وقد دعم العمل في مختبر المؤلفين دويتشه فرانشونجسجيمينشافت (http://www.dfg.de؛ CO 1139/1-1)، ومؤسسة دير شيمشين للصناعات (http://www.vci.de/fonds)، ومركز غوتنغن للبيولوجيا الجزيئية (GZMB). ويود المؤلفون أن يعترفوا بيورغ ستولكي لتعليقاته المفيدة وقراءة المخطوطة النقدية.

1. إعداد لوحات أجار، وسائل الإعلام الثقافية، Cryostocks، والثقافات المسبقة
<ol><li>إعداد وسائط النمو والكواشف المطلوبة (انظر جدول المواد والكواشف).</li>
	<li>خط سلالات B. subtilis (على سبيل المثال. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) و BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) معبرا عن واحد واثنين من GDHs النشطة ، على التوالي) 2 التي سيتم استخدامها في تجربة المنافسة على لوحات أجار متوسطة SP للحصول علىمستعمرات واحدة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 °C.</li>
	<li>خذ مستعمرات واحدة وأنابيب زراعة معقمة تلقيح تحتوي على 4 مل LB السائل المتوسط. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.</li>
	<li>تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية لتجنب أن الخلايا lyse أو sporulate.</li>
	<li>قياس الكثافة البصرية للثقافات على طول موجي من 600 نانومتر (OD600)باستخدام مطياف قياسي.</li>
	<li>إذا كانت الثقافات قد وصلت إلى OD600 من 2.0, مزيج 0.75 مل من الثقافات مع 0.75 مل من محلول الجلسرين 50٪ معقمة في أنابيب رد الفعل 1.5 مل. يجب أن يكون OD600 النهائي 1.0 للحصول على cryostocks تحتوي على حوالي 108 خلايا / مل.</li>
	<li>تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية.</li>
	<li>جعل ثلاثة ثقافات مسبقة من كل سلالة وصفت مع cfp وyfp ترميز جينات الفلوروفور. تلقيح الثقافات المسبقة (أنابيب زراعة معقمة تحتوي على 4 مل LB السائل المتوسط) مع 1 ميكرولتر من خلايا التبريد -80 درجة مئوية. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.</li>
</ol>2. Cocultivation من البكتيريا، وجمع العينات، وتخزين العينات
<ol><li>إعداد طازجة 100 مل C-Glc و CE-Glc الحد الأدنى المتوسط (انظر الجدول من الكواشف والمواد), ونقل 20 مل من كل وسيط في العقيمة 100 مل يهز قوارير.</li>
	<li>خذ 0.1 مل من الثقافات المسبقة التي نمت بين عشية وضحاها، وتمييعها مع 0.9 مل LB المتوسطة في cuvette 1.5 مل، وتحديد OD600.</li>
	<li>لتجربة المنافسة، خذ تلك الثقافات المسبقة من السلالات المختلفة التي لديها OD600 مماثلة بين 1.0-1.5.</li>
	<li>للحصول على مجموعات الخلايا المختلطة، تمييع خلايا الثقافات المسبقة التي كان OD600 المناسبة إلى OD600 من 0.05 في 20 مل C-Glc و CE-Glc الحد الأدنى المتوسط تكملها في 100 مل يهز قوارير. لتجربة المنافسة يجب أن تكون مختلطة بين سلالة اثنين في نسبة 1:1.</li>
	<li>خذ عينات 10 مل من القوارير، ونقلها إلى أنابيب بلاستيكية 15 مل، وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 4000 × غرام في جهاز طرد مركزي أعلى الجدول القياسي، والتخلص من supernatant.</li>
	<li>Resuspend الخلايا في 0.5 مل من المتوسطة LB الطازجة, ونقل الخلايا إلى معقمة 1.5 مل كوب رد الفعل. إضافة 0.5 مل من 50٪ الجلسيرول العقيمة, خلط تعليق دوامة صارمة, وتخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية حتى مزيد من العلاج.</li>
	<li>احتضان الخلايا التي تترك في قوارير اهتزاز لمدة تصل إلى 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة. الحفاظ على قوارير يهز في الظلام لمنع تبييض الصور من الفلوروفوريس.</li>
	<li>خذ عينات أخرى من 0.1 مل بعد 7 ساعات و 24 ساعة من النمو. قياس وملاحظة OD600 من 1:10 التخفيف (في C-Glc أو CE-Glc الحد الأدنى المتوسط) من العينات.</li>
	<li>خذ الكمية المناسبة من الخلايا من كل ثقافة لجعل cryostocks التي لديها OD600 من 1.0. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من العلاج.</li>
</ol>3. عينة العلاج، والطلاء، واحتضان للتحليلات الكمية
<ol><li>بعد جمع جميع العينات، إذابة المبردات، وتمييع الخلايا في محلول ملحي 0.9٪ (انظر جدول الكواشف والمواد) تصل إلى10-3.</li>
	<li>لوحة 0.1 مل من تخفيف10-3 على لوحات أجار متوسطة SP وتوزيع الخلايا باستخدام ماصة الزجاج العقيم.</li>
	<li>احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الظلام حتى ظهرت مستعمرات واحدة.</li>
</ol>4. عد الناجين من قبل مجسم مضان المجهر للتحليل الكمي
<ol><li>تقسيم الجزء السفلي من لوحة أجار مع قلم أسود في أربعة أجزاء للحصول على اتجاه أفضل في حين عد الناجين تحت المجهر مضان ستيريو.</li>
	<li>ضع اللوحة رأسا على عقب تحت المجهر واجلب المستعمرات إلى التركيز باستخدام مصدر الضوء البارد.</li>
	<li>مرة واحدة في المستعمرات هي في التركيز، والتحول إلى مجموعة مرشح المناسبة لCFP لتصور الخلايا المتبقية من سلالة cfpالمسمى. عد الناجين من هذه السلالة عن طريق وضع علامة على المستعمرات بقلم وملاحظة الرقم.</li>
	<li>إزالة التسميات مع الإيثانول والتحول إلى مرشح YFP تعيين لتصور الخلايا المتبقية من سلالة yfpالمسمى. عد الناجين مرة أخرى عن طريق وضع علامة على المستعمرات بقلم وملاحظة الرقم.</li>
</ol>5. عينة العلاج والتنظير المجهري للتحليلات شبه الكمي
<ol><li>للاطلاع على الأرقام التوضيحية، بقعة 10 ميكرولتر من تخفيف10-4 (حوالي 100 خلية) من الخطوة 3.1 على لوحة أجار SP (انظر الشكل 3).</li>
	<li>احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الظلام حتى ظهرت مستعمرات واحدة.</li>
	<li>ضع طبق بيتري دون غطاء تحت المجهر واجلب البقعة إلى التركيز باستخدام مصدر الضوء البارد.</li>
	<li>التقاط صور للبقع لشخصيات توضيحية. اختيار وقت التعرض المناسب لالتقاط صور المستعمرات مع مصدر الضوء البارد.</li>
	<li>دون تحريك لوحة، وتغيير إلى مجموعة مرشح CFP، وضبط وقت التعرض واتخاذ صورة. افعل الشيء نفسه مع مجموعة فلتر YFP وحفظ الصور لإجراء مزيد من التحليلات.</li>
</ol>6. تحليل البيانات
<ol><li>استخدام برامج مثل Excel لتحليل البيانات الكمية. استنادا إلى المستعمرات التي تم عدها، احسب النسبة المئوية للمستعمرات الصفراء والزرقاء فيما يتعلق بعدد المستعمرات بالكامل، والتي تم تعيينها إلى 100٪.</li>
	<li>استخدم الأرقام المحسوبة لإنشاء مخطط شريطي مكدس (انظر الشكل 4 والشكل 5). استخدم برنامج معالجة الصور مثل Adobe Photoshop لإنشاء صور مدمجة للصور الملتقطة من مواقع مختلفة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام برنامج ImageJ المتاح مجانا ، القابل للتنزيل من <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> لمعالجة الصور.</li>
	<li>افتح الصور من بقعة واحدة تم التقاطها باستخدام مجموعة فلتر CFP ومجموعة مرشح YFP. تحسين التباين والسطوع للحد من أي مضان الخلفية من وسائل الإعلام.</li>
	<li>انتقل إلى إحدى الصور وحدد الكل. نسخ الصورة ولصقها على الصورة الأخرى.</li>
	<li>إما استخدام وظيفة "دودج اللون" لدمج الصور أو تراكب الصور الفلورية باستخدام علامة التبويب القنوات. الصور المدمجة للمستعمرات من وسائل الإعلام المختلفة ونقاط زمنية مختلفة تمثل نمو سلالات مختلفة داخل الثقافة السائلة.</li>
</ol>7. نصائح محددة: صبغ التبديل التجربة و Cocultivation من سلالات Isogenic المسمى مع cfp وyfp
التعبير عن أي من اثنين من الجينات ترميز الفلوروفوري في B. subtilis قد تؤثر على اللياقة البدنية، وبالتالي معدل نمو البكتيريا. لذلك ، يوصى بإجراء التجارب التالية لاستبعاد أن القضاء على سلالة منافس واحد من مجموعة الخلايا أثناء الزراعة يرجع ببساطة إلى تأثير سلبي للفلوروفور:
<ol><li>كرر التجربة بأكملها و cocultivate سلالات وصفت عكسيا(على سبيل المثال، في وقت سابق cfpالمسمى سلالة الآن مع الجين yfp والعكس بالعكس). وعلى الرغم من عكس ذلك، ينبغي أن تكون النتائج التي تم الحصول عليها مماثلة للملاحظة السابقة بأن إحدى السلالات تتمتع بميزة نمو انتقائية على السلالة الأخرى.</li>
	<li>كرر التجربة بأكملها وسلالات cocultivate isogenic المسمى مع yfp وcfp (على سبيل المثال BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) و BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). تقدير التأثير السلبي لأي من الفلوروفوريس اثنين على اللياقة البدنية للبكتيريا باتباع تكوين السكان الخلية مع مرور الوقت.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buescher, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+network+reorganization+during+dynamic+adaptations+of+Bacillus+subtilis+metabolism.">Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism.</a> Science. 335, 1099-1103 (2012).</li><li>Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection-driven+accumulation+of+suppressor+mutants+in+Bacillus+subtilis:+the+apparent+high+mutation+frequency+of+the+cryptic+gudB+gene+and+the+rapid+clonal+expansion+of+gudB++suppressors+are+due+to+growth+under+selection.">Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Al Mamum, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity+and+function+of+a+large+gene+network+underlying+mutagenic+repair+of+DNA+breaks.">Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks.</a> Science. 338, 1344-1348 (2012).</li><li>Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speedy+speciation+in+a+bacterial+microcosm:+new+species+can+arise+as+frequently+as+adaptations+within+a+species.">Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species.</a> ISME J. 7, 1080-1091 (2013).</li><li>Maughan, H., Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fitness+and+alteration+of+metabolic+pathways+during+Bacillus+subtilis+evolution+in+the+laboratory.">Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).</li><li>Burkholder, P. R., Giles, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+biochemical+mutations+in+Bacillus+subtilis.">Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis.</a> Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).</li><li>McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+domestication+of+a+biofilm-forming+bacterium.">Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium.</a> J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).</li><li>Zeigler, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+of+168,+W23,+and+other+Bacillus+subtilis+legacy+strains.">The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains.</a> J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).</li><li>Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., St&#252;lke, J., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-frequency+mutation+in+Bacillus+subtilis:+requirements+for+the+decryptification+of+the+gudB+glutamate+dehydrogenase.">A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase.</a> 194, 1036-1044 (2012).</li><li>Commichau, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Bacillus+subtilis+mutants+with+carbon+source-independent+glutamate+biosynthesis.">Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).</li><li>Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+suppressors+and+recovery+of+repressed+biochemical+memory.">Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory.</a> J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).</li><li>Gunka, K., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+glutamate+homeostasis+in+Bacillus+subtilis:+a+complex+interplay+between+ammonium+assimilation,+glutamate+biosynthesis+and+degradation.">Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation.</a> Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).</li><li>Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+the+glutamate+pool+concentrations+in+enteric+bacteria.">Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).</li><li>Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+regulation+of+Bacillus+subtilis+glutamate+dehydrogenase+genes.">Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes.</a> J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).</li><li>Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., St&#252;lke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+protein-protein+interaction+governs+glutamate+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis:+the+glutamate+dehydrogenase+RocG+moonlights+in+controlling+the+transcription+factor+GltC.">A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC.</a> Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).</li><li>Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+effects+of+mutations+in+bacteria.">Fitness effects of mutations in bacteria.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).</li><li>Rabatinov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#948;+subunit+of+RNA+polymerase+is+required+for+rapid+changes+in+gene+expression+and+competitive+fitness+of+the+cell.">The &#948; subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell.</a> J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).</li><li>Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+mutations+that+prevent+crosstalk+enable+the+expansion+of+paralogous+signalling+protein+families.">Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families.</a> Cell. 150, 222-232 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (15), (2012).</li></ol>

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

وقد وضعت عدة طرق لتحليل اللياقة التنافسية للبكتيريا16. في كثير من الحالات وصفت البكتيريا مع أشرطة مقاومة المضادات الحيوية المختلفة17. على غرار نهجنا ، فإن وضع العلامات على الخلايا باستخدام أشرطة مقاومة المضادات الحيوية يسمح بتقييم اللياقة التنافسية للبكتيريا أثناء cocultivation في ?...

وعادة ما تكون بكتيريا التربة مزودة بشبكات تنظيمية مرنة وقدرات استقلابية واسعة. كلا الميزتين تمكن الخلايا لضبط مساراتها تقويضي والابتنائية للتنافس مع زملائهم والكائنات الحية الدقيقة الأخرى للمغذيات, التي تتوفر في مكانة بيئية معينة1. ومع ذلك ، إذا كانت البكتيريا غير قادرة على التكيف مع بيئتها آليات أخرى قد تفسر بقاء الأنواع. في الواقع، كما العديد من البكتيريا تتكاثر بسرعة والسكان يمكن أن تصل إلى كثافة الخلايا العالية التجمعات السكانية الفرعية قد تراكمت تلقائيا الطفرات المفيدة التي توفر للخلايا مع ميزة النمو الانتقائي، وبالتالي زيادة لياقتهم البدنية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن النقاط الساخنة الطفرة وطفرات التكيف الناجمة عن الإجهاد تسهيل تطور بكتيريا غير معدلة2،3. وهكذا، فإن تراكم الطفرات والنمو في ظل الاختيار المستمر هو أصل التنوع الميكروبي الهائل، حتى داخل نفس الجنس4،5. كما هو الحال في الطبيعة ، فإن تشكيل الجينوم البكتيري يحدث أيضا في المختبر بسبب الزراعة المستمرة قيد الاختيار. ويتجلى ذلك في تدجين البكتيريا الفرعية B. إيجابية الغرام، والتي تستخدم في جميع أنحاء العالم في البحوث الأساسية وفي الصناعة. في 1940s B. تم التعامل مع subtilis الحمض النووي الضارة الأشعة السينية تليها زراعة تحت شرط نمو محدد6. الطفرات التي تراكمت في البكتيريا خلال تدجينها مسؤولة عن فقدان العديد من خصائص النمو ، أي سلالة مختبر B. subtilis 168 فقدت القدرة على تشكيل مستعمرات معقدة7،8.
في الوقت الحاضر، لأفضل دراسة نموذج البكتيريا Escherichia القولونية وB. subtilis، مجموعة متنوعة من الأدوات القوية المتاحة للتلاعب وراثيا الجينوم من أجل معالجة مسائل علمية محددة. في بعض الأحيان يسبب تعطيل جين الفائدة عيبا حادا في النمو ، والذي يظهر بوضوح على متوسط النمو القياسي9. وعلى النقيض من ذلك، غالبا ما يتم تجاهل الطفرات التي تسبب عيبا ضعيفا في النمو وبالتالي تؤثر بشكل طفيف على لياقة السلالة. ومع ذلك ، في كلتا الحالتين الحضانة المطولة و passaging من سلالات متحولة لعدة أجيال وعادة ما يؤدي إلى تراكم المسوخ القامع التي استعادت النمط الظاهري للسلالة الأم2،9. إن توصيف المسوخ القامعة وتحديد الطفرات التي أعادت عيب نمو السلالة المتحولة الأم هو نهج مفيد للغاية يسمح بجلاء العمليات الخلوية الهامة والجديدة في كثير من الأحيان10،11.
نحن مهتمون في السيطرة على التوازن الغلوتامات في B. subtilis12. على غرار الإشريكية القولونية، يستجيب B. subtilis لاثارة الغلوتامات التوازن(أيكتلة في تدهور الغلوتامات2)من خلال تراكم المسوخ القامعة. وتبين أن التعديلات الجينومية في هذه المسوخ القامعة التي تم الحصول عليها عن طريق طفرة عفوية لاستعادة الغلوتامات التوازنبسرعة 9,13. لذلك ، ليس من المستغرب أن التكيف مع B. subtilis إلى حالة نمو محددة أثناء تدجين البكتيريا ينعكس في تخليق الإنزيم وفي الأنشطة الأنزيمية المتطورة ، والتي تشارك في استقلاب الغلوتامات12. وقد اقترح أن عدم وجود الغلوتامات الخارجية في المتوسط النمو خلال عملية التدجين كان القوة الدافعة لظهور تثبيت خفي الغلوتامات ديهيدروجيناز (GDH) gudBCR الجينات في سلالة المختبر 1682,14. ويدعم هذه الفرضية ملاحظتنا أن انخفاض كمية نشاط GDH في سلالة المختبر يوفر البكتيريا مع ميزة النمو الانتقائي عندما الغلوتامات الخارجية نادرة2. وعلاوة على ذلك، فإن زراعة سلالة B. subtilis، توليف GDH GudB، في غياب الغلوتامات الخارجية يؤدي إلى تراكم المسوخ القامعة التي أدت إلى تعطيل الجين gudB 2. من الواضح أن وجود GDH نشط تقويضيا غير مؤات للخلية لأن الغلوتامات المنتجة داخليا التي يمكن استخدامها لولا ذلك للتأيض تتحلل إلى الأمونيوم و 2-oxoglutarate (الشكل 1). وعلى النقيض من ذلك، عندما يتم توفير الغلوتامات عن طريق الوسط، فإن سلالة B. subtilis المجهزة بنشاط GDH عالي المستوى لها ميزة نمو انتقائية على سلالة تجمع GDH وظيفية واحدة فقط. من المعقول افتراض أن نشاط GDH عالي المستوى يسمح للبكتيريا باستخدام الغلوتامات كمصدر كربون ثان بالإضافة إلى مصادر الكربون الأخرى التي يوفرها الوسيط2 (انظر الشكل 1). وبالتالي، يؤثر نشاط GDH بقوة على لياقة البكتيريا، اعتمادا على توافر الغلوتامات الخارجية.
هنا نقدم طريقة توضيحية جدا لرصد وتصور المنافسة داخل الأنواع بين اثنين من سلالات subtilis B. التي تختلف في مكان واحد على الكروموسوم(الشكل 2). وصفت سلالات اثنين مع الجينات yfp وcfp ترميز YFP الفلوروفوريس وCFP، و cocultivated في ظل ظروف غذائية مختلفة. عن طريق أخذ العينات مع مرور الوقت والطلاء المخففات المناسبة على لوحات أجار يمكن رصد الناجين في كل من الثقافات بسهولة باستخدام المجهر مضان ستيريو المشتركة. الإجراء الموصوف في هذه الورقة سهل الأداء ومناسب لتصور التوسع اللاستنساخي السريع والقضاء على الطفرات المفيدة والضارة ، على التوالي ، في مجموعة خلايا بمرور الوقت.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="814">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">3746</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Agar</td>
			<td style="width:175px;">Difco, USA</td>
			<td style="width:111px;">214010</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="61" rowspan="2" style="height:61px;width:363px;">Ammonium ferric citrate (CAF)</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">9714</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">5239</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Glucose</td>
			<td style="width:175px;">Applichem, Germany</td>
			<td style="width:111px;">A3617</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Glycerol</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">4043</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">K2HPO4 x 3 H2O</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">6878</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">KCl</td>
			<td style="width:175px;">Applichem, Germany</td>
			<td style="width:111px;">A3582</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">3904</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">KOH</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">6751</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">MgSO4 x 7 H2O&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">P027</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">MnCl2&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">T881</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="61" rowspan="2" style="height:61px;width:363px;">MnSO4 x 4 H2O</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Merck Millipore, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">102786</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">NaCl</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">9265</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Nutrient broth</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">X929</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Potassium glutamate</td>
			<td style="width:175px;">Applichem, Germany</td>
			<td style="width:111px;">A3712</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tryptone</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">8952</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:175px;">Applichem, Germany</td>
			<td style="width:111px;">A3445</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:175px;">Roth, Germany</td>
			<td style="width:111px;">2363</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">1.5 ml Reaction tubes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">72,690,001</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">2.0 ml Reaction tubes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">72,691</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">15 ml Plastic tubes with screw cap</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">62,554,001</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">82.1473</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">1.5 ml Polystyrene cuvettes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt, Germany</td>
			<td style="width:111px;">67,742</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">15 ml Glass culture tubes&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Brand, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">7790 22</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">with aluminium caps</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">100 ml Shake flasks with aluminium caps</td>
			<td style="width:175px;">Brand, Germany</td>
			<td style="width:111px;">928 24</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Sterile 10 ml glass pipettes</td>
			<td style="width:175px;">Brand, Germany</td>
			<td style="width:111px;">278 23</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Incubator (28 and 37 &#176;C)</td>
			<td style="width:175px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:111px;">M1282-0012</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="85" rowspan="3" style="height:85px;width:363px;">Standard pipette set (2-20 &#956;l, 10-100 &#956;l, 100-1000 &#956;l)</td>
			<td rowspan="3" style="width:175px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:111px;">4910&#160;000.034, 4910 000.042,&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">4910 000.042,</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:111px;">4910 000.069&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="101" rowspan="2" style="height:101px;width:363px;">Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">75002425</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:363px;">Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Heraeus Biofuge Primo R, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">75005440</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="101" rowspan="2" style="height:101px;width:363px;">Standard spectrophotometer</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">80-2112-21&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">Stereofluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss SteREO Lumar V12, Germany</td>
			<td style="width:111px;">495008-0009-000</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Freezer (-20 and -80 &#176;C)</td>
			<td style="width:175px;">-</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Fridge (4 &#176;C)</td>
			<td style="width:175px;">-</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">Autoclave</td>
			<td style="width:175px;">Zirbus, LTA 2x3x4, Germany</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">pH meter</td>
			<td style="width:175px;">pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany</td>
			<td style="width:111px;">766</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="61" rowspan="2" style="height:61px;width:363px;">Vortex</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">Vortex&#160; 3, IKA, Germany</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">3340000</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:363px;">Balance</td>
			<td rowspan="3" style="width:175px;">CP2202S, Sartorius, Germany</td>
			<td style="width:111px;">replaced by</td>
			<td rowspan="3" style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">CPA2202S</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Black pen (permanent marker)</td>
			<td style="width:175px;">Staedler, Germany</td>
			<td style="width:111px;">317-9</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Powerpoint program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft, USA</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">Office Excel program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft, USA</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Program for data processing</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:363px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:175px;">Adobe, USA</td>
			<td style="width:111px;">replaced by CS6, download</td>
			<td style="width:167px;">Computer program for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Computer</td>
			<td style="width:175px;">PC or Mac</td>
			<td style="width:111px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss, Germany</td>
			<td style="width:111px;">410135 1002 110</td>
			<td style="width:167px;">AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:815px;">Specific solution recipes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">SP medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">8 g Nutrient broth</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">0.25 mg MgSO4 x 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">1 g KCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">if required, add 15 g agar for solid SP medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:815px;">2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">LB medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 g Tryptone</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">5 g Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 g NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">if required, add 15 g agar for solid LB medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">C-Glc minimal medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">200 ml 5 x C salts</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml III&#8217; salts</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">CE-Glc minimal medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">200 ml 5 x C salts</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">10 ml III&#8217; salts</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">20 ml Glutamate (40%)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">5 x C salts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">20 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">80 g K2HPO4 x 3 H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">16.5 g (NH4)2SO4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">III&#8217; salts</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">0.232 g MnSO4 x 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">12.3 g MgSO4 x 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">40% Glutamate solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">200 g L-Glutamic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">0.9% Saline (NaCl) solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">50% Glycerol solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:815px;">295 ml Glycerol (87%)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:23px;width:815px;">ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:815px;">Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:648px;">Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:167px;">Laboratory strain collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:648px;">Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:648px;">Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:648px;">Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains

العديد من الكائنات الحية الدقيقة مثل البكتيريا تتكاثر بسرعة كبيرة والسكان قد تصل إلى كثافات الخلايا العالية. الكسور الصغيرة من الخلايا في السكان لديها دائما الطفرات المتراكمة التي هي إما ضارة أو مفيدة للخلية. إذا كان تأثير اللياقة البدنية للطفرة يوفر للزم السكان الفرعيين ميزة نمو انتقائية قوية ، فقد يتفوق أفراد هذه الاكتظاظ السكاني الفرعي بسرعة وحتى القضاء التام على زملائهم المباشرين. وهكذا، فإن التغيرات الجينية الصغيرة والتراكم القائم على الاختيار للخلايا التي اكتسبت طفرات مفيدة قد يؤدي إلى تحول كامل في النمط الجيني لخلايا المجموعة. هنا نقدم إجراء لرصد التوسع اللاستنساخي السريع والقضاء على الطفرات المفيدة والضارة ، على التوالي ، في مجموعة الخلايا البكتيرية مع مرور الوقت عن طريق cocultivation من الأفراد المسمى فلوريا من البكتيريا نموذج إيجابي غرام عصيات subtilis. طريقة سهلة الأداء وتوضيحية جدا لعرض المنافسة داخل الأنواع بين الأفراد في مجموعة خلايا بكتيرية.

تم تطبيق الطريقة الموصوفة هنا بنجاح لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا تتكون من سلالات B. subtilis التي تم تصنيفها بجينات cfp و yfp لترميز الفلوروفوريس CFP و YFP ، على التوالي. كما هو مبين في الشكل 3، يمكن استخدام هذه الطريقة لتصور المنافسة داخل الأنواع بطريقة توضيحية...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains at JoVE.com

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

البكتيريا قد تتراكم إما الطفرات الضارة أو المفيدة خلال حياتهم. في مجموعة من الخلايا الأفراد التي تراكمت الطفرات المفيدة قد تفوق بسرعة زملائهم. هنا نقدم إجراء بسيط لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا بكتيرية مع مرور الوقت باستخدام الأفراد المسمى fluorescently.

مراقبة المنافسة داخل الأنواع في مجموعة الخلايا البكتيرية عن طريق Cocultivation من السلالات المسمى Fluorescently

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

monitoring-intraspecies-competition-bacterial-cell-population

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Georg-August University. البكتيريا قد تتراكم إما الطفرات الضارة أو المفيدة خلال حياتهم. في مجموعة من الخلايا الأفراد التي تراكمت الطفرات المفيدة قد تفوق بسرعة زملائهم. هنا نقدم إجراء بسيط لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا بكتيرية مع مرور الوقت باستخدام الأفراد المسمى fluorescently...

Video: Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Title Cell Encapsulation by Droplets

عنوان تغليف الخلية عن طريق الرذاذ

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

باستخدام ارتباط صورة رقمية لوصف سلالات المحلية على الأوعية الدموية عينات الأنسجة

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...