E.A.B. נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (1F31HL140850), קרן ARCS, Inc., סן דייגו פרק, והוא ריס-Stealy קרן המחקר פיליפס Gausewitz, MD חוקר של מכון הלב SDSU. E.A.B ו-A.S.B נתמכו על ידי קרן אינמורי. CCG על ידי (NIH) מעניק R01 HL135893, R01 HL141463 ו HL149931.

<ol>
	<li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+of+adult+mice+in+long-term+culture.">Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture.</a> Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Jin, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF6+decreases+myocardial+ischemia/reperfusion+damage+and+links+ER+stress+and+oxidative+stress+signaling+pathways+in+the+heart.">ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart.</a> Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54012 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes+for+Cell+Signaling+and+in+vitro+Cardiac+Hypertrophy.">Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).</li><li>O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvised+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).</li><li>Piper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+and+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Atrial+Myocytes+from+Adult+Mice.">Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Cardiomyocyte+NLRP3+Inflammasome+Signaling+Promotes+Atrial+Fibrillation.">Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation.</a> Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).</li><li>Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+Fibrillation+and+Ventricular+Dysfunction:+A+Vicious+Electromechanical+Cycle.">Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle.</a> Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).</li><li>Issa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrial+size+and+heart+failure+hospitalization+in+patients+with+diastolic+dysfunction+and+preserved+ejection+fraction.">Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction.</a> Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).</li><li>de Bold, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+natriuretic+factor:+a+hormone+produced+by+the+heart.">Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart.</a> Science. 230 (4727), 767-770 (1985).</li><li>McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+function+of+the+heart.">The endocrine function of the heart.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).</li><li>Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+phenotyping+in+mice.">Cardiovascular phenotyping in mice.</a> Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).</li><li>Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cell+types+and+numbers+during+cardiac+development+in+the+neonatal+and+adult+rat+and+mouse.">Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse.</a> American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).</li><li>Jugdutt, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+after+infarction+and+the+extracellular+collagen+matrix:+when+is+enough+enough.">Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough.</a> Circulation. 108, 1395-1403 (2003).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiac+progenitors+that+survive+in+the+ischemic+human+heart+after+ventricular+myocyte+death.">Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death.</a> Scientific Reports. , 7 (2017).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li><li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation.">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).</li><li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging.">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).</li><li>Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contracture+and+the+calcium+paradox+in+the+rat+heart.">Contracture and the calcium paradox in the rat heart.</a> Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).</li><li>Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+to+adult+mouse+cardiomyocytes+is+selectively+influenced+by+culture+medium.">Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium.</a> Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

איכות התאים המבודדים באמצעות ההליך המתואר כאן, כפי שנקבע על ידי תשואת התא ובריאות כללית של התאים בתרבות, תלויה בגורמים רבים לשליטה. החל עם העכבר עצמו, זה תועד כי הלחץ שהוטל על החיה יכול להשפיע לרעה על תשואת התא ואת הכדאיות בתרבות, ככל הנראה בשל עודף קורטיזול מערכתי, קטכולאמינים, ואת המצב hypercontractile של רקמת לב2,5,7. מסיבות אלה, יש לנקוט צעדים כדי למנוע הבהבת החיה לפני ההקרבה. אמצעים אלה כוללים כיסוי הכלוב של החיה והגבלת זמן מחוץ vivarium לפני ההקרבה. הפרין וברביטורטים רבים המשמשים בדרך כלל המתת חסד יכולים להשפיע על מסלולי איתות; לפיכך, יש להתאים אישית את השיטה האופטימלית של המתת חסד בהתאם. לגיל החיה יש השפעה ניכרת על האיכות והכדאיות של תאים מבודדים, ככל הנראה עקב הצטברות מתקדמת של פיברוזיס ביניים המתרחשים במקביל לתהליך ההזדקנות, אשר יכול להשפיע על עיכולרקמות 25. בנתונים שאינם מוצגים כאן, בעוד שהשיטה המתוארת לעיל פועלת בעכברים בני עד 78 שבועות, איכות התאים הייתה נמוכה יותר בבעלי חיים מבוגרים אלה.
הצעד הקריטי ביותר בתהליך הבידוד המתואר, כמו גם פרוטוקולים אחרים הכוללים מנגנון לנגנדורף לזלוף מדרדר, הוא הקנציה והזלוף הראשוני של הלב. לקבלת תוצאות אופטימליות, הזמן מ explantation לב כדי שימורים של העורקים העולה חניכה של זלוף צריך לקחת לא יותר מ 90 s. בנוסף לזמן, שני גורמים חשובים נוספים הם עומק הצינורית ואפשרות להכניס אמבולי אוויר ממנגנון הזלוף. לפיכך, יש לקדם את הצינורית לתוך אבי העורקים העולה כדי לא להיכנס לשורש אבי העורקים ולחסום את שסתום אבי העורקים, אשר יפגע בזלוף כלי הדם הכליליים.
במהלך תהליך העיכול, חשוב לבדוק באופן קבוע את קשיחות הלב, כדי למנוע חשיפה ממושכת לקולאזנאז אנזים העיכול, אשר מפחית סובלנות סידן מיוציטים לב. הפרוטוקול שתואר לעיל להחזרת סידן לתרביות מיוציטים חדריות מבודדות נועד להגביל מוות מיוציטים לבביים באמצעות זרם סידן בלתי הולם באמצעות ערוצי סידן המופעלים בחנות. יש לציין כי החזרת הסידן החורגת לא צריכה להתבצע עבור תרבויות מיוציטים בין-תאיות מבודדות, שכן זה יקדם מוות תאי במהלך תרבות לטווח קצר וארוך12. לאמצעי זהירות נוספים, מאגרי זלוף ועיכול המשמשים כאן כוללים את מעכב התכווצות שריר הלב butanedione monoxime (BDM) כדי למנוע היפרcontraction של מיוציטים מבודדים, כמו גם את פרדוקס הסידן, שניהם משפיעים על הכדאיות myocyte26. עם זאת, יש לציין את המעבר מ- BDM לבביסטין, שכן הוא הסוכן האנטי-התכווצות המועדף בשמירה על מדיה עבור מיוציטים לבביים מבודדים. בנתונים שאינם מוצגים, blebbistatin מעניק כדאיות רבה יותר לתרבות ארוכת טווח של מיוציטים לבביים מבודדים.
מיד לאחר הבידוד, חשוב לשקול את ההשלכות של תרבות ארוכת טווח של תאי לב, במיוחד מיוציטים. הבידוד הלבבי שאינו מיוציטים ופרוטוקול culturing המתואר כאן מבוסס על שיטות נפוצות המנצלות את הצפיפות ותכונות הדבק השונות של תאי לב שונים. היתרון של מיוציטים שאינם מיוציטים הוא פוטנציאל ההתרחבות הגבוה שלהם בתרבות; לפיכך, שלא כמו מיוציטים לבביים, הם נוחים להנצחה. עם זאת, ידוע כי culturing תנאים, כולל תוספי בינוני עם FBS, יכול להשפיע על תפקוד מיוציטים לב27. המדיה התרבותית המתוארת כאן נועדה לייעל את הכדאיות ולהגביל את ההפרעות התפקודיות, במיוחד עבור מיוציטים בין-וסתיים מבודדים. בעוד שלא נצפתה יכולת התכווצות לקויה במיציטים לבביים מבודדים לאחר התרבות בהיעדר תוספי blebbistatin, מחקרים המתמקדים באלקטרופיזיולוגיה, התכווצות, ותא יחיד אחר באיתות מולקולרי מבוסס vivo צריכים להתבצע זמן קצר לאחר הבידוד, כאשר המבנה הסרקומי והחתימה המולקולרית עדיין מחקים את זה של הלב שלם.
מאפיין בולט של מיוציטים פרוזדורים הוא היכולת שלו לאור ירח כתא אנדוקריני עם יכולת הפרשה עצומה, בנוסף לתפקודם המתכווץ. בתנאים פיזיולוגיים, מיוציטים פרוזדוריים מייצרים כמויות גדולות של ANP, המאוחסן ברשתית האנדופלזמית ובגרגרי הפרשה גדולים בעלי ליבה צפופה הצפויים לאקסוציטוזיס מוסדר עם קבלתגירוי 16,17. בעוד שמחקרי מיוציטים אסציוניים מבודדים רבים מתמקדים בתכונות האלקטרופיזיולוגיות הייחודיות שלהם, זהו המחקר הראשון שמתכנן מדיה תרבותית. זה מאפשר הכדאיות לטווח ארוך, כמו גם קידום של הפונקציות המתוחזקות של תכונות אנדוקריניות והתכווצות של מיוציטים אסטראליים. שיטה חדשנית זו עבור culturing, כמו גם בידוד בו זמנית של כל סוגי התאים מתוך תאים אבריים חדריים מלב עכבר יחיד, יהיה שימושי ויעיל למחקרים על המאפיינים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים של מיוציטים בין אבות וחדריים כאחד.

תרבות התאים העיקרית היא משאב אינטגרלי המציע סביבה מבוקרת למחקרים מכניסטיים מפורטים של תפקוד מיוציטים לבביים. בשל האופי העמיד יותר שלהם וקלות הבידוד, ארוסת עכברוש יילודים ומיוציטים חדריים היו המקור המשותף לתרביות תאים כאלה1. עם זאת, מיוציטים של עכברים בוגרים חדריים (AMAMs ו- AMVMs) רצויים מאוד למחקרים במבחנה, מכיוון שהמאפיינים המולקולריים והתפקודיים שלהם מחקים טוב יותר את אלה של תאי לב בוגרים. לכן, הם הפכו רלוונטיים למחקרים הקשורים פתולוגיות לב, שרובם מתפתחים אצל מבוגרים2.
יתר על כן, הזמינות והשימוש במודלים של עכברים מהונדסים ומחלות מרחיבים את התועלת של מיוציטים לבביים בוגרים מבודדים. פרוטוקולים לבידוד ותרבות העכבר AMVMs למחקרים קצרי טווח וארוכי טווח תוארו בפרסומים קודמים רבים2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. לשם השוואה, פרוטוקולים מעטים תוארו לבידוד של AMAMs. יתר על כן, אלה המתוארים מותאמים בעיקר למחקרים חריפים של תאים מבודדים טריים, ללא פרוטוקול culturing לטווח ארוך המתואר עד כה11,12,13. ככזה, פרוטוקולי בידוד AMAM לא נועדו לספק את השירות ואת צדדיות של פרוטוקולים שפורסמו עבור הבידוד והתרבות של AMVMs. יתר על כן, בעוד המחקרים החלוציים לבידוד של AMAMs ו- AMVMs הוכיחו תושייה, אין פרוטוקולים לבידוד ותרבות אופטימליים בו זמנית של AMAMs ו- AMVMs, מה שמוביל לשימוש יעיל בלב כולו לכל הכנה.
עד כה, פרוטוקולי בידוד AMAM ו- AMVM שפורסמו לא תוכננו לבידוד בו זמנית של שני סוגי התאים, מכיוון שלרוב המחקרים על תפקוד פרוזדור וחדר יש מיקוד ספציפי לתא. לדוגמה, AMAMs משמשים בעיקר כדי ללמוד אלקטרופיזיולוגיה מיוציטים פרוזדורים, בין היתר בגלל העניין פרפור פרוזדורים (AF), הפרעות קצב הלב הנפוצות ביותר בארה"ב. עם זאת, AF אינה מחלה המשפיעה על atria בבידוד, וזה כבר מעורב כבעל תפקיד סיבתי קל עד חמור תפקוד לקוי של החדר השמאלי14. יתר על כן, אלקטרוקרדיוגרמות מחולים עם אי ספיקת לב עם שבר פליטה משומר (HFpEF) הוכיחו כי גודל האבסורד השמאלי הוא אחד המנבאים החזקים ביותר עבור רגישות לאי ספיקת לב15.
בנוסף לתפקידו באלקטרופיזיולוגיה והתכווצות, האטריום הוא גם איבר אנדוקריני, מפריש קרדיוקינים (כלומר, פפטיד נטריורי פרוזדורי [ANP]) המווסת באופן הומיאוסטטי את לחץ הדם ואת נפח16,17. יתר על כן, ANP (ככל הנראה מ myocytes אבריאלי) יש תפקיד מגן בולט אנטי היפרטרופי מיוציטים חדריים16,17. אמנם יש השלכה חזקה של תקשורת נוירוהורמונלית בין atria ו ventricles במצבי מחלה שונים, המנגנונים שבבסיס תקשורת זו לא נחקרו במלואם. נקודה זו באה לידי ביטוי עוד יותר על ידי גל המחקר המתמקד 1) התפקיד של שאינם מיוציטים (במיוחד fibroblasts לב ותאי החיסון) בלב החולה ו 2) איך שיפוץ לב כפונקציה של מחלה משפיע ישירות על הכדאיות מיוציטים לב ותפקוד לב גלובלי18,19,20,21,22. לכן, לימוד תאי לב הן atria והן חדרים היא גישה הכרחית כדי לקבל תמונה מלאה יותר של תפקידם פתופיזיולוגיה לב.
הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד הסימולטני של מיוציטים ובלתי מיוציטים בין-חדריים ולא מיוציטים מלב עכבר יחיד בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. בנוסף, שיטה זו היא הראשונה לתאר את התנאים האופטימליים הדרושים לשמירה על תרבויות של מיוציטים לב פרך, כמו תנאים לשמירה על תרבויות של מיוציטים חדריים כבר פורסמו.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>1 Liter Water Jacketed Reservoir</td><td>Radnoti</td><td>120142-1</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Silk Suture Thread</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Bubble Trap Compliance Chamber</td><td>Radnoti</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>Carnitine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9500</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type 2</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Creatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1; 1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent micropscpe</td><td>Olympus X70</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td>Lot# 206018</td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Headband Magnifiers</td><td>Fine Science Tools</td><td>28030-04</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer (Bright-Line)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Inosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium-X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 105 Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0858659</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-182</td><td></td></tr><tr><td>Joklik Modified Minimum Essential Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-0518</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (Natural, Mouse)</td><td>Gibco</td><td>1795024</td><td>Lot# 1735572</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM 1X)</td><td>Gibco</td><td>12350-039</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Water</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors - 6mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8691</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart

הבידוד והפולחן של מיוציטים לבביים מעכברים היו חיוניים לקידום ההבנה של פיזיולוגיה לבבית ופתופיזיולוגיה. בעוד בידוד מיוציטים מלבבות עכבר יילודים הוא פשוט יחסית, מיוציטים מהלב המורין הבוגר הם המועדפים. הסיבה לכך היא כי בהשוואה לתאי יילודים, מיוציטים בוגרים מדויק יותר recapitulate תפקוד התא כפי שהוא מתרחש בלב הבוגר vivo. עם זאת, מבחינה טכנית קשה לבודד מיוציטים לב עכבר בוגר בכמויות הדרושות ואת הכדאיות, אשר תורם למבוי סתום ניסיוני. יתר על כן, נהלים שפורסמו הם ספציפיים לבידוד של מיוציטים פרוזדוריים או חדריים על חשבון תאים פרוזדוריים חדריים שאינם מיוציטים. המתוארת כאן היא שיטה מפורטת לבידוד מיוציטים לבביים הן דרך האשורית והן החדרית, יחד עם מיוציטים לא-מיוציטים בין-מסלוליים חדריים, בו זמנית מלב עכבר יחיד. כמו כן מסופקים הפרטים עבור שיטות culturing תא ספציפי אופטימלי, אשר לשפר את הכדאיות של התא ותפקוד. פרוטוקול זה נועד לא רק לזרז את התהליך של בידוד תאי לב מורין למבוגרים, אלא גם כדי להגדיל את התשואה ואת הכדאיות של תאים לחקירות של תאי לב פרוזדוריים חדריים.

לב עכבר C57b6/j בן 10 שבועות מוביל בדרך כלל ל-75,000-150,000 מיוציטים א-טריים ו-1.0-1.5 x 106 מיוציטים חדריים, השווה לתשואה משוערת של 30%-50% עבור מיוציטים18,19. במהלך ומיד לאחר בידודים, מיוציטים לב קיימא צריך להופיע מוט בצורת ולא התכווצות. רוב מיוציטים לב מבודדים צריך להתאים את המורפולוגיה, המהווה אינדיקציה של זלוף יעיל. מורפולוגיה בצורת מוט יכולה גם להיות מנבא של הכדאיות. הפרוטוקול נועד לשפר את התשואה ואת הכדאיות של מיוציטים ולא מיוציטים מבודדים מלב עכבר חולה. יתר על כן, זה נבדק במודל של אי ספיקת לב הנגרמת על ידי עומס לחץ (נתונים לא מוצגים).
כדי לאשר בידוד הולם וניתן לשכפול של מיוציטים ולא מיוציטים מרקמת אבות ורקמות חדריות, התאים נצפו וצולמו בימים שונים בתרבות(איור 2). בנוסף, בוצעה תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (qRT-PCR) כדי למדוד את רמות התמלילים שהיו ספציפיים לסוג התא. טרופונין T שריר הלב(Tnnt2)הוא סמן של מיוציטים לבביים והתבטא בחוזקה הן בתרביות מיוציטים לבביות הן מבחינה משפטית והן בתרבויות מיוציטים לבביות חדריות(איור 3A). לעומת זאת, פפטיד נטריורטי פרך (Nppa, אשר מתבטא בדרך כלל אך ורק מיוציטים לב פרך למבוגרים בתנאים פיזיולוגיים) ושרשרת אור מיוסין 2 (Myl2, שהוא גן ספציפי myocyte חדרית) באו לידי ביטוי באופן חזק במיוחד בתרבויות מיוציטים לב מפרזדוריים חדריים, בהתאמה (איור 3B, C).
סמני פיברובלסט, פקטור שעתוק 21 (Tcf21), קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות הדם A (Pdgfra), ואשכול סמן תאים המופק ממונוציטט של התמיינות 68 (Cd68) באו לידי ביטוי אך ורק בתרבויות שאינן מיוציטים המבודדות הן מתאים פרוזדורים והן מחדרים חדריים (איור 3D-F). ההערכה היא כי שאינם מיוציטים להתפשר ~ 65% של כל תאי הלב וכי רוב אלה מקורם שושלת פיברובלסט או מונוציטים נגזר18,19,23,24. לפיכך, סמנים עבור שני שושלת אלה נבחרו להיות ייצוגיים, בהתחשב בהתעניינות באוכלוסיות הסלולר האלה במחקרים של מודלים ואטימולוגיות שונות של פתולוגיה לבבית.
חיסון של AMAMs ו- AMVMs עבור סמן t-tubule דיהידרופרידין (DHPR, שהוא ערוץ סידן תלוי מתח (L)-סוג) כמו גם קולטן ריאנודין (RYR2) הפגין t-tubules שלמים לאורך בידוד ותרבות לטווח ארוך (איור 4A,B). השפע של DHPR ולוקליזציה שהיה אופייני וייחודי למיוציטים אבריאליים חדריים הצביעו על נוכחותם של צינוריות. יתר על כן, קולוקליזציה של DHPR עם RYR2 immunostaining היה אינדיקטור של מבני דיאלאד שלמים. אימונוסטין עבור החלבון סרקומרי אלפא-actinin במיצ'יטים לב פרוזדוריים חדריים הביא דפוס פסים סרקומריים הצפוי. דפוס הפסים הסרקומי שימש להערכת הטוהר והכדאיות של מיוציטים לבביים מבודדים בשילוב עם צורה מורפולוגית בצורת מוט וכתמים גרעיניים עם TOPRO-3 (איור 4C,D; סגול ואדום). כצפוי, מיוציטים לבביים חדריים היו גדולים, והפגינו אורך ממוצע של ~ 150 מ"מ, ואילו מיוציטים לב פרך בממוצע ~ 75 מ"מ. יתר על כן, על ניתוח immunostaining, מיוציטים לב פרטלי (אבל לא מיוציטים לב חדריים) הציג ביטוי חזק של פפטיד נטריורטית פרזדורית (ANP) בתבנית מכתימה האופיינית לוקליזציה לרטיקולום אנדופלזמי וגרגרי הפרשה (איור 4C, D;ירוק).
מאפיין ייחודי מיוציטים לב אסטראלי הוא הסיווג שלה כתא אנדוקריני בנוסף לתא התכווצות. בעוד מיוציטים פרוזדורים מפרישים ANP בתנאים בסיסיים, הפרשת עולה בתגובה secretagogues (כלומר, אגוניסט אלפא-adrenergic, פנילפרין [PE]). יתר על כן, מיוציטים לב פרוזדורים להפריש ANP ושיתוף הפרשת לעבד חלק ההורמון ממצב מבשר שלה (Pro-ANP, 15 kD) לפפטיד המוצר (ANP 3kD)16,17. יכולת הפרשה זו ניתן לכמת באמצעות זיהוי immunoblot של ANP במדיה של מיוציטים לב אצטריים מבודדים בתגובה לטיפול PE חריפה (איור 4E). הפרשה זו ויכולת העיבוד של מיוציטים לב פנים נמצאה רגישה לתנאי culturing. לכן, זה הכרחי כי מדיום ציפוי מיוציטים פרסלי הוא בתוספת דקסמתזון, אינסולין, transferin, סלניום.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig1.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של זלוף לב מדרדר, עיכול ובידוד תאים. המוצגים הם השלבים העיקריים המעורבים בבידוד תאים הן מתאי האשכים והן מחדרי החדר בו זמנית מלב עכבר יחיד. (A) לב עכבר יחיד הוא משומר במהירות דרך העורקים העולה ו perfused באופן מדרדר. (B)הלב מופרד לרקמות פרוזדוריות חדריות להמשך עיכול והפרדה פיזית. (C) לאחר עיכול הולם, התאים מופרדים באמצעות סינון הכבידה לתוך סך של ארבעה שברים תאיים כי הם תרבותיים לניסויים הבאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig2.jpg"> איור 2: ניתוח מורפולוגי של מיוציטים לבביים מבודדים בחדרים ולא מיוציטים בתרבות. (A) מיוציטים בין-תאיים של עכבר בוגר מבודד (AMAMs),(B)עכבר בוגר שאינו מיוציטים (AMANMs), (C) מיוציטים חדריים של עכבר בוגר (AMVMs), או (D) ) עכבר בוגר שאינו מיוציטים (AMVNMs) היו מצופים ב 5 x 105 תאים / תא על ארבעה תאים (1.7 ס"מ 2 ) שקופיותזכוכיתבמדיה מצופה בהתאמה. תמונות שלב התקבלו בימים המצוינים בתרבות באמצעות מטרה 10x תחת מיקרוסקופ epifluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig3.jpg"> איור 3: ניתוח qRT-PCR מייצג של תרביות תאים מבודדות. RNA חולץ מיוציטים לב מבודדים טריים ולא מיוציטים, ורמות mRNA עבור סמני גנים ספציפיים לתאים נקבעו על ידי qRT-PCR4. (A) Tnnt2, טרופונין שריר הלב T (סמן מיוציטים לב); (B) Nppa, פפטיד נטריורטי מטריורי (סמן מיוציטים מטריאלי); (C) Myl2, שרשרת אור מיוסין 2 (סמן מיוציטים חדרי); (D) Tcf21, פקטור שעתוק 21 (סמן פיברובלסט); (E) Pdgfra, קולטן גורם גדילה נגזר טסיות הדם A (סמן פיברובלסט); (F) Cd68, אשכול של בידול 68 (סמן תא נגזר מונוציט). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (*p ≤ 0.05 שונה מכל הערכים האחרים, כפי שנקבע על ידי ANOVA ואחריו הניתוח שלאחר הוק של ניומן קאול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig4.jpg"> איור 4: ניתוח מורפולוגי ופונקציונלי מייצג של מיוקטי לב פרוזדוריים חדריים מבודדים. (A)AMAMs או (B) AMVMs היו מצופים ב 5 x 105 תאים / תא על ארבעה תאים (1.7 ס"מ2)שקופיות זכוכית במדיית ציפוי בהתאמה במשך 1 שעות כדי לאפשר הידבקות. זה היה ואחריו גם הזנה מחדש של מדיה ציפוי מיוציטים פרך או שינוי מיוציטים חדרית שמירה על מדיה בתוספת blebbistatin עבור 16 שעות נוספות. תרבויות תוקנו לאחר מכן אז immunostained עבור RYR2 (סגול), DHPR (ירוק), וכתם גרעיני TOPRO-3 (אדום). (C)AMAMs או (D) AMVMs היו מבודדים מצופים, לאחר מכן immunostained עבור a-actinin (סגול), ANP (ירוק), ו TOPRO-3 (אדום). מוצגות שתי תמונות מייצגות עבור כל סוג תא. (E)AMAMs היו מצופים ב 5 x 105 תאים / גם על צלחת תרבות 12 גם עבור 16 שעות במדיה ציפוי מיוציטים atrial. AMAMs טופלו לאחר מכן עבור 0.5 שעות עם הרכב או secretagogue ANP (פנילפרין, 50 מ"מ) לפני המדיה נאספו ונתון לניתוח immunoblot עבור ANP. לפני ניתוח immunoblot, דגימות מדיה היו צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר ולהבטיח כי ANP שנצפה היה תוצאה של הפרשה פעילה של AMAMs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart at JoVE.com

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

simultaneous-isolation-culture-atrial-myocytes-ventricular-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

7.2K Views.  San Diego State University. שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

Video: Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Medicine

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca