העבודה במעבדת המחברים נתמכה על ידי דויטשה פורסונגסג'מינשפט (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), פונדס דר Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds), ומרכז גטינגן לביולוגיה מולקולרית (GZMB). המחברים מבקשים להכיר יורג Stülke עבור הערות מועילות וקריאה ביקורתית של כתב היד.

1. הכנת צלחות אגר, מדיה תרבותית, קריוסטוקים וקדם-תרבויות
<ol><li>הכן מדיית צמיחה ריאגנטים נדרשים (ראה טבלה של חומרים ריאגנטים).</li>
	<li>פס הזנים B. subtilis (למשל. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)ו- BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) המבטאים GDHs פעיל אחד ושתיים, בהתאמה)2 שישמשו בניסוי התחרות על לוחות אגר בינוני SP כדי לקבל מושבות בודדות. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>קח מושבות בודדות לחסן צינורות תרבות סטריליים המכילים 4 מיליליטר LB נוזלי בינוני. לגדל את החיידקים לילה ב 28 °C (69 °F) ו 220 סל"ד.</li>
	<li>לגדול תרבויות לילה ב 28 °C (69 °F) כדי למנוע כי התאים lyse או לקעקע.</li>
	<li>למדוד את הצפיפות האופטית של התרבויות באורך גל של 600 ננומטר (OD600)באמצעות ספקטרופוטומטר סטנדרטי.</li>
	<li>אם התרבויות הגיעו OD600 של 2.0, לערבב 0.75 מ"ל של התרבויות עם 0.75 מיליליטר של פתרון גליצרול סטרילי 50% ב 1.5 מיליליטר צינורות תגובה. ODהסופי 600 צריך להיות 1.0 כדי להשיג cryostocks המכיל כ 108 תאים / מיליליטר.</li>
	<li>לאחסן את הצינורות ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפוך שלוש precultures של כל זן שכותרתו עם cfp ו yfp קידוד גנים פלואורופור. לחסן את precultures (צינורות תרבות סטרילית המכילה 4 מיליליטר LB נוזלי בינוני) עם 1 תאים μl מ -80 מעלות צלזיוס cryostocks. דגירה את התרבויות לילה ב 28 °C (69 °F) ו 220 סל"ד.</li>
</ol>2. Cocultivation של חיידקים, איסוף מדגם, ואחסון מדגם
<ol><li>מכינים טריים 100 מ"ל C-Glc ו- CE-Glc בינוני מינימלי (ראה טבלה של ריאגנטים וחומרים), ומעבירים 20 מ"ל של כל מדיום לתוך צלושי טלטול סטריליים 100 מ"ל.</li>
	<li>קח 0.1 מ"ל של precultures שגדלו בן לילה, לדלל אותם עם 0.9 מיליליטר LB בינוני ב 1.5 מיליליטר cuvette, ולקבוע את OD600.</li>
	<li>לניסוי התחרות, לקחת את אלה precultures של זנים שונים שיש להם ODדומה 600 בין 1.0-1.5.</li>
	<li>כדי להשיג אוכלוסיות תאים מעורבות, לדלל את התאים של precultures כי היה המתאים OD600 כדי OD600 של 0.05 ב 20 מיליליטר C-Glc ו CE-Glc בינוני מינימלי בתוספת 100 מ"ל לנער בקבוקונים. לניסוי התחרות יש לערבב בין שני הזנים ביחס של 1:1.</li>
	<li>קח 10 דגימות מיליליטר מן הבקבוקים, להעביר אותם 15 מ"ל צינורות פלסטיק, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4,000 x g בצנטריפוגה העליון שולחן סטנדרטי, ולהשליך את supernatant.</li>
	<li>לשים מחדש את התאים 0.5 מ"ל טרי LB בינוני, ולהעביר את התאים לתקרה סטרילית 1.5 מ"ל תגובה. מוסיפים 0.5 מ"ל של גליצרול סטרילי 50%, מערבבים את ההשעיה על ידי מערבולת קפדנית ומאחסנים את הדגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד להמשך הטיפול.</li>
	<li>דגירה את התאים שנותרו צלוחי לנער עד 24 שעות ב 37 °C (60 °F) ו 220 סל"ד. שמור את צלושי לנער בחושך כדי למנוע הלבנה תמונה של פלואורופורים.</li>
	<li>קח דגימות נוספות של 0.1 מיליליטר לאחר 7 שעות ו 24 שעות של צמיחה. למדוד ולשים לב OD600 של 1:10 דילול (ב C-Glc או CE-Glc בינוני מינימלי) של הדגימות.</li>
	<li>קח את הכמות המתאימה של תאים מכל תרבות כדי להפוך cryostocks כי יש OD600 של 1.0. לאחסן את הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס עד להמשך הטיפול.</li>
</ol>3. טיפול מדגמי, ציפוי והדגירה לניתוחים כמותיים
<ol><li>לאחר איסוף כל הדגימות, להפשיר את cryostocks, לדלל את התאים בתמיסת מלח 0.9% (ראה טבלה של ריאגנטים וחומרים) עד10-3.</li>
	<li>צלחת 0.1 מ"ל של 10-3 דילול על לוחות אגר בינוני SP ולהפיץ את התאים באמצעות פיפטות זכוכית סטרילית.</li>
	<li>דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עד מושבות יחיד הופיעו.</li>
</ol>4. ספירת הניצולים לפי מיקרוסקופיית פלואורסצנטי סטריאו לניתוח כמותי
<ol><li>מחלקים את תחתית צלחת האגר בעט שחור בארבעה חלקים לצורך אוריינטציה טובה יותר תוך ספירת הניצולים תחת מיקרוסקופ הפלואורסצנטי של הסטריאו.</li>
	<li>מניחים את הצלחת במהופך מתחת למיקרוסקופ ומביאים את המושבות לפוקוס באמצעות מקור האור הקר.</li>
	<li>לאחר שהמושבות נמצאות במוקד, עבור אל ערכת המסנן המתאימה עבור CFP כדי לדמיין את התאים ששרדו של הזן בעל התווית cfp. לספור את הניצולים של זן זה על ידי תיוג המושבות עם עט ולשים לב למספר.</li>
	<li>הסר את התוויות עם אתנול ולעבור למסנן YFP להגדיר לדמיין את התאים ששרדו של זן yfpשכותרתו. לספור את הניצולים שוב על ידי תיוג המושבות עם עט ולשים לב למספר.</li>
</ol>5. טיפול מדגמי ומיקרוסקופיה לניתוחים חצי שוויוניים
<ol><li>לנתונים הממחישים, ספוט 10 μl של10-4 דילול (כ 100 תאים) משלב 3.1 על צלחת אגר SP (ראה איור 3).</li>
	<li>דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עד מושבות יחיד הופיעו.</li>
	<li>מניחים את צלחת פטרי ללא מכסה מתחת למיקרוסקופ ומביאים את המקום לפוקוס באמצעות מקור האור הקר.</li>
	<li>צלם תמונות של המקומות להמחשה של דמויות. בחר זמן חשיפה מתאים לצילום התמונות של המושבות עם מקור האור הקר.</li>
	<li>מבלי להזיז את הלוח, עבור למסנן CFP, התאם את זמן החשיפה וצלם תמונה. בצע את אותו הדבר עם ערכת המסננים של YFP ושמור את התמונות לניתוחים נוספים.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>השתמש בתוכנות כגון Excel עבור ניתוחי הנתונים הכמותיים. בהתבסס על המושבות שנספרו, לחשב את אחוז המושבות הצהובות והכחולות ביחס למספר שלם של מושבות, אשר מוגדרים 100%.</li>
	<li>השתמש במספרים המחושבים כדי ליצור דיאגרמת עמודות מוערמות (ראו איור 4 ואיור 5). השתמשו בתוכנית לעיבוד תמונות כמו Adobe Photoshop לבניית תמונות ממוזגות של התמונות שצולמו מהנקודות השונות. לחלופין, התוכנה הזמינה בחופשיות ImageJ, להורדה <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> יכול לשמש לעיבוד תמונה.</li>
	<li>פתח את התמונות מנקודה אחת שצולמו באמצעות ערכת המסננים CFP והמסנן YFP. מטב את הניגודיות ואת הבהירות כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע מהמדיה.</li>
	<li>עבור לאחת התמונות ובחר הכל. העתק את התמונה והדבק אותה בתמונה האחרת.</li>
	<li>השתמש בפונקציה "השתמטות צבע" כדי למזג את התמונות או לכסות את התמונות הפלואורסצנטיות באמצעות הכרטיסיה ערוצים. תמונות ממוזגות של המושבות מאמצעי תקשורת שונים ונקודות זמן שונות מייצגות את הצמיחה של הזנים השונים בתרבות הנוזלית.</li>
</ol>7. טיפים ספציפיים: ניסוי מתג צבע ו Cocultivation של זנים Isogenic שכותרתו עם cfp ו yfp
הביטוי של אחד משני הגנים המקודדים פלואורופור ב B. subtilis עשוי להשפיע על כושר ובכך את קצב הצמיחה של החיידקים. לכן, מומלץ לבצע את הניסויים הבאים על מנת לשלול כי חיסול של זן מתחרה אחד מאוכלוסיית התא במהלך הטיפוח הוא פשוט בשל השפעה שלילית של הפלואורפור:
<ol><li>חזור על כל הניסוי ו cocultivate זנים מתויגים הפוך(למשל, הזן הקודם cfpשכותרתו מסומנת כעת עם הגן yfp ולהיפך). למרות ההופכי, התוצאות שהתקבלו צריך להיות דומה התצפית הקודמת כי זן אחד יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני הזן השני.</li>
	<li>חזור על כל הניסוי ו cocultivate זנים isogenic שכותרתו yfp ו CFP (למשל BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)ו BP41(rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). להעריך את ההשפעה השלילית של אחד משני פלואורופורים על כושר של החיידקים על ידי ביצוע הרכב אוכלוסיית התא לאורך זמן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buescher, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+network+reorganization+during+dynamic+adaptations+of+Bacillus+subtilis+metabolism.">Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism.</a> Science. 335, 1099-1103 (2012).</li><li>Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection-driven+accumulation+of+suppressor+mutants+in+Bacillus+subtilis:+the+apparent+high+mutation+frequency+of+the+cryptic+gudB+gene+and+the+rapid+clonal+expansion+of+gudB++suppressors+are+due+to+growth+under+selection.">Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Al Mamum, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+and+function+of+a+large+gene+network+underlying+mutagenic+repair+of+DNA+breaks.">Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks.</a> Science. 338, 1344-1348 (2012).</li><li>Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speedy+speciation+in+a+bacterial+microcosm:+new+species+can+arise+as+frequently+as+adaptations+within+a+species.">Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species.</a> ISME J. 7, 1080-1091 (2013).</li><li>Maughan, H., Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fitness+and+alteration+of+metabolic+pathways+during+Bacillus+subtilis+evolution+in+the+laboratory.">Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).</li><li>Burkholder, P. R., Giles, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+biochemical+mutations+in+Bacillus+subtilis.">Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis.</a> Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).</li><li>McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+domestication+of+a+biofilm-forming+bacterium.">Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium.</a> J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).</li><li>Zeigler, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+of+168,+W23,+and+other+Bacillus+subtilis+legacy+strains.">The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains.</a> J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).</li><li>Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., St&#252;lke, J., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-frequency+mutation+in+Bacillus+subtilis:+requirements+for+the+decryptification+of+the+gudB+glutamate+dehydrogenase.">A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase.</a> 194, 1036-1044 (2012).</li><li>Commichau, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Bacillus+subtilis+mutants+with+carbon+source-independent+glutamate+biosynthesis.">Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).</li><li>Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+suppressors+and+recovery+of+repressed+biochemical+memory.">Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory.</a> J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).</li><li>Gunka, K., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+glutamate+homeostasis+in+Bacillus+subtilis:+a+complex+interplay+between+ammonium+assimilation,+glutamate+biosynthesis+and+degradation.">Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation.</a> Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).</li><li>Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+the+glutamate+pool+concentrations+in+enteric+bacteria.">Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).</li><li>Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+regulation+of+Bacillus+subtilis+glutamate+dehydrogenase+genes.">Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes.</a> J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).</li><li>Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., St&#252;lke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+protein-protein+interaction+governs+glutamate+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis:+the+glutamate+dehydrogenase+RocG+moonlights+in+controlling+the+transcription+factor+GltC.">A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC.</a> Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).</li><li>Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+effects+of+mutations+in+bacteria.">Fitness effects of mutations in bacteria.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).</li><li>Rabatinov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#948;+subunit+of+RNA+polymerase+is+required+for+rapid+changes+in+gene+expression+and+competitive+fitness+of+the+cell.">The &#948; subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell.</a> J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).</li><li>Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+mutations+that+prevent+crosstalk+enable+the+expansion+of+paralogous+signalling+protein+families.">Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families.</a> Cell. 150, 222-232 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (15), (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מספר שיטות פותחו כדי לנתח כושר תחרותי שלחיידקים 16. במקרים רבים החיידקים תויגו עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה שונות17. בדומה לגישה שלנו, תיוג התאים עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה מאפשר הערכה של כושר תחרותי של החיידקים במהלך cocultivation בתנאי גדילה מוגדרים. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כ...

חיידקי קרקע ניחנים בדרך כלל ברשתות רגולטוריות גמישות ויכולות מטבוליות רחבות. שתי התכונות מאפשרות לתאים להתאים את המסלולים הקטבוליים והאנאבוליים שלהם כדי להתחרות עם חבריהם ומיקרואורגניזמים אחרים עבור החומרים המזינים, הזמינים בנישה אקולוגית נתונה1. עם זאת, אם החיידקים אינם מסוגלים להסתגל לסביבתם מנגנונים אחרים עשויים להסביר את הישרדותו של מין. ואכן, כמו חיידקים רבים להתרבות מהר ואת האוכלוסיות יכול להגיע צפיפות תאים גבוהה תת-אוכלוסיות אולי צברו באופן ספונטני מוטציות מועילות המספקות לתאים יתרון גדילה סלקטיבי ולכן להגדיל את הכושר שלהם. יתר על כן, נקודות חמות מוטציה ו mutagenesis הסתגלות הנגרמת על ידי מתח יכול להקל על האבולוציה של חיידק לא מזוהה2,3. לכן, הצטברות של מוטציות וצמיחה תחת בחירה רציפה היא המקור למגוון המיקרוביאלי העצום, אפילו בתוך אותו סוג4,5. כמו בטבע, עיצוב של גנומים חיידקיים מתרחש גם במעבדה עקב טיפוח מתמשך תחת בחירה. הדבר בא לידי ביטוי בביות של החיידק גראם חיובי B. subtilis, אשר משמש ברחבי העולם במחקר בסיסי ובתעשייה. בשנות ה-40 של ה-40 טופלה סובטיליס בצילומי רנטגן מזיקים לדנ"א ולאחר מכן בטיפוח בתנאי צמיחה מסוימים6. המוטציות שהצטברו בחיידקים במהלך הביות שלהם מסבירות את אובדן מאפייני הגדילה הרבים, כלומר זן מעבדת B. subtilis 168 איבד את היכולת ליצור מושבות מורכבות7,8.
כיום, עבור חיידקי המודל הנחקרים ביותר Escherichia coli ו- B. subtilis, מגוון כלים רבי עוצמה זמינים לתפעל גנטית את הגנום שלהם כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות. לפעמים חוסר ההשבתה של גן עניין גורם פגם צמיחה חמור, אשר לאחר מכן גלוי בבירור על מדיום צמיחה סטנדרטי9. לעומת זאת, לעתים קרובות מתעלמים ממוטציות הגורמות לפגם צמיחה חלש ובכך משפיעות רק במעט על כושר הזן. עם זאת, בשני המקרים דגירה ממושכת והעברת זנים מוטנטים במשך כמה דורות בדרך כלל לגרום הצטברות של מוטנטים מדכאים כי החזירו את הפנוטיפ של זן האב2,9. האפיון של מוטנטים מדכאים וזיהוי המוטציות שהחזירו את פגם הצמיחה של זן מוטנט האב היא גישה מועילה מאוד המאפשרת הבהרה של תהליכים תאיים חשובים ולעתים קרובות חדשניים10,11.
אנו מעוניינים בשליטה של הומאוסטזיס גלוטמט ב B. subtilis12. בדומה ל- E. coli, B. subtilis מגיב להטרדה של הומאוסטזיס גלוטמט (כלומרלחסום השפלה גלוטמט2) על ידי הצטברות של מוטנטים מדכאים. השינויים הגנומיים במוטנטים מדכאים אלה שנרכשו על ידי מוטציה ספונטנית הוכחו כמשקמים במהירות הומאוסטזיס גלוטמט9,13. לכן, אין זה מפתיע כי הסתגלות של B. subtilis למצב צמיחה ספציפי במהלך ביות של החיידק משתקף סינתזת אנזים ובפעילויות אנזימטיות התפתחו, אשר מעורבים בחילוף החומרים גלוטמט12. הוצע כי חוסר גלוטמט אקסוגני במדיום הצמיחה במהלך תהליך הביות היה הכוח המניע להופעת קיבעון של גלוטמט מסתורי דהידרוגנאז (GDH) gudBCR גן בזן המעבדה 1682,14. השערה זו נתמכת על ידי התצפית שלנו כי הכמות המופחתת של פעילות GDH בזן המעבדה מספקת לחיידקים יתרון גדילה סלקטיבי כאשר גלוטמט אקסוגני הוא נדיר2. יתר על כן, טיפוח של זן B. subtilis, סינתזה של GDH GudB, בהיעדר תוצאות גלוטמט אקסוגני הצטברות של מוטנטים מדכאים שהשביתו את הגן gudB 2. ברור, הנוכחות של GDH פעיל קטבולי הוא נחות עבור התא כי גלוטמט המיוצר באנדוגניות כי אחרת יכול לשמש אנבוליזם הוא מושפל אמוניום ו 2-oxoglutarate (איור 1). לעומת זאת, כאשר גלוטמט מסופק על ידי המדיום, זן B. subtilis מצויד בפעילות GDH ברמה גבוהה יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני זן כי מסנתז רק GDH פונקציונלי אחד. סביר להניח שפעילות GDH ברמה גבוהה מאפשרת לחיידקים להשתמש בגלוטמט כמקור פחמן שני בנוסף למקורות פחמן אחרים המסופקים על ידי המדיום2 (ראו איור 1). לכן, פעילות GDH משפיעה מאוד על כושר של חיידקים, בהתאם לזמינות של גלוטמט אקסוגני.
כאן אנו מציגים שיטה מאוד להמחשה כדי לנטר ולהמחיש תחרות תוך-מינית בין שני זנים של B. subtilis השונים במקום אחד על הכרומוזום (איור 2). שני הזנים סומנו עם הגנים yfp ו- cfp המקודדים את YFP ו- CFP פלואורופורים, ו cocultivated בתנאים תזונתיים שונים. על ידי דגימה לאורך זמן ועל ידי ציפוי דילול מתאים על צלחות אגר הניצולים בכל אחת מהתרבויות ניתן לפקח בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו נפוץ. ההליך המתואר במאמר זה קל לביצוע ומתאים לדמיין את ההתפשטות המהירה של שיבוט וחיסול מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים לאורך זמן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="814">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">3746</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Agar</td>
			<td style="width:175px;">Difco, USA</td>
			<td style="width:111px;">214010</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="61" rowspan="2" style="height:61px;width:363px;">Ammonium ferric citrate (CAF)</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">9714</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">5239</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Glucose</td>
			<td style="width:175px;">Applichem, Germany</td>
			<td style="width:111px;">A3617</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Glycerol</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">4043</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">K2HPO4 x 3 H2O</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">6878</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">KCl</td>
			<td style="width:175px;">Applichem, Germany</td>
			<td style="width:111px;">A3582</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">3904</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">KOH</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">6751</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">MgSO4 x 7 H2O&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">P027</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">MnCl2&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">T881</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="61" rowspan="2" style="height:61px;width:363px;">MnSO4 x 4 H2O</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Merck Millipore, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">102786</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">NaCl</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">9265</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Nutrient broth</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">X929</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Potassium glutamate</td>
			<td style="width:175px;">Applichem, Germany</td>
			<td style="width:111px;">A3712</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tryptone</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">8952</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:175px;">Applichem, Germany</td>
			<td style="width:111px;">A3445</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">2363</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">1.5 ml Reaction tubes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">72,690,001</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">2.0 ml Reaction tubes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">72,691</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">15 ml Plastic tubes with screw cap</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">62,554,001</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">82.1473</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">1.5 ml Polystyrene cuvettes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">67,742</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">15 ml Glass culture tubes&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Brand, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">7790 22</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">with aluminium caps</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">100 ml Shake flasks with aluminium caps</td>
			<td style="width:175px;">Brand, Germany</td>
			<td style="width:111px;">928 24</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Sterile 10 ml glass pipettes</td>
			<td style="width:175px;">Brand, Germany</td>
			<td style="width:111px;">278 23</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Incubator (28 and 37 &#176;C)</td>
			<td style="width:175px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:111px;">M1282-0012</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="85" rowspan="3" style="height:85px;width:363px;">Standard pipette set (2-20 &#956;l, 10-100 &#956;l, 100-1000 &#956;l)</td>
			<td rowspan="3" style="width:175px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:111px;">4910&#160;000.034, 4910 000.042,&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">4910 000.042,</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:111px;">4910 000.069&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="101" rowspan="2" style="height:101px;width:363px;">Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">75002425</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:363px;">Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Heraeus Biofuge Primo R, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">75005440</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="101" rowspan="2" style="height:101px;width:363px;">Standard spectrophotometer</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">80-2112-21&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">Stereofluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss SteREO Lumar V12, Germany</td>
			<td style="width:111px;">495008-0009-000</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Freezer (-20 and -80 &#176;C)</td>
			<td style="width:175px;">-</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Fridge (4 &#176;C)</td>
			<td style="width:175px;">-</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">Autoclave</td>
			<td style="width:175px;">Zirbus, LTA 2x3x4, Germany</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">pH meter</td>
			<td style="width:175px;">pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany</td>
			<td style="width:111px;">766</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="61" rowspan="2" style="height:61px;width:363px;">Vortex</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Vortex&#160; 3, IKA, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">3340000</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:363px;">Balance</td>
			<td rowspan="3" style="width:175px;">CP2202S, Sartorius, Germany</td>
			<td style="width:111px;">replaced by</td>
			<td rowspan="3" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">CPA2202S</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Black pen (permanent marker)</td>
			<td style="width:175px;">Staedler, Germany</td>
			<td style="width:111px;">317-9</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Powerpoint program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft, USA</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">Office Excel program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft, USA</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Program for data processing</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:175px;">Adobe, USA</td>
			<td style="width:111px;">replaced by CS6, download</td>
			<td style="width:167px;">Computer program for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Computer</td>
			<td style="width:175px;">PC or Mac</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss, Germany</td>
			<td style="width:111px;">410135 1002 110</td>
			<td style="width:167px;">AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:815px;">Specific solution recipes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">SP medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">8 g Nutrient broth</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">0.25 mg MgSO4 x 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">1 g KCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">if required, add 15 g agar for solid SP medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:815px;">2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">LB medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 g Tryptone</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">5 g Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 g NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">if required, add 15 g agar for solid LB medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">C-Glc minimal medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">200 ml 5 x C salts</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml III&#8217; salts</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">CE-Glc minimal medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">200 ml 5 x C salts</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml III&#8217; salts</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">20 ml Glutamate (40%)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">5 x C salts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">20 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">80 g K2HPO4 x 3 H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">16.5 g (NH4)2SO4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">III&#8217; salts</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">0.232 g MnSO4 x 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">12.3 g MgSO4 x 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">40% Glutamate solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">200 g L-Glutamic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">0.9% Saline (NaCl) solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">50% Glycerol solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">295 ml Glycerol (87%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:815px;">Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:648px;">Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:167px;">Laboratory strain collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:648px;">Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:648px;">Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:648px;">Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains

מיקרואורגניזמים רבים כגון חיידקים מתרבים מהר מאוד והאוכלוסיות עשויות להגיע לצפיפויות תאים גבוהות. שברים קטנים של תאים באוכלוסייה תמיד צברו מוטציות מזיקות או מועילות לתא. אם אפקט הכושר של מוטציה מספק תת-אוכלוסין עם יתרון צמיחה סלקטיבי חזק, האנשים של תת-אוכלוסיות זו עשויים במהירות outcompete ואפילו לחסל לחלוטין את חבריהם המיידיים. לכן, שינויים גנטיים קטנים הצטברות מונחה בחירה של תאים שרכשו מוטציות מועילות עלול להוביל לשינוי מוחלט של הגנוטיפ של אוכלוסיית התא. כאן אנו מציגים הליך כדי לפקח על התפשטות שיבוט מהירה וחיסול של מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן על ידי cocultivation של אנשים שכותרתו פלואורסצנטית של חיידק מודל גרם חיובי Bacillus subtilis. השיטה קלה לביצוע וממחישה מאוד כדי להציג תחרות intraspecies בקרב אנשים באוכלוסיית תאים חיידקיים.

השיטה המתוארת כאן הוחלה בהצלחה כדי לדמיין תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים המורכבת מזני B. subtilis שסומנו בגנים cfp ו- yfp המקודדים את הפלואורופורים CFP ו- YFP, בהתאמה. כפי שמוצג באיור 3, ניתן להשתמש בשיטה כדי לדמיין תחרות תוך-מין באופן הממחיש מאוד. על ידי איתור הדגימות על אזורים ק...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains at JoVE.com

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנטית.

ניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים חיידקיים על ידי Cocultivation של זנים שכותרתו פלואורסצנטית

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

monitoring-intraspecies-competition-bacterial-cell-population

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Georg-August University. חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנט?...

Video: Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Title Cell Encapsulation by Droplets

תא כותרת Encapsulation על ידי טיפות

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

באמצעות מתאם תמונה דיגיטלי לאפיין זנים מקומיים בדגימות רקמת כלי דם

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...