LarvaSPA היא השיטה הראשונה המאפשרת הדמיה חיה רציפה של זחלי דרוסופילה שלמים במשך יותר מ -10 שעות עם רזולוציה זמנית ומארית גבוהה. שיטה זו משמשת לחשיפת תהליכים תאיים דינמיים של נוירונים חושיים היקפיים של זחלים ולחקר תהליכים תאיים רבים אחרים שקורים ליד קיר גוף הזחל. שיטה זו קלה לשימוש ויש לה פחות הגבלה על גודל הזחל.
שישה עד תשעה זחלים יכולים להיות מותקנים בתא ההדמיה באותו הזמן, מה שהופך את הניסוי לאפשרי. תא ההדמיה בקובואידים PDMS ניתן לייצר בעלות מינימלית והם לשימוש חוזר. שיטה זו שימושית במיוחד לחקר מנגנונים של התפתחות דנדריט ניוון דנדריט באמצעות נוירונים אישור זחל drosophila dendritic.
היכולת לדמיין את אותו נוירון במשך שעות יכולה לחשוף כמה שינויים גלובליים ארוכי טווח של דפוסים דנדריטיים נובעים מהתנהגויות לטווח קצר ברמת הענף הבודד. שימוש בקובואידים PDMS התואמים את גודל הזחלים יגדיל את שיעור ההצלחה של זחלים משתק. אנא מצא קלטות שימושיות נוספות בסעיף פתרון הבעיות שלנו.
לאחר בניית בלוק אלומיניום מחנות מכונות, לאטום את החלק התחתון של מסגרת המתכת באמצעות להחליק כיסוי ארוך עם דבק UV. לרפא את הרמז UV באמצעות מנורת UV כף יד במשך 30 שניות. חבר שכבות של סרט אריזה לפני השטח הפנימיים של צלחת פטרי מלבנית או צלחת תרבות תאים עגולים.
השתמש בשכבה אחת לזחלים שניים בכוכב, שתי שכבות לזחלים בשליש המוקדם בכוכב, או שלוש שכבות לזחלים בשלהי הסיבוב השלישי בכוכב. חותכים את הקלטת לטיולים ברוחב מסוים עם סכין גילוח, 1.5 מילימטרים עבור קלטת שכבה אחת ושני מילימטרים עבור שתי שכבות או שלוש שכבות קלטת. השאירו לפחות רווח של חמישה מילימטרים בין שתי הרצועות.
הסר את שכבות הקלטת המכסות את השטח. הסר אבק מפני השטח הפנימיים של הצלחת באמצעות סרט דביק. לאחר מכן, התבנית מוכנה לשימוש.
כדי להכין את תערובת PDMS, לערבב שבעה גרם בסיס PDMS ב 0.7 גרם של סוכן ריפוי ביסודיות במיכל קטן. מניחים את המיכל בשואב ואקום במשך 15 דקות לפחות כדי להסיר אוויר מהתערובת. לאט לאט לשפוך על 5.5 גרם תערובת PDMS על התבנית כדי להגיע לעובי של 1 עד 2 מילימטר.
מניחים את תערובת PDMS ב desiccator ואקום שוב לפחות 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר שנותרו מן התערובת. לשבור את הבועות האחרונות עם קצה פיפטה. לרפא את PDMS על משטח שטוח באינקובטור חום ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לשחרר את PDMS נרפא לאורך קצה התבנית ולנתק אותו מן התבנית. אחסן את ה- PDMS בין שתי חתיכות של סרט דביק גדול בטמפרטורת החדר. עבור זחלים בתחילת וסוף השלישי בכוכב, לחתוך את PDMS לשמונה על ידי שניים על ידי אחד מילימטר קובואידים על ידי מיקום החריץ שנוצר על ידי רצועת הקלטת במרכז הצד הארוך של הקובואיד.
עבור זחלים שני בכוכב, לחתוך את הקובואיד לשמונה על אחד על אחד מילימטר. כדי להכין את החלק העליון להרכבה, בחר שישה קובואידים PDMS עם חריצים התואמים את גודל הזחלים. הסר אבק מפני השטח של PDMS עם סרט דביק.
צרף ארבע חתיכות של סרט הדבקה דו צדדי בגודל של 12 על חמישה מילימטרים על תלוש כיסוי ארוך של 22 על 50 מילימטרים לתיקון קובואידים PDMS מאוחר יותר. כוונן את הרווחים בין שתי החלקים של קלטת דו-צדדית לרוחב החריץ PDMS. החל טיפה קטנה של דבק UV לתוך החריץ של כל קובואיד PDMS ולהוסיף שש טיפות קטנות של דבק UV לתוך הרווח בין קלטות דו צדדיות על החלקת הכיסוי.
כדי להכין את הזחלים להרכבה, באמצעות זוג מדפים, לנקות את הזחלים במים כדי להסיר מזון מפני השטח של הגוף. מניחים את הזחלים הנקיים על פיסת נייר טישו לחה בצלחת פטרי קטנה ללא מכסה ומנחים את צלחת פטרי הקטנה בצלחת פטרי גדולה המכילה פיסת נייר טישו יבש. במכסה המנוע הכימי, השתמשו בצנרת להעברת פלסטיק כדי למרוח 160 עד 240 מיקרוליטרים של איזופלורן על נייר הרקמה היבשה וסגרו את המכסה של צלחת פטרי הגדולה.
המתן שתיים עד שלוש דקות תוך ניטור הזחלים. ברגע שהקרסים בפה שלהם מפסיקים לזוז, מוציאים את הזחלים מהצלחת הגדולה של פטרי. מניחים את הזחלים משותקים על דבק UV בין קלטות דו צדדיות על החלקת הכיסוי עם קוטיקל הגב מול החלקת הכיסוי.
מכסים כל זחל עם בלוק PDMS ומתאים את תא המטען של הזחל לתוך החריץ של PDMS. השאר את הראש והזנב של הזחל מחוץ לחריץ PDMS. הימנע חסימת צריחים של הזחל על ידי הדבק.
לחץ כלפי מטה על הקצוות של בלוק PDMS על קלטת דו צדדית מבלי להחיל כוח על החריץ. משוך בעדינות את זנב הזחל כדי לשטח את החותך מתחת ל- PDMS. ללבוש משקפי בטיחות ולהשתמש מנורת UV כף יד כדי לרפא את דבק UV במשך ארבע דקות על ההגדרה הגבוהה.
הפוך את החלקת המכסה במהופך ולהשתמש במנורת UV כדי לרפא את דבק UV במשך ארבע דקות נוספות. מניחים פיסת נייר עדשה קטנה בגודל של 15 על 30 מילימטרים בתחתית תא ההדמיה. לחות את הנייר עם 20 עד 30 microliters של מים.
מניחים את פתק הכיסוי על התא כך שהזחלים פונים לתוך התא. השתמש דבק UV כדי לדבוק בשני הקצוות של החלקת המכסה על פני המתכת. הצד הגבי של הזחלים מוכן להדמיה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
לאחר ההדמיה, הסר את השמן על פתק הכיסוי העליון באמצעות נייר עדשה. נתק את החלק העליון של המכסה ממסגרת המתכת על-ידי חיתוך לחלל שבין החלקת המכסה למסגרת המתכת באמצעות סכין גילוח. תא ההדמיה מוכן לשימוש חוזר.
נתק את הקובואידים PDMS מתליית הכיסוי העליונה עם מדפים. גלגלו את הקובואידים PDMS על סרט דביק כדי להסיר שאריות דבק ואבק. הקובואידים של PDMS מוכנים לשימוש חוזר.
בפרוטוקול זה, זחלי דרוסופילה היו משותקים במשך יותר מ -10 שעות להדמיה רציפה. נתון זה מראה שישה זחלים שלישיים מאוחרים בכוכב המותקנים בתא. גזעי הזחלים תוקנו בזמן שראשיהם וזנבותיהם היו חופשיים לזוז.
כאן, אנו מדגימים את היישום של LarvaSPA בחקר דינמיקת דנדריט עצבית ניוון דנדריט באמצעות נוירונים בכיתה ארבע DA כמודל. כדי לשתק בהצלחה זחלים בשיטה זו, זה קריטי להפסיק לחשוף את הזחלים כדי isoflurane פעם ווים הפה להפסיק לזוז לרפא את דבק UV לפני הזחלים להתעורר באופן מלא. כדי לחקור ניוון דנדריט והתחדשות, פגיעה בלייזר יכולה להתבצע כאשר הזחלים משותקים בתא ההדמיה.
LarvaSPA עזר לנו להבין כיצד דנדריטים דינמיים גדל להיכשל innervate תאים אפידרמיס כמו פרוטאוגליקנים תא ב הכבד וכיצד phosphatidylserine נחשף על דנדריטים מנוונים לאחר פגיעה בלייזר. יש להגן על העיניים באמצעות משקפי בטיחות תוך שימוש במנורת ה-UV. לדפוק זחלים באמצעות isoflurane צריך להתבצע ברדס אדים.
