ברצוננו להודות לד&quot;ר חישאם Abdelbary למתן דגימות כירורגית האדם בנתונים המוצגים באיור 2.

1. עיבוד רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת התוצאות הטובות ביותר, פרוטוקול זה צריך להתבצע באמצעות טרי רקמה מבודדת שהופקדו DMEM מדיה המכילה 10% FBS, 1% Pennicilin / סטרפטומיצין פתרון, ו 0.1% Amphothericin פתרון B מיד לאחר הניתוח לפני עיבוד. אם הדבר אינו אפשרי, רקמות ניתן להשאיר לילה ב 4 מעלות במדיום זה לפני עיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני עיבוד המדגם, לעקר מלקחיים מתכת להבים חד פעמיות על ידי הפקדת אותם בפתרון אתנול 70% לפחות במשך 5 דקות. כמו כן להכין צלחת 24 היטב עם 2 מ&quot;ל של DMEM מדיה המכילה 10% FBS, 1% Pennicilin / סטרפטומיצין פתרון, ו 0.1% ב Amphothericin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דגימת רקמה ברדס זרימה למינרית תרבית תאים באמצעות מלקחיים מעוקרות ואת ההפקדה רקמות צלחת ריקה 15 ס&quot;מ פטרי, לשמור את המכסה על הצד, הצד סטרילי למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע תרבית תאים, השתמש 2 מ&quot;מ ביופסיה להשיג ליבות שונים ממגוון רחב של אזורים בתוך הרקמה כמו באיור 1. הפקדה ליבות במכסה של פטרי 15 ס&quot;מ בעזרת מלקחיים, משאירים מספיק מקום בין כל ליבה כך ניתן לחתוך בקלות לאורך הציר האופקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול כל הליבה לתוך 4 / 4 אפילו באמצעות סכין גילוח מעוקרים כמו באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה pipet, לשים כל רבע הליבה של הליבה נתונה גם שונה A1 ל-A4 כמו בתרשים 1, כבר המכיל 1.5 מ&quot;ל של DMEM המכיל 10% FBS, 1% Pennicilin / סטרפטומיצין פתרון, ו 0.1% פתרון Amphothericin B . חזור על הפעולה עבור כל ליבה. זה אמור לאפשר מדגם מייצג של הגידול, תוך מזעור הטיה גם נתון / מצב. עבור ייצוג טוב יותר, להגדיל את מספר הליבות. </li></ol> 2. הערכת כדאיות רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד רקמות לאחר, להוסיף 25μl Alamar כחול טוב A1 ו-A2 # # כפי שמוצג באיור 1 ו דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות חממה humidified עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עם alamar כחול, להסיר 3 פעמים 100 μl מכל A1 ו-A2 טוב להעביר 6 בארות שונים של צלחת 96-היטב. קרא את האות באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (530 עירור, פליטה 590) ולשמור את הנתונים עבור הרשומות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אות Alamar כחול כבר לקרוא, להעביר את כל פיסות רקמות באמצעות טיפ pipet, מן A1 היטב C1 המכיל DMEM, 10% FBS + + PS AmphoB. היזהר שלא להעביר כמות מוגזמת של מדיה A1 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק בארות A3 ו-A4 בהתאמה עם PFU 6 10-GFP-לבטא ו-בלוציפראז להביע וירוס vaccinia מדולל μl 25 של התקשורת. ובכן A2 יכול להיות נגוע בווירוס הזה שמבטא כל transgene נתון כולל בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 שעות לאחר מכן, להוסיף 25 μl Alamar כחול בארות C1 ו-D1 וחזור על שלב 2.2 </li></ol> 3. ויזואליזציה של ביטוי transgene GFP על ידי מיקרוסקופ בתפרחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל תרבית תאים התקשורת המכסים את פיסות הרקמה על מנת לצלם הקרינה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכולת לנתיחה, תחילה לקחת תמונה בניגוד שלב ברזולוציה המתאימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב פלואורסצנטי לצלם תמונה באמצעות מסנן מתאים לדמיין את transgene של עניין, במקרה זה ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במסנן הקרינה באורך גל אחר עבור ככל האפשר של transgene של עניין (כגון RFP) כדי לצלם תמונה של הקרינה רקע </li></ol> 4. ויזואליזציה של הביטוי בלוציפראז באמצעות in vivo מערכת הדמיה (IVIS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא IVIS מאותחל לפני שתתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב A4 בארות B4, להוסיף 5 μl של המצע luciferin 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל, מערבבים היטב דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן החשיפה IVIS ל 5 שניות לצלם בארות שלך. אם התמונה רווי, חוזר עם זמן חשיפה נמוכה יותר. אם יש אות לא, להגדיל את זמן החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת ההדמיה IVIS, ייתכן להסיר רקע באמצעות האות מ B4 היטב לבחור את האזור של עניין לכמת את האות הארה. </li></ol> 5. הערכת titers ויראלי ידי assay פלאק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לכימות titers ויראלי, רקמות חייב להיות הראשון הומוגני לשחרר חלקיקים נגיפיים. ניתן לעשות זאת כמה חודשים לאחר מכן ב דגימות רקמה נגועים מאוחסנים -80 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הדגימה זה צריך להיות הומוגני באמצעות סולם אנליטית. במקרה זה, נשתמש מדגם שנאספו A2 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום הרקמה הוא 5 מ&quot;ל בז פוליסטירן צינור עגול התחתונה ולהוסיף 1 מ&quot;ל של PBS. Homogenize את הרקמה באמצעות homogenizer רקמות. במידת הצורך, החנות homogenate ב -80 להערכת titers ויראלי במועד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי וירוס vaccinia titer, הצלחת הראשונה 1,000,000 תאים U2OS בצלחת 6-באר ו דגירה לילה 37 מעלות, 5% CO 2 לחified כך שהם הגיעו כ 95% יום confluency הבאה חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתקשורת חופשית בסרום לעשות דילולים סדרתי של הנגיף, והקפד לשנות עצות בין כל שלב הדילול. בדרך כלל אנחנו עושים את 1 ב 10 דילולים ולהשתמש 100 μl להעביר לתוך μl 900. איך דילולים רבים עשויים תלוי התשואה הצפויה וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ביצוע דילולים, להסיר את התקשורת מכסה את התאים U20S מצופה מכן להוסיף 500 μl של המניות בדילול וירוס (עבור כל דילול) כדי להדביק את התאים U2OS. דגירה התאים עבור 1 שעה דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, לחמם את 2 X DMEM מרוכז המכיל 20% FBS, והפתרון CMC 3% באמבט המים 37 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 1 שעה, להסיר את כיסוי התקשורת תאים הנגועים U2OS. מערבבים 01:01 כרכים של CMC 3%: 2X DMEM, 20% FBS יחד ולהשתמש 2 מ&quot;ל של תערובת זו כדי לכסות את כל טוב של תאים נגועים U2OS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים התאים בחזרה 37 5% מעלות CO 2 באינקובטור humidified לעוד 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, להוסיף 2 מ&quot;ל של מקבע-חומצה אצטית מתנול על גבי שכבת CMC בכל טוב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות במנדף תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השכבה קבוע לשטוף את השארית של בארות שימוש במי ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים U2OS קבוע עם 2ml של פתרון coomassie כחול לכל היטב דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במהירות נמוכה על צלחת שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכתם coomassie מבארות ולשטוף את הצלחות שימוש במי ברז. ייבוש עם את המכסה למשך כשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאק נגיפי כתוצאה ניתן דמיינו בקלות דמות 2C. פלטות ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן הפלאק בשלב דילול שם בין 10 ל 100 הפלאק גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את מספר הפלאק נספר על ידי דילול בשימוש להכפיל את התוצאה על ידי מספר 2 לתת titer ב PFU / ml. לדוגמה, אם 25 הפלאק נספרים גם שם דילול מיליון פי שימש, כייל של המדגם חי הראשונית היא 25 כפול 1000000 כפול 2 או 50,000,000 PFU / ml. בהמשך לחלק את המספר הזה על ידי משקל בתחילה למדוד למדגם לדווח titers ב PFU / g </li></ol> 6. נציג תוצאות: על מנת לקבוע במדויק אם מדגם שהושגו בניתוח הרקמות / הגידול הוא או היא לא infectable בווירוס, יש תחילה לוודא כי דגימת רקמות היא לפחות בת קיימא. איור 1A מראה כי הכדאיות ניתן להעריך באמצעות צבע מטבולית (Alamar כחול) כי הן רקמות נורמליות הגידול יכול להישאר פעיל מבחינה מטבולית על פני תקופה של לפחות 72h. הדבר מצביע על כך רקמות vivo לשעבר תרבותי יכול לתמוך שכפול נגיפי. יתרון משמעותי של וירוסים oncolytic היא שהם יכולים להיות מהונדסים להביע transgenes טיפולית או הדמיה. איור 2D-E מראה כי ה-GFP או בלוציפראז ניתן להבחין בין רקמות נגועים לשעבר vivo, תמיכה נוספת כי רקמות אלו קיימא infectable גם. למרות הביטוי transgene מוגברת קשורה בדרך כלל עם השכפול הנגיפי, זה לא בהכרח שווה ל מחזור חיים פרודוקטיביים ויראלי שמוביל הגברה עצמית להפיץ, אשר נחשב חשוב לפעילות טיפולית. מסיבה זו, יש צורך לקבוע אם וירוס יותר מופק ממה שימש בתחילה להדביק את הרקמה. איור 2B מראה כי על כימות ויראלי ידי assay פלאק, וירוס יותר מתקבל לאחר ההדבקה 72 שעות לאחר מכן רקמה נאספו מיד לאחר ההדבקה. בסך הכל, הנתונים הללו מראים כי רקמת הגידול נכרת בניתוח יכול להישאר קיימא בתרבות התא לתקופה של לפחות 72 שעות, שבמהלכן שכפול נגיפי זמן יכול להיות נתמך. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סקירה כללית של רקמת הדגימה / חתך פרוטוקול. מדגם רקמות מעובד על ידי הסרת מספר 2 ליבות מ&quot;מ אשר מחולקים ובהמשך לארבעה אשר מופצים באופן אקראי לתוך בארות A1-A4. קודי צבע מצביעים על חומרים כימיים המשמשים גם כל אחד. אפור מוצל ריבועים בתוך בארות מייצגים כל רבע מן 6 ליבות בודדים מתואר. הרקמה היטב A1 מועבר היטב חדשה (C1) עם התקשורת לאחר הקריאה הראשונית כחול alamar. קריאה שנייה נעשה בסוף הדגירה השעה 72 עם וירוסים. וולס A4 ו-B4 הם השלימו עם Luciferin לאחר דגירה 72 שעות לאחר הפגיעה <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הכדאיות ו infectability של דגימות רקמה חולה. א) רקמות חיוניות, כפי שהיא נמדדת על ידי האות כחול alamar ב 2 שעות ו 72 שעות איסוף הדואר. ציר Y מייצג ריק המתוקן אות alamar כחול. B) titer של vaccinia וירוסאסף לגרם של דגימות רקמה 2 ו - 72 שעות לאחר ההדבקה. C) דוגמה של הפלאק vaccinia וירוס על תאים U2OS הבאים מכתים coomassie. D) הארה האות המתקבל רקמות VV-בלוציפראז נגועים המטופל באמצעות הדמיה IVIS. E) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מדגם רקמות החולה נגוע VV-GFP.

<ol>
	<li>Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+battle+between+oncolytic+viruses+and+cancer.">Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).</li><li>Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III/IV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck.">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li><li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reovirus:+Rationale+and+clinical+trial+update.">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li><li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus,+JX-594,+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer:+a+phase+I+trial.">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li><li>Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+clinical+development+landscape+for+oncolytic+viruses+and+other+cancer+therapeutics:+no+shortcuts+on+the+road+to+approval.+Cytokine+Growth+Factor+Rev.">Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev.</a> 21, 85-89 (2010).</li><li>Boeuf, F. L. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+oncolytic+viruses+augments+tumor+killing.">Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing.</a> Mol Ther. 18, 888-895 (2010).</li><li>Silva, N. D. e., Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+trouble+for+tumours:+exploiting+the+tumour+microenvironment+to+enhance+anticancer+effect+of+oncolytic+viruses.">Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).</li><li>Diallo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers.">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li><li>Cooke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumour+genetic+heterogeneity+and+poor+chemoradiotherapy+response+in+cervical+cancer.">Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer.</a> Br J Cancer. , (2010).</li><li>Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utility+of+a+Tissue+Slice+Model+System+to+Determine+Breast+Cancer+Infectivity+by+Oncolytic+Adenoviruses.">The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses.</a> J Surg Res. , 1-6 (2010).</li><li>Hochberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+of+herpes+simplex+virus+type+1+to+non-melanoma+skin+cancers.">Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers.</a> Br J Dermatol. , (2010).</li><li>Kuip, H. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אחד הצעדים קריטי פרוטוקול זה הוא השגת דגימה טרייה. אם המדגם הוא להכניס תרבית תאים לאחר המתנה ארוכה בחדר הפועלים התקשורת הולם (למשל PBS), זה עלול לפגוע ברקמות הכדאיות ולמנוע infectability. ראוי לציין, הרקמות הוא מטבעו נוטה יותר את ההשפעות הללו מאשר רקמות הגידול. עוד נקודה קריטית היא איך ליבות רבים משמשים מדגם רקמות העקביות של גודלם. חוסר עקביות בגודל תוביל השתנות פני דגימות החולה מאז גורמים כגון היפוקסיה רקמות משטח infectectable תשתנה בהתאם לגודל של ליבות רבעים הליבה. אמנם זה ניתן לפתור חלקית על ידי שימוש slicers רקמות, אחד היתרונות של השיטה המוצגת כאן היא כי הוא קל יחסית, נוטה פחות זיהום, החלים נרחב למגוון של סוגי רקמות, כולל רקמות רכות או צמיגה אשר אינן ניתנות בקלות לרקמות חיתוך. יש לציין, במספר ליבות יכול להיות מוגברת על מנת לקבל ייצוג רקמה טובה יותר. כמו כן, ליבות ניתן לחתוך לחתיכות יותר (למשל 5-8) כדי להתאים את מבחני פוטנציאליים אחרים צריך להיעשות במקביל כגון DNA, RNA, או מיצוי חלבון. עם זאת, מספר חתיכות שבו ליבות ניתן לחתוך בגדלים לשחזור יהיה תלוי בגודל בפועל של ליבות, אשר יכול להיות שונה באמצעות מקלפות בגדלים שונים. לחלופין, דרך אחת לעזור להשיג חתיכות רקמה בגודל reproducibly היא אפילו את אורך ליבות באמצעות שליט לפני יותר מישנה אותם לחתיכות קטנות יותר. הפרוטוקול יכול כמובן להיות שונה כדי להכיל וירוסים אחרים, מצאנו כי רקמות ניתן קיימא ותמיכה שכפול של עד 6 ימים. הפרוטוקול יכול עוד להתארך עד מדידות של virally-הביעו transgenes אחרים, כולל cytrokines. בעקבות הזיהום, רקמות יכולים גם להיות מוטבע פרפין להמשך חתך והכתים בשיטות immunohistochemical, אשר מאפשר עידון נוסף של היסטולוגיה הרקמה ואיך זה קשור זיהום ויראלי 10-12.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> גלוקוז גבוהה DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> NorthBio בע&quot;מ </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin פתרון B </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A2942 </td><td> השתמש ב 0.1% </td></tr><tr><td> Pennicilin-סטרפטומיצין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P4333 </td><td> השתמש ב -1% </td></tr><tr><td> Alamar כחול </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin מלח אשלגן </td><td> מוצרי הדמיה מולקולרית </td><td> D-Luciferin מלח אשלגן 1g </td><td> Resuspend ב PBS ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 0.22 מיקרומטר מסנן על מסנן </td></tr><tr><td> ממ אבקת </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> הפוך את בנפח חצי הציע לעשות ממ 2X ולסנן על 0.22 מיקרומטר לסנן לפני השימוש </td></tr><tr><td> Carboxymethyl צלולוזה (CMC) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C9481 </td><td> בצע פתרון 3% במים החיטוי deionized ו. שים לב אבקה יכול לקחת קצת זמן כדי resuspend </td></tr><tr><td> Coomassie מבריק כחול R </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 מ&quot;מ ביופסיה אגרוף </td><td> Miltex </td><td> MX-33-31 </td><td></td></tr><tr><td> פעמיים Prep Edge להבים </td><td> Personna טיפול רפואי </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי disection </td><td> לייקה </td><td> דגם M205-FA </td><td></td></tr><tr><td> בשנת vivo מערכת הדמיה (IVIS) </td><td> Caliper מדעי החיים </td><td> IVIS ® 200 סדרה </td><td></td></tr><tr><td> רקמות Tearor </td><td> Biospec מוצרים </td><td> דגם 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses

וירוסים oncolytic (OVs) הם הרפוי הרומן סלקטיבי לשכפל ולהרוג תאים סרטניים 1. מספר ניסויים קליניים להערכת היעילות של מגוון רחב של פלטפורמות כולל oncolytic HSV, Reovirus ו OVs Vaccinia כטיפול לסרטן כרגע 2-5 לדרך. אחד המאפיינים העיקריים של וירוסים oncolytic היא כי הם יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לבטא transgenes כתב המאפשר לחזות את הזיהום על ידי מיקרוסקופית של הרקמות או ביו הארה הדמיה 6,7. זו מציעה יתרון ייחודי שכן אפשר להדביק רקמות מן vivo לשעבר חולים לפני הטיפול על מנת לוודא את הסבירות virotherapy oncolytic מוצלחת 8. לשם כך, חיוני כראוי דגימת רקמות כדי לפצות על ההטרוגניות רקמות להעריך את הכדאיות רקמות, לפני במיוחד לזיהום 9. חשוב גם לעקוב באמצעות שכפול נגיפי transgenes הכתב אם הביע ידי פלטפורמת oncolytic כמו גם על ידי טיטרציה ישירה של רקמות לאחר homogenization על מנת להבחין בין זיהום הנפל ופורה. מטרת פרוטוקול זה כדי לטפל בבעיות אלה ו לעיל מתאר 1. הדגימה והכנת רקמת הגידול של תרבית תאים 2. הערכת כדאיות רקמות באמצעות צבע מטבולית alamar כחול 3. זיהום Ex vivo של רקמות בתרבית בווירוס vaccinia להביע או GFP או גחלילית בלוציפראז 4. איתור הביטוי transgene על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או באמצעות in vivo Imaging System (IVIS) 5. כימות של הנגיף על ידי assay פלאק. שיטה זו כוללת מציג מספר יתרונות, כולל הקלות של עיבוד רקמות, פיצוי על ההטרוגניות רקמות, שליטה על הכדאיות רקמות, אפליה בין זיהום הנפל ועצם בתום שכפול נגיפי.

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

וירוסים oncolytic הם מבטיחים סרטן ותרופות. היכולת לוודא את infectability של דגימות רקמה חיה המתקבל חולים לפני הטיפול הוא יתרון ייחודי של גישה זו הטיפולי. פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך רקמות עבור<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; זיהום בווירוס oncolytic וכימות ויראלי הבאים.

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

ex-vivo-infection-of-live-tissue-with-oncolytic-viruses

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

12.6K Views.  Ottawa Hospital Research Institute (OHRI). וירוסים oncolytic הם מבטיחים סרטן ותרופות. היכולת לוודא את infectability של דגימות רקמה חיה המתקבל חולים לפני הטיפול הוא יתרון ייחודי של גישה זו הטיפולי. פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך רקמות עבור לשעבר vivo זיהום בווירוס oncolytic וכימות ויראלי הבאים.

Video: Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

אקס תרבות Vivo של רקמות החולה &amp; בחינת משלוח ג&#39;ין

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

טיפול של הכותנה העכברוש במחקרים להערכה טרום-הקלינית של וירוסי Oncolytic

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarterial מינהל oncolytic וירוסים לטיפול Locoregional של Orthotopic HCC אצל חולדות

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

חלב מגבירה את הצמיחה של Enteroids: מודל לשעבר Vivo של התפשטות תאים

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant&#039;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

מהירה In Vivo ובחינת יכולות הדור של לימפוציטים T ציטוטוקסיות של אדג'וונט לפיתוח חיסון

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

מודל בעלי חיים קטנים של זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...