The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).

1. דור של שורות תאי מארח פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1. תאי יום 293T פלייט (או קו האריזה retroviral אחר) על 6 צלחות גם ב2 x 10 6 תאים / טוב, להיות ~ 75% ומחוברות למחרת. אם תרצה, בארות כפולות צלחת עבור כל רטרו-וירוס לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2. תאי היום לשאוב ולהוסיף 2 מיליליטר בינוני טרי צמיחה (DMEM + 10% FBS L- גלוטמין + 2 מ&quot;מ). Transfect תאים עם 5-8 ק&quot;ג כל אחד מוקטור retroviral (המכיל GFP) ווקטור אריזה (למשל., PVSVg) באמצעות Lipofectamine 2000 או מגיב דומה ובעקבות הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם DNA במשך 4-6 שעות בC-CO 2 באינקובטור 37 מעלות, ולאחר מכן להחליף בינוני עם 1 מיליליטר מדיום גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 48 שעות בחממת 37 ° C-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי יום 3. פלייט היעד (לדוגמא., הלה) על 6 צלחות גם בצפיפות של כ 10 5 תאים / טוב, להיות ~ ומחוברות 50%היום הבא. ודא transfection החיובי בתאי 293T על ידי ניטור הקרינה GFP על מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4. לאסוף supernatants את תאי 293T בעזרת פיפטה ולסנן את supernatant דרך פילטר מזרק אצטט 0.45 מיקרומטר תאית המכיל רטרו-וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מתאי הלה ולהוסיף בינוני 0.5 מיליליטר צמיחה המכיל polybrene / מיליליטר 16 מיקרוגרם. להוסיף ~ 0.5 מיליליטר של רטרו-וירוס המסונן לתאי ירידה מבחינת דגירה תאים בחממה CO 2 37 ° C למשך 24 שעות. אחסן כל רטרו-וירוס שנותר (כלומר, מלשכפל גם) בשעת 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5. אם בארות כפולות נעשו כדי ליצור רטרו-וירוס נוסף, חזור על שלב 1.7 להדביק סדרתי עם חלקיקי retroviral שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 6. מעבר transfected תאי הלה 1: 1 לאנטיביוטיקת בחירת מנה מכילה 10 סנטימטר (למשל, 500 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה מספיק זמן לתאי transduced לצמוח בחזרה בנוכחות של antibio הבחירהטיק, אחרי שיכולים להיות מופצים על ידי תאי טכניקות סטנדרטיים עם ריכוז נמוך של אנטיביוטיקה בחירה (למשל., 200 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין). הערה: תאים יכולים להיות גם נבחר clonally לבהירות אידיאלית בשלב זה, במידת צורך. </li></ol> 2. דור של להביע GFP כלמידיה trachomatis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CaCl 2 חיץ 2x (20 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 100 מ&quot;מ CaCl 2) וחיץ 4SP (0.4 מ &#39;סוכרוז, 16 מ&quot;מ Na 2 HPO 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום ג 1. הקפוא הפשירי מניית trachomatis על קרח ולדלל מייד 10 חיידקי μl ל2x CaCl חיץ 2 μl 50. הוסף 3 פלסמיד דנ&quot;א מיקרוגרם (לדוגמא., PASK-GFP-mKate2-L2), מערבב היטב ודגירה של 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב זה, להכין תאי מארח ידי trypsinizing בקבוק T-75 של תאים מקוי לתוך צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 50 XG במשך 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspenתא גלולה ד בנפח המתאים של 1x CaCl חיץ 2 לתת ריכוז סופי של 4 x 10 7 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 30 דקות (מהשלב 2.2), להוסיף 100 μl מוכן תאים מקוי לצינור תערובת שינוי (סה&quot;כ נפח 200 μl) ו דגירה 20 דקות נוספות ב 25 מעלות צלזיוס. להוסיף תערובת של תאים הפך זה 100 μl ולאחת מצלחת 6 היטב וכיסוי בינוני עם 2 מיליליטר צמיחה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור במשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3. תאי Lyse מקוי היום נגועים בג trachomatis ידי החלפה בינונית עם 1 מיליליטר DH 2 O וגירוד תאים עם קצה pipet 1,000 μl כפוף. הוסף 1 מיליליטר חיץ 4SP ולהעביר השעיה באמצעות מחט 27.5 G ~ 5 פעמים לתמוגה יעילה תא ושחרורו של ג trachomatis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 2 מיליליטר של lysate התא המכיל ג trachomatis לבקבוק T-75 המכיל monolayer מחוברות של MCC טרי מצופהתאים אוי; להוסיף 8 מיליליטר DMEM (ללא FBS) ו דגירה של שעה 2 ב 25 ° C כדי לאפשר ג trachomatis לדבוק תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לשאוב ולהוסיף מדיום גידול טרי בתוספת 10 U / G פניצילין מיליליטר ו1 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide. דגירה בקבוק במשך 48 שעות בחממה 37 ° C-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4. ודא ידי מיקרוסקופ אור שתאים נגועות ותכלילים מכילים כלמידיה חריגה. לזהות תכלילים כvacuoles בהיר במיקרוסקופ אור רגילה, וגופי כלמידיה חריגים כאובייקטים כמו טבעת בתוך תכלילים כי הם יותר מ 2 מיקרומטר קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5. Lyse תרבות על ידי החלפה בינונית עם 2 מיליליטר DH 2 O ולגרד תאים לתוך השעיה. הוסף 2 מיליליטר חיץ 4SP ולהעביר השעיה באמצעות מחט 27.5 G ~ 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 מיליליטר של lysate התא להדביק monolayer טרי של תאים מקוי בבאר יחידה בצלחת 6 היטב. דגירה תאים עם lysate לשעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס, לשאוב ולהוסיף צמיחה טרימדיום המכיל G פניצילין וcycloheximide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בחממה 37 ° C CO 2 במשך 3-5 ימים, תלוי בבריאות כללית של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.9-2.10 אחד או יותר פעמים, תרבויות צורך, passaging לתוך בארות טריות בצלחת 6-היטב עד תכלילים מחפשים נורמלים (נטולי גופים הסוטים) צמחו. בשלב זה להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לבדוק שג trachomatis להביע mKate2 (אדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיקף של עד תרבויות נגועות לדור של מניות כלמידיה גבוהה כייל, למשל על ידי קצירת transformants כלמידיה מהתאים מקוי או הלה נגוע גדלו בT-150 צלוחיות. </li></ol> 3. להדביק תאים עם כלמידיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צלחת ה- GFP-הלה בכלי תרבות רצוי, לדוגמא כלים מזכוכית תחתונה או שקופיות קאמריות להדמיה ברזולוציה גבוהה, או 24 גם צלחות לקביעת IFU והקרנת multiwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר הלוך ושובצינור זן המכיל ג trachomatis, ג muridarum, או ג pneumoniae על קרח ולדלל בHBSS לריבוי רצוי של זיהום (משרד הפנים), למשל משרד הפנים = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זיהומים או סטטי או בעזרת צנטריפוגה המבוססים על זן כלמידיה המסוים שישמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהומים עם ג serovar trachomatis LGV L2 או ג muridarum, לשטוף תאי GFP-הלה עם HBSS ו דגירה עם חיידקים מדוללים לשעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס. לשאוב ולשטוף תאים עם HBSS, דגירה תאים במדיום גידול בחממת 37 ° C-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהומים עם D serovar trachomatis ג או ג pneumoniae, לשטוף תאי GFP-הלה עם HBSS ולהוסיף חיידקים בדילול לתאים. מניחים צלחת multiwell או צלחת זכוכית תחתונה (מובטחת בקלטת במכסת צלחת multiwell) בבעל צלחת multiwell של קובץ מצורף הרוטור דלי מתנדנד בצנטריפוגה המעבדתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 900 XG ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כלי תרבות מצנטריפוגות והמקום בחממה 37 ° C CO 2 עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לשאוב בארון בטיחות ביולוגית, לשטוף תאים פעמיים עם HBSS, ולהוסיף מדיום גידול טרי. תאי מקום בC חממת CO 2 37 מעלות. </li></ol></li></ol> 4. ויזואליזציה של תא חי תכלילים כלמידיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי GFP-הלה נגוע כלמידיה מCO 2 באינקובטור ולהחליף בינוני עם RPMI ללא FBS% אדומים 5 + פנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הר על מיקרוסקופ הפוכה הקרינה (Nikon Eclipse טי-E או דומה) באמצעות מטרת 20X ומעלה שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת הדמיה (Volocity 6 או דומה), ולהתמקד בזיהוי כלמידיה נגועה תאי GFP-הלה: תאים ירוקים המכילים חורים שחורים גדולים (תכלילים כלמידיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את מקומות XYZ של אזורים המכילים תאי -infected כלמידיה של עניין באמצעות תוכנת הדמיה (כרךocity 6 או דומה). לבצע זאת על ידי ידני &#39;הוספת נקודות&#39; ואילו במצב תצוגת XY השלב. באופן זה, קואורדינטות XYZ נשמרות עבור כל מיקום מסומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיבת הדו-שיח התקנת הרכישה, להגדיר את התוכנה לרכוש ירוק (GFP, cytosol הלה) ואדום (trachomatis mKate2, ג) ערוצים, ובשיעור של מסגרות חדשות לערוץ כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את התמונה ברצף באמצעות רכישת פרוטוקול נכנס לעיל על ידי לחיצה על &quot;/ לכידה רשומה&quot; הכפתור. </li></ol> 5. Quantitation של פרמטרי צמיחת הכללה בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמנים רצויים לאחר זיהום (למשל., 24, 48 HPI) להסיר כלמידיה נגועה תאי GFP-הלה מחממה וההר במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הערה: מטרת 20X או 40X אוויר עם NA גבוה היא מתאימה ביותר לצלחות 24 גם, ומטרת נפט 40X מומלצת לשקופיות קאמריות. לגדל תאים משני מצע לזה את התחתאיי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בmidplanes של תאים, שבי תכלילים הם בקוטר המרבי שלהם ולהניב קצוות חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות לתחומים רבים וב( לפחות 10 בכל טוב) כל אחד; בארות בדרך כלל מייצגות משכפל או משתנים ניסיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנות את מספר תכלילים ידני, על ידי עין (תכלילים הם תאים שחורים בתאי ה- GFP-הלה) או להשתמש באלגוריתמי תוכנת הדמיה לזהות באופן אוטומטי ולספור תכלילים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תאי ה- GFP-ידי הלה עוצמת הקרינה (&quot;מצא את האובייקטים&quot; הפקודה) ולהתאים את עוצמת סף הקרינה המבוססת על עוצמות יחסי של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אובייקטי סינון שנבחרו באמצעות הנחיות גודל של שמירה על אלה של יותר מ -5 מיקרומטר 2 בלבד. זה &quot;אוכלוסייה 1 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל &quot;למלא חורים באובייקטים&quot; הפקודה באמצעות &quot;אוכלוסייה 1 &#39;כקלט. צעד זה מייצר &quot;אוכלוסייה 2 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;אוכלוסיית 1 &#39;הפחת מ&#39;עמ&#39;opulation 2 &#39;לתשואה חיובית מסומן תכלילים כלמידיה, המיועדים כ&#39;אוכלוסיית 3&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מסנן גודל ל&#39;אוכלוסייה 3 &#39;(הפקודה &quot;אוכלוסיית מסנן&#39;), לאובייקטי שמירת דוגמא יותר מ -25 מיקרומטר 2 לתכלילים בתאים נגועים למשך 24 שעות או יותר. לפעמי זיהום מוקדמות, כגון לפני 18 שעות, מסנן גודל מוגדר לשמור חפצים גדולים יותר מ -4 מיקרומטר 2, כתכלילים אלה הם הרבה יותר קטנים. תוצאות סינון גודל באוכלוסייה של אובייקטים המיועדים כ&#39;תכלילים &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב נתונים כמותיים מתמונות, למשל, מספר הכללה, גודל הכללה, והיקף הכללה, באמצעות תוכנת הדמיה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+infections:+progress+and+problems.">Chlamydia trachomatis infections: progress and problems.</a> The Journal of Infectious Diseases. 179, S380-S383 (1999).</li><li>Schachter, J., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+and+disease+epidemiology.">Infection and disease epidemiology.</a> Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 139-169 (1999).</li><li>Campbell, L. A., Kuo, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+pneumoniae--an+infectious+risk+factor+for+atherosclerosis.">Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).</li><li>Darville, T., Hiltke, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+genital+tract+disease+due+to+Chlamydia+trachomatis.">Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201, S114-S125 (2010).</li><li>Hackstadt, T., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology.">Cell biology.</a> Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 101-138 (1999).</li><li>Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis:+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector).">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector).</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).</li><li>Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-infected+cells:+directed+trafficking+of+Golgi-derived+sphingolipids+to+the+chlamydial+inclusion.">Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li><li>Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labelling+of+intracellular+bacteria+in+living+host+cells.">Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).</li><li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+host+cell+exit+by+the+intracellular+bacterium+Chlamydia.">Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).</li><li>Heinzen, R. A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuolar+membrane+is+not+passively+permeable+to+low-molecular-weight+compounds.">The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds.</a> Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).</li><li>Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+in+Chlamydia+trachomatis+using+the+tet+system.">Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system.</a> PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).</li><li>Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+recruitment+to+the+Chlamydia+inclusion+is+spatiotemporally+regulated+by+a+mechanism+that+requires+host+and+bacterial+factors.">Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors.</a> PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).</li><li>Agaisse, H., Derr&#233;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+trachomatis+cloning+vector+and+the+generation+of+C.+trachomatis+strains+expressing+fluorescent+proteins+under+the+control+of+a+C.+trachomatis+promoter.">A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter.</a> PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה הניסיונית ליצירת תאי מארח ניאון להדמיה בזמן אמת וניתוח של תכלילים כלמידיה. גישה להדמיה vacuole זה מקנה יכולת רבת עוצמה כדי להאיר, לעקוב ולמדוד כמותית את המאפיינים הדינמיים של תכלילים כלמידיה פני אוכלוסיות של תאים או בתאים בודדים לאורך ז?...

מחלות זיהומיות הנגרמות על ידי זנים של חיידק כלמידיה תאית לעורר נטל גדול על בריאות הגלובלית, כולל מחלות המועברים במגע מיני, מחלה דלקתית של אגן, עיוורון, דלקת ריאות ואולי טרשת עורקים 1-4. היכולת של כלמידיה לאינטראקציה עם התא המארח, מתוך vacuole (מכונה ההכללה), הוא הקובע קריטי לזיהומם המוצלח של תאים והמארח. ההכללה היא תא פתוגניים רומן המאפשר צמיחת כלמידיה והוא שונה באופן דינמי לאורך כל המחזור ההתפתחותי 2-3 היום השלם של כלמידיה 5. הטבע תאיים לחייב של chlamydiae מציג מספר רב של אתגרים לקהילת המחקר, בפרט לישירות לומד הביולוגיה הייחודית של ההכללה. מכשול עיקרי היה חוסר היכולת לחזות או כלמידיה תאית או ההכללה שלהם על ידי גישת ניאון ביעילותes בתאים חיים. תגלית האחרונה סוף סוף גילתה את האמצעים ליצור GFP להביע ג 6 trachomatis; עם זאת, ממצא זה עדיין לא הוביל לתיוג ספציפי של ההכללה. כמה טכניקות שתוארו לתיוג של חיידקים ותכלילים 7,8, אך הם סובלים מליקויים כגון אי-סגוליות, ארעיות ורגישות לphotobleaching. גילוי מפתח על ידי הקבוצה שלנו הוקם אסטרטגיה חדשה להארת ההכללה באמצעות GFP להביע תאי מארח 9. אסטרטגיה זו באופן רציונלי מנצלת את האטימות הפנימיות של קרום ההכללה למולקולות גדולות יותר מאשר 520 Da 10. כאשר תאים מהונדסים לבטא חלבון מסוים cytosolic ניאון (למשל, ה- GFP או mCherry) ביציבות, תכלילים כלמידיה נראים בבהירות יוצאת דופן על ידי ההדרה המוחלטת שלהם של הקרינה. אסטרטגית הדמיה הפוכה זה מאפשרת הדמיה מיידית של תכלילים לכל Chlמיני amydia וזה יכולים להתאים בקלות למרבית תאי המארח של עניין. כהפגנה של השירות שלה, שיטה זו שימשה בעבר כדי לחשוף ולהגדיר את נתיבי יציאה הסלולריים לכלמידיה spp 9. כאן, אנו נוספים להדגים כיצד שיטה זו מתבצעת, וניתן לנצל כדי להפיק נתונים כמותיים מפתח על דינמיקת צמיחת הכללה. יתר על כן, זה יכול למעשה תחליף לשיטות ספירה מבוסס נוגדנים יקרות וניתן להשתמש בו במקביל עם תוויות ניאון אחרות, כגון mKate2 להביע 11 כלמידיה. זה שילוב רב עוצמה של כלים מאפשר חקירה של התכונות הפיזיות של קרום הכללת כלמידיה בתוך תאי מארח חיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o phenol red</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Lab-Tek II</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>154526, 154534</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using fluorescent proteins to visualize and quantitate chlamydia vacuole growth dynamics in living cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

יכולים להיות מהונדסים תאי יונקים להביע חלבוני ניאון cytosolic (למשל, ה- GFP) כדי לאפשר הארת תכלילים כלמידיה בתרביות תאים חיות, נגועות. על הזיהום בכלמידיה, תכלילים הם בקלות לעין כמו כתמים שחורים בתאי המארח (איור 1). הבהירות של תכלילים חסרי-הקרינה יכולה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells at JoVE.com

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

using-fluorescent-proteins-to-visualize-quantitate-chlamydia-vacuole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

7.5K Views.  University of Washington. A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Video: Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. 
We generated model xenograft tumors in mice by subcutaneous injection of a human ovarian cancer cell line, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). 
We transformed attenuated strains of S. typhimurium bacteria (ELH430:SL1344 phoPQ- 1) with a constitutively expressed luciferase (luxCDABE) plasmid for visualization2. These strains specifically colonize tumors while remaining essentially non-virulent to the mouse1. 
Once measurable tumors were established, bacteria were injected intravenously via the tail vein with varying dosage. Tumor-localized, bacterial gene expression was monitored in real time over the course of 60 hours using an in vivo imaging system (IVIS). At each time point, tumors were excised, homogenized, and plated to quantitate bacterial colonies for correlation with gene expression data. 
Together, this data yields a quantitative measure of the in vivo growth and gene expression dynamics of bacteria growing inside tumors.

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. This video covers tumor cell preparation and implantation, bacteria preparation and injection, whole-animal luminescence imaging, tumor excision, and bacterial colony counting.

צמיחת מדידה וDynamics ביטוי גנים של גידול ממוקד<em&gt; ס Typhimurium</em&gt; חיידקים

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

&quot;Phagosome Closure Assay&quot; to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Assay סגירת Phagosome&quot; לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Speed

Subtitles

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת