכה תפקודית של שריר לב מבודד. הפרוטוקול הבא הוא דוגמא להערכה תפקודית cardiomyocyte אדם כוללים הקלטות בו זמנית של פוטנציאל פעולה ו2 + נתיבי תאיים Ca. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיפטה (PS) עבור ניסויי מהדק תיקון בתצורת תיקון מחורר. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.8 מילימול / ליטר CaCl 2 Ca 2 + ללא חיץ Tyrode (TB). Use פתרון זה עבור superfusion של שריר לב במהלך ניסויי מהדק תיקון / הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מיליליטר של השעיה תא צינור 1.5 מ&quot;ל ולהוסיף 10 μmol / L Fluoforte ו10 תרכיז Powerload μl. דגירה במשך 30 דקות ב RT. לאחר מכן, קבע את הצינור במצב אנכי ולעזוב את התא להתפשר על 5 דקות; resuspend התאים המכילים Ca 2 TB +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 0.25 מיליליטר של השעיה תא קטן (0.5 מיליליטר), מיקרוסקופ הטמפרטורה מבוקרת רכוב חדר הקלטה, superfused על ידי כוח הכבידה עם מערכת microperfusor מחוממת בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר / דקה (טמפרטורה: 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חולץ micropipette, להכין טפטפות מהדק תיקון בקוטר טיפ של 3 עד 5 מיקרומטר והתנגדות של 3-4.5 M כאשר התמלאו PS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת amphotericin B לקבוצה של PS (250 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהשתמש בו כדי למלא את האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תא בצורת מוט עם פסים ברורים, נטול תכלילים, עבורrm החותם וגיגה לחכות 5 דקות עד 10, עד שהתנגדות גישה יורדת מתחת 20 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר פוטנציאל פעולה במצב הנוכחי מהדק באמצעות פולסים קצרים (&lt;3 אלפיות שני) בתדרים שונים של גירוי (Hz 0.2, 0.5 הרץ ורץ 1, 1 דקות בכל תדר). במהלך שלב ההקלטה, להדליק תאורה בשדה בהירה ב492 ± 3 ננומטר ולזהות הקרינה Fluoforte ב505-520 ננומטר. לרכוש הקרינה וקרום אותות פוטנציאליים באמצעות Digidata 1440A וpClamp 10.0 תוכנה. חזור על רצף ההקלטה מספר פעמים במידת הצורך; עם זאת, לשמור על זמן ההקלטה הכולל מתחת 15 דקות לכל תא. </li></ol>

<ol>
	<li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cardiac+myocytes.+I.+Preparation+of+adult+myocytes+and+their+homology+with+the+intact+tissue.">Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue.</a> Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).</li><li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cardiac+myocytes.+II.+Functional+aspects+of+mature+cells.">Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells.</a> Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).</li><li>Harding, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+dependence+of+contraction+velocity+in+single+isolated+cardiac+myocytes.">Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes.</a> Cardioscience. 1, 49-53 (1990).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart.">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).</li><li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+calcium-current+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure.">Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).</li><li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+handling+in+isolated+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure.">Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation. 85, 1046-1055 (1992).</li><li>Cohen, N. M., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+in+single+human+cardiac+myocytes.">Calcium current in single human cardiac myocytes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).</li><li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+K++currents+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure.">Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation Research. 73, 379-385 (1993).</li><li>Virag, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+component+of+the+delayed+rectifier+potassium+current+in+undiseased+human+ventricular+myocytes.">The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes.</a> Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).</li><li>Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+ventricular+and+atrial+cardiomyocytes:+technical+note.">Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note.</a> Cardioscience. 4, 111-116 (1993).</li><li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+inward+current+in+single+cells+isolated+from+adult+human+ventricles.+Pflugers+Archiv.">Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).</li><li>Verkerk, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+delayed+afterdepolarizations+in+ventricular+cells+isolated+from+human+end-stage+failing+hearts.">Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts.</a> Circulation. 104, 2728-2733 (2001).</li><li>Cerbai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hyperpolarization-activated+current,+I(f),+in+ventricular+myocytes+from+human+failing+heart.">Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart.</a> Circulation. 95, 568-571 (1997).</li><li>Kohncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Tomaselli, G. F., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+remodeling+in+hypertrophy+and+heart+failure.">Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure.</a> Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).</li><li>Maron, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy:+a+systematic+review.">Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).</li><li>Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+hypertrophic+cardiomyopathy:+from+developmental+biology+to+clinical+practice.">The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).</li><li>Maron, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+is+predominantly+a+disease+of+left+ventricular+outflow+tract+obstruction.">Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction.</a> Circulation. 114, 2232-2239 (2006).</li><li>Peeters, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+human+ventricular+myocytes+from+single+endocardial+and+epicardial+biopsies.">Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies.</a> The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).</li><li>Lippiat, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recording+using+the+perforated+patch+clamp+technique.">Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique.</a> Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy.">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127, 575-584 (2013).</li><li>Kuusisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-grade+inflammation+and+the+phenotypic+expression+of+myocardial+fibrosis+in+hypertrophic+cardiomyopathy.">Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy.</a> Heart. 98, 1007-1013 (2012).</li><li>Yan, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+2+early+afterdepolarization+as+a+trigger+of+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+acquired+long-QT+syndrome+:+direct+evidence+from+intracellular+recordings+in+the+intact+left+ventricular+wall.">Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall.</a> Circulation. 103, 2851-2856 (2001).</li><li>Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+outward+and+delayed+rectifier+currents+in+canine+atrium:+properties+and+role+of+isolation+methods.">Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods.</a> The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).</li><li>Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+two+components+of+delayed+rectifier+K++current+in+human+ventricular+myocytes.">Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes.</a> Circulation research. 78, 689-696 (1996).</li><li>Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+IKr+and+IKs+heterogeneity+on+action+potential+duration+and+its+rate+dependence:+a+simulation+study.">Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study.</a> Circulation. 99, 2466-2474 (1999).</li><li>Volders, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+contribution+of+IKs+to+canine+ventricular+repolarization:+key+role+for+beta-adrenergic+receptor+stimulation.">Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation.</a> Circulation. 107, 2753-2760 (2003).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoproterenol+antagonizes+prolongation+of+refractory+period+by+the+class+III+antiarrhythmic+agent+E-4031+in+guinea+pig+myocytes.+Mechanism+of+action.">Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action.</a> Circulation Research. 68, 77-84 (1991).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+treatment+of+hypertrophic+cardiomyopathy:+pre-clinical+rationale+and+design+of+a+prospective+randomized+pilot+trial+with+ranolazine.">A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine.</a> Circulation. 125, 1 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שתארנו ומאומתים שיטה לבודד myocytes קיימא מדגימות כירורגית של שריר הלב חדרית האנושי. החל מפרוטוקולים שתוארו קודם לכן, ששימש בהצלחה לתאים מבודדים מדגימות ניתוחיות פרוזדורים, הטכניקה כדי לאפשר הפרדת myocytes קיימא אחת משריר הלב של חדר חולה פותחה ומכויל. דיווחים מוקדמים הראו ?...

Dissection של מאפייני אלקטרו של שריר הלב התקדם במידה ניכרת לאחר הפיתוח של טכניקות לבידוד myocyte לב אחד. פיתוחים אחרונים בהבנה של לב עירור התכווצות צימוד (EC-צימוד) גם כבר מתאפשרים על ידי היכולת של בידוד שריר לב יחיד קיימא ששומרים על כל המאפיינים הפיסיולוגיים של הרקמות שלמות. שיטות מהדק תיקון מועסקות באופן שיגרתי כדי ללמוד את התפקיד ואפנון תרופתי של זרמי יון sarcolemmal לב. הקלטות של דינמיקת סידן תוך תאי עם 2 + צבעים רגישים Ca מבוצעות גם באופן קבוע על myocytes לב אחת ממגוון רחב של דגמים בריאים וחולים, המספקות נתונים חיוניים על הפיסיולוגיה של EC-צימוד כמו גם על השינויים פתולוגיים של תאיים Ca 2 + הומאוסטזיס מוביל לליקוי מכאני וניטל arrhythmogenic מוגבר במחלות לב. Information ממחקרים אלה הוא קריטי להבנת השפעות אלקטרו מכניות של תרופות במסגרת הקלינית. עם זאת, יש הבדלים מסוימים במיני זרמי הטרנסממברני ובחלבוני EC-הצימוד כי חשבון עבור תכונות מסוימות של פוטנציאל פעולת לב ומכניקת לב. וכך, בעוד מחקרים של myocytes מבודד מיונקים שאינם בני אדם שהובהרו מאפייני biophysical ותפקידים פיסיולוגיים של ערוצים ספציפיים הטרנסממברני יון וחלבונים EC-צימוד, הם לא בהכרח לספק מודלים רלוונטיים של myocytes לב האנושי. בידוד של myocytes קיימא משריר הלב אנושי הוא חיוני ולכן כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות לב ולאמת גישות טיפוליות חדשניות. רקמת פרוזדורי אדם זמינה כנספחי פרוזדורים לעתים קרובות הושלכו במהלך הליכים כירורגיים. מחקרים כמותיים ראשוניים של פוטנציאל למבוגרים פעולה אנושי לבבית ומ&quot;ק היוניrrents מועסק תאי פרוזדורי אנזימים מבודדים 1-4. הקלטות של פוטנציאל פעולה או זרמים מתאי חדרית בודדים מבוגרים אנושיים דווחו לאחר מכן 3,5-10. רוב המחקרים הללו השתמשו בתאים המתקבלים מלב explanted ומנוצלים גם זלוף collagenase של קטע לב כלילית או חשיפה של כמויות גדולות היחסי של רקמה שנכרתה לCollagenase להשיג תאים מבודדים. מחקרים אלה אפשרו אפיון מפורט של מספר זרמי יון הטרנסממברני משריר לב חדרית אדם מלב בריא ומחולים עם אי ספיקת לב סופנית. הקלטות של סוג L-Ca 2 + נוכחית (אני CA-L) 5-7, נוכחית חולף אשלגן החוצה (אני ל) 8, פנימה הנוכחי אשלגן מיישר (אני κ1) 8, המרכיבים השונים של זרם אשלגן rectifier מתעכב (אני κ ) 9 כבר דיווחו. התקדמות וזיקוק שלהליך הבידוד 10, אפשר אפיון ברור של הבסיס היוני של פוטנציאל arrhythmogenic גדל באי ספיקת לב סופנית, הכולל הארכת פוטנציאל פעולת 11, עיכב אחרי depolarizations 12 ועלה 13 הנוכחיים מצחיקים שהוביל לשלילת קוטביות דיאסטולי ופעימות מוקדמות. myocytes לב למבוגרים בדרך כלל מבודד מבעלי חיים קטנים על ידי זלוף המדרדר של הלב השלם עם תערובות אנזים שונות, טכניקה שמייצרת תשואות גבוהות של 2 תאים + סובלניים Ca 14. בידוד של myocytes לב מרסיסים של רקמה הוא מטבעם פחות מוצלח כנראה בגלל הגישה המוגבלת של אנזימים לmyocytes הבודד בהשוואה לזה שהושג ע&quot;י טפטוף של עורקים הכליליים. בגלל הזמינות מוגבלת מאוד של לב תורם שאינו בשימוש, הדרך המעשית היחידה להשיג תאי חדרית אדם נורמלים על בסיס קבוע היא על ידי digestio האנזימטיתn של שברי הרקמה קטנים מאוד לעתים קרובות נכרת במהלך ניתוחים אלקטיביים. מודל המחלה האנושי היחיד שהתאפיין ביסודיות ברמת תא הוא אי ספיקת לב הטרמינל, בשל הנגישות ללב מושתל. עם זאת, אי ספיקת לב מסוף מתרחשת במיעוט של חולים, ולעתים קרובות כרוך במסלול משותף של שיפוץ חמור של תאי שריר הלב, שהיא עצמאית יחסית של הגורם הבסיסי 15. היכולת להעריך את תפקוד שריר לב אחת מחולים בשלב שאינו כושל קודם של מחלה היא קריטית כדי להבין את הפתופיזיולוגיה מסוימת של תנאים בירושה או רכשו שונים. קרדיומיופתיה hypertrophic (HCM) היא דוגמא מאלפת. HCM הוא נפוץ (1/500 יחידים) מצב לב בירושה מאופיין היפרטרופיה לבבית, גדל שינויי סיכון והתכווצות arrhythmogenic בשל חסימה בדרכי יצוא ותפקוד הדיאסטולי 16. שריר לב מלב HCM undergo תהליכי שיפוץ מורכבים של שינויים במבנה תא (היפרטרופיה, אנדרלמוסית myofibrillar) ו-EC-צימוד 17. עם זאת, רוב המידע של חוסר תפקוד myocyte בHCM הגיע ממודלים של בעלי חיים מהונדסים. שכן רק מיעוט של חולי HCM מתפתח לכיוון אי ספיקת לב סופנית ודורש השתלת לב, לב HCM זמין לעתים רחוקות מאוד לבידוד תא עם שיטות סטנדרטיות. עם זאת, לפחות 30% מחולי HCM לפתח סימפטומים חסימתית עקב זרימת דם בדרכי יצוא שינוי היפרטרופיה במחיצה מסיבית במהלך התכווצות (HCM) 18. האופציה הטיפולית זמינה היעילה ביותר להקלה על החסימה בHCM היא myectomy מחיצה כירורגית: בהליך כירורגים זה, חלק בגודל משתנה של עליונה מחיצה הוסר על ידי גישה של אב העורקים טראנס. חלק זה של מחיצת אף יתר על לכן הוא זמין לבידוד תא מהרקמה הטרי. שיטה לבידוד של ventricula אדםr myocytes מדגימות בודדות, קטנות transvenous endomyocardial ביופסיה כבר פותח בעבר ופורסם 19. אנחנו יישמנו שיטה לבודד myocytes במחיצה אחת מדגימות שריר הלב חדרית מחולים שעברו ניתוח לב, לרבות חולים עם HCM עוברים myectomy וחולים שעברו הליכים להחלפת שסתום במחיצה. בנוסף לתיאור מפורט של פרוטוקול הבידוד, אלקטרו הנציג וCa 2 + הקרינה מדידות מוצגות, הוכחת הכדאיות של myocytes חדרית האדם המבודד ואת הכדאיות של מהדק התיקון וCa 2 + מחקרים תאיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1059">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp;region=IT">P9791&#160;</a></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp;region=IT">M1880&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp;region=IT">H3375&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp;region=IT">A9251&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp;region=IT">G8270&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mannitol</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp;region=IT">M4125&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp;region=IT">S7653</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp;region=IT">P9333&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp;region=IT">S7907&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp;region=IT">S6297&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp;region=IT">237205</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp;region=IT">P2256&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp;region=IT">B0753&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide(NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp;region=IT">S8045&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp;region=IT">49601</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp;region=IT">107360</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Hydroxybutyric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp;region=IT">166898</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5&#8242;-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp;region=IT">A8937</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Creatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp;region=IT">C0780&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp;region=IT">S3674&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp;region=IT">E0396&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp;region=IT">A0281</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp;region=IT">M8266&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp;region=IT">C9263&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase, Bacterial, Type XXIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride solution, ~1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp;region=IT">21115</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp;region=IT">53704</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp;region=IT">83000</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoForte Reagent</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ENZ-52015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerload concentrate, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P10020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perfusion Fast-Step System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-77SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp;region=IT">A9528&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp 700B patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pClamp10.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="108">
			<td height="108" style="height:108px;">Digestion Device</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td style="width:255px;">The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone elastomer for the digestion device&#39;s brushes</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Variable speed rotating motor for the digestion device</td>
			<td>Crouzet</td>
			<td>Crouzet 178-4765&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Mold for brushes casting</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>N.A.</td>
			<td style="width:255px;">The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional characterization of human ventricular cardiomyocytes from fresh surgical samples

שריר לב מלב חולה חשופים לתהליכי שיפוץ המורכבים של שינויים במבנה תא, צימוד התכווצות עירור וזרמי יונים בממברנה. שינויים אלה עשויים להיות אחראים לעליית arrhythmogenic שינויי ההתכווצות שמוביל לחוסר תפקוד סיסטולי ודיאסטולי בחולי לב בסיכון ו. עם זאת, רוב המידע על השינויים של תפקוד myocyte במחלות לב הגיע ממודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת פרוטוקול לבודד myocytes קיימא מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית מחולים שעברו ניתוחי לב. הפרוטוקול מתואר בפירוט. מדידות סידן אלקטרו ותאיות הם דיווחו להוכיח את ההיתכנות של מספר מדידות תא בודדים בשריר הלב של חדר של אדם שנלקח בשיטה זו. הפרוטוקול דיווח שהואמחדש יכול להיות שימושי לחקירות עתידיות של הבסיס התאי ומולקולרי של שינויים תפקודיים של הלב האנושי בנוכחות מחלות לב שונות. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות מטרות טיפוליות חדשניות ברמה תאית וכדי לבדוק את האפקטיביות של תרכובות חדשות בשריר לב אנושי, עם ערך translational ישיר.

השיטה שתוארה לעיל הועסקה לאפיין את הליקויים תפקודיים של שריר לב מבודד ממחיצת interventricular של חולים עם קרדיומיופתיה hypertrophic (HCM) שעברו ניתוח myectomy, בהשוואה לחולים שאינם כושלים שאינו hypertrophic כירורגית 21. התוצאות הכלולות בסעיף זה נובעות מהעבודה ש21 ומוצגות כאן כדוגמ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples at JoVE.com

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

isolation-functional-characterization-human-ventricular

Research

JoVE Journal

Medicine

17.2K Views.  University of Florence.  ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים....

Video: Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

תרומבואמבוליים כרוני יתר לחץ דם ריאה והערכה של תפקוד ימין חדרית בחזרזיר

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

בידוד, טיפוח של עכברים בוגרים Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) handling and signaling pathways as well as high-throughput drug screening and toxicity assays. Herein, we provide a detailed description of the methodologies used to generate high-quality iPSC-CMs that can consistently reproduce molecular and functional characteristics across different cell lines. Additionally, a method is described to reliably assess their functional characterization through the evaluation of Ca2+ handling properties. Low oxygen (O2) conditions, lactate selection, and prolonged time in culture produce high-purity and high-quality ventricular-like cardiomyocytes. Similar to isolated adult rat cardiomyocytes (ARCMs), 3-month-old iPSC-CMs exhibit higher Ca2+ amplitude, faster rate of Ca2+ reuptake (decay-tau), and a positive lusitropic response to &#946;-adrenergic stimulation compared to day 30 iPSC-CMs. The strategy is technically simple, cost-effective, and reproducible. It provides a robust platform to model cardiac disease and for the large-scale drug screening to target Ca2+ handling proteins.

Here we describe and validate a method to consistently generate robust human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and characterize their function. These techniques may help in developing mechanistic insight into signaling pathways, provide a platform for large-scale drug screening, and reliably model cardiac diseases.

הדור של היפנוציטים באיכות גבוהה והתרופות לאפיון הטיפול בסידן

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...