המחברים מבקשים להודות לג&#39;ן שין של בית החולים כלליים מסצ&#39;וסטס לתרומה הנדיבה של שתילי Nicotiana benthamiana. ג&#39;ן בוש עזר לנו מאוד בייעוץ בגידול צמחים והקמת אזור חדר צמיחה. טום פראנטה של ​​מכון Wyss הציעה את העזרה מכרעת עם מיקרוסקופיה confocal. המחברים מבקש להודות במיוחד לדון אינגבר של בית החולים לילדים בבוסטון ומכון Wyss לתרומתו הנדיבה של אקדח גן והציוד נלווה. מימון לפרויקט זה סופק באמצעות הסכם שיתוף פעולה עם משרד אנרגיה של סוכנות לפרויקטי מחקר מתקדם (ARPA-E פרס # DE-000,079) לPAS, JCW, וMDM, ובאמצעות Chimerion ביוטכנולוגיה, Inc לMJV.

1. עיצוב של רצפים לחלופין-איחו לאברון מרובה מיקוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את האתרים לביטוי חלבון סופי. לעבודה זו, העניין הוא במיקוד הכלורופלסט, peroxisome, וcytosol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בספרות כדי לזהות רצפי חלבונים ו-DNA הידועים למקד חלבונים לאברונים של עניין. במקרה זה הכלורופלסט מיקוד רצף מmethyltransferase L-isoaspartate thaliana ארבידופסיס 6,15, וperoxisome מיקוד רצף מthaliana ארבידופסיס synthase S-אלנטואין כמו transthyretin-16,17 נקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את משטר שחבור-חלופי שצריך למקד את החלבונים המעניינים את האברונים הנכונים. עבור עבודה זו, אחוי אתרים כפי שנצפה במערכת ארבידופסיס טבעית 6. רצף ה-mRNA מחדש עוזב את אתרי אחוי הטבעיים, אבל רצפים הונחו peroxis הכלורופלסט או קידודשת מיקוד תגים בתוך אינטרונים לחלופין-איחו (איור 1). </li></ol> 2. עצרת גיבסון של חלקי DNA ראה גם איור 2. שיטת ההרכבה גיבסון תלויה בפעולה של אנזימים שונים בתמהיל שהוכן מראש, ל1) בחלקו לעכל את הקצוות של גדילי הדנ&quot;א של פעמיים כדי להפוך את הגדילים יחיד ו2) זוגות בסיסים חינם לחשל שכני חלקי DNA. זה מאפשר לשיבוט של שברי DNA ללא מגבלות של אתרי הגבלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר על מנת שהאלמנטים במבנה פלסמיד דנ&quot;א. כדוגמא יש TriTag-1 אלמנטים של: א) וקטור פלסמיד (נקבובית, המכיל מבנה GFP הידוע לעבודה במפעלים, סמן התנגדות kanamycin, ומקורותיה של שכפול ל, E. coli ו Agrobacterium tumefaciens מארחים) ב) רצף אמרגן, (P ENTCUP2, הוצג להיות מכוננים בצמחים), ג) הכלורופלסט מיקוד רצף (CTS), ג) peroxisome סדרה של אתרי אחוי כפי שתואר לעיל 6 מיקוד רצף (PTS), וד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את הבסיס לבסיס המבנה עם בתוכנות עיצוב סיליקו. הקוף הוא חבילת תוכנה חופשית בקוד פתוח שימושית עבור עבודה זו. הערה: TriTag-1, יש לו את הסדר: וקטור פלסמיד, אמרגן, ATG, אתר אחוי תורם, רצף יעד הכלורופלסט, אתר תורם אחוי, באתר ניטראלי, אתר acceptor אחוי, רצף יעד peroxisome, אתר acceptor אחוי, ה-GFP ככלול בוקטור פלסמיד . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב בסיליקון ומבנה ה-DNA כזה שיש חפיפה 50 BP-בין כל חתיכה בעת הזמנת פריימרים עבור ה-PCR. אפשר להשתמש בחפיפת 50 נ&quot;ב כפריימרים: 25 נקודות בסיס לכל כיוון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לעקוב אחר מקורו של כל אחד מהחלקים ברצף. האם זה כמו: פלסמיד להיות מבוגרים וminiprepped; רצף ליניארי שניתן להשתמש בו כתבנית PCR; או רצף שצריך להיותמסונתז באופן מסחרי? מספר חברות מציעות שירותי סינתזת דנ&quot;א בעלות נמוכה עבור ברים &lt;500 נ&quot;ב. במקרה זה, TriTag עצמו הוא 437 נ&quot;ב אז זה היה יתרון להזמין אותו באופן מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוצאות הטובות ביותר תגיע אם כל המקטעים הנן PCR מוגברים ומטוהרים מתבנית ה-DNA שלהם. סמן ההתנגדות הוא מקום טוב כדי לחלק את ה-DNA הזה הגדול לשתי תבניות קטנות יותר, כי הם יותר בקלות מוגברת-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזים הגבלת הגבלת DpnI חותך DNA מפוגל. אם תבנית PCR הייתה miniprep מE. coli, טיפול DpnI יסיר את תבנית ה-DNA המזהמת. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את כל רצפי DNA בנפרד וelute במים, TE או הצפת EB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק וקטור נקבובית 1, ~ 3,000 BP (חיצים ירוקים). PCR מוגבר וDpnI טופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וקטור נקבובית חלק 2, ~ 3,000 BP (חיצים שחורים). PCR מוגבר וDpnI טופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TriTag להוסיף, 437 נ&quot;ב (חיצים כחולים). הזמין באופן מסחרי. Resuspend בDDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמרגן ENTCUP P, ~ 750 נ&quot;ב (חצים כתומים). PCR מוגבר וDpnI טופל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הריכוזים של כל אחד מחלקי ה-DNA. לשאוף 150 ng / μl של חתיכות הווקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של תמהיל ההרכבה גיבסון מהמקפיא ולהפשיר על קרח. זה זמין מסחרי, אלא גם פשוט לעשות במעבדה של 12-14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישנם שני שלבים למתכון הזה: תערובת צמיגה 5x אב ו15 aliquots 1.33x תגובה בגודל μl. מיקס מאסטר 5x מכיל: 3 מיליליטר 1 M טריס-HCl pH 7.5, 300 μl 1 M MgCl 2, 600 μl 10 מ&quot;מ של כל dNTP, 300 μl 1 M DTT, 1.5 גרם PEG-8000, 20 NAD מ&quot;ג, וDDH 2 O ל 6 מיליליטר. הכן 320 aliquots μl (18) ולהקפיא את כולם מלבד אחד ב -20 ° C. הפתרון יהיה די צמיג. תווית &quot;חיץ איזותרמה 5X&quot; אלה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחד שנותר (320 μl), להוסיף 1.2 μl T5 exonuclease, 20 μl Phusion גבוהה FIDelity DNA פולימראז, 160 תקי DNA אנזים μl וDDH μl 700 2 O. הכן 15 aliquots μl (~ 80) על קרח בצינורות PCR ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כרכים בסכומים equimolar של כל אחד מהקטעים. יש כמה מחשבונים באינטרנט, ובכלל זה Gibthon.org. לא צריך להיות בסך הכל 5 μl של כל חתיכות ה-DNA. הוסף אותם לμl 15 גיבסון לערבב aliquot. אם זה דורש נפחים קטנים מדי לפיפטה, לדלל את שברי DNA ו / או להשתמש aliquot יותר מאחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תשכח להכין את שליטה של ה-DNA הווקטור בלבד (למשל חלק DNA המכיל את סמן עמידות לאנטיביוטיקה) ומרכיב את עוצמת הקול עם מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינורות בCycler תרמית בC ° 50-55 ל30-60 דקות. החלף על קרח ולהפוך לE. coli באמצעות תאים כימיים המוסמכים חום הלם. אין להשתמש בתאי electrocompetent. ריכוז מלח הגבוה וריכוז ה-DNA הנמוך יחסיתעלול לגרום לתאים לקשת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלתי את כל 20 μl להכנה מסחרית של 200 סידן כלוריד μl E. המוסמך coli. לדגור על קרח 30 דקות ושניות 60 הלם חום על 42 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לקרח 2 דקות, להחיל SOC μl 750 או מדיום LB ולשחזר רועדים בדקות 30 צינור microcentrifuge ב 37 ° C. פלייט את התערובת ודילולים מתאימים בLB + קאן (או אנטיביוטיקה מתאימה אחרת). הדבר עלול לגרום ברקע גבוה יותר (ומספר גבוה יותר של אירועי רקומבינציה יעד הלא) מאשר שיבוט מבוסס קשירה מסורתי אבל כדאי להקרין על 10 מושבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר שיבוט באמצעות רצף ולאחסן aliquot ב -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic Transfection של טבק עם אקדח הגן זוהי טכניקה שהיא הוקמה בשנת יופיטר 18,19. שלבים עיקריים והבדלים מתוארים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 50-100 מיליליטר E. שיתוףli או 200 מיליליטר Agrobacterium. תרבות prep-מקסי. ריכוז של כ -1,500 ng / μl נדרש כדי להמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כדורי אקדח גן כפי שתואר לעיל. לטעון אותם לתוך אקדח הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection של רקמת אפידרמיס עלה ניקוטיאנה benthamiana טבק, לבחור עלה גדול קרוב לבסיס של מפעל ישן של 3 חודשים. בזהירות לחתוך אותו ולמקם אותו בצד תחתון על מגבות נייר רטובות בצלחת פטרי 15 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הלחץ הוא לאקדח הגן ל200-250 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכוון אקדח הגן בין צלעות בצד התחתון של עלה, כ 3-5 סנטימטר מעליו. שחרר את הבטיחות ולספק את החלקיקים לעלה. כל כדור ניתן להשתמש פעמיים באותו המקום על העלה. אם מתפוצץ העלה, לבטל ולהתחיל חדש עלים יש קצת שונות בקשיחות עלים בשל תנאי גידול, כגון גיל, לחות, וכו &#39;לקבלת עלה 12-סנטימטר, מצפים שיתאימו לכ 6 יריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את העלה, מכוסה בחלקו העליון שלצלחת פטרי ל2-3 ימים באור נמוך על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את העלה במיקרוסקופ לנתח מצויד בקרינת UV, ולחפש את תאים בודדים להביע GFP. לנתח 5-10 חלקי מ&quot;מ של עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את העלים בשקופית מיקרוסקופ גם עמוק מתחת ~ 200 μl 0.1% טריטון X-100. חומר הניקוי מסייע במניעת בועות אוויר מלהרכיב על פני השטח, ושקופיות מיקרוסקופ גם עמוקות מאפשרת לאזור הדמיה רקמות גדול יותר. </li></ol> 4. מיקרוסקופיה confocal של רקמות transfected הנחיות אלו משתנות בהתאם לכל מכשיר, ולכן זה חיוני כדי לקבל הכשרה כמו שצריך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויי גילוי הקרינה, הגדר את עירור הלייזר ל489 ננומטר, ולהגדיר את הגלאים מכפיל ל500-569 ננומטר לקרינת ה-GFP ו630-700 ננומטר auto-הקרינה כלורופיל. תאי תמונה באמצעות מטרת מים טבילת 40X. </li></ol>

<ol>
	<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait+stacking+in+transgenic+crops:+challenges+and+opportunities.">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li><li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+plant+splicing+code:+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements.">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li><li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon.">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li><li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age.">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li><li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5'-+and+3'-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments.">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li><li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana.">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li><li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement.">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts.">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li><li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes.">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li><li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5'+mRNA+tags.">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle:+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes.">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li><li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides,+metabolic+pathways,+and+defense+mechanisms.">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

במחקר זה, אסטרטגיות פשוטות מתוארות לאיתור חלבון מהונדס בודד לתאים סלולריים מרובים בצמחים. המטרה הייתה לתכנן מבנה שיבטא את הגן יחיד באברון יותר מפעם אחת בbenthamiana Nicotiana. אסטרטגיות כוללות תכנון רציונלים של בונה DNA מבוסס ה-GFP, הרכבה גיבסון, משלוח של פלסמידים לתאים עלה ?...

עבודה זו היא פרויקט הנדסי / ביולוגיה סינתטית מטבולים שבי תאי צמח שהונדסו חלבון כתב באברונים מרובים אבל עם רק לבנות DNA בודד. גישה אחת כדי למקד את החלבונים למיקום אחד או יותר כרוכה בעותקים מרובים שיבוט גנטיים, המכיל פפטיד לוקליזציה שונה. כל עותק חייב להיות מוצג על ידי retransformation רצוף, או לחלופין, על ידי backcrossing התמרות אחת 1. זה כרוך בשיבוט נוסף, והוא מוגבל על ידי תג לוקליזציה אחד לתחנה סופית. דרך נוספת בתרגום חלבון למקומות רבים היא באמצעות שחבור חלופי 2-5. RNA הוא עיבד מגן יחיד, אך עותקים שונים של התמליל מעובדים בצורה שונה, לעתים קרובות בצורה יותר מפעם אחת לכל תא. זה יכול לגרום לRNA שליח יותר מפעם אחת בתא עיבד מגן יחיד. Messenge שונה אלהRNAs r יכול לקודד לisoforms שונה של אותו החלבון, או במקרה של frameshift, חלבון אחר לגמרי. למרות ששחבור חלופי כבר תואר בספרות במשך שנים רבות, את מנגנוני פעולה ותורמים שימור אתרים ואחוי קולט הם רק שהובהרו לאחרונה 6. האתרים אלה נמצאים בתארו טובים יותר, הם נפתחים הזדמנויות להנדסה. מהנדסים מטבולי צמח מתמודדים עם אתגר כשלבטא חלבון באברונים מרובים. לחלבון שהוא להיות מקומי כדי אברון יותר מפעם אחת, המהנדס חייב לשכפל אותו הגן מספר רב של פעמים, כל אחד עם רצף אות נפרד לכוון אותו לאברון של עניין. לגן יחיד בשלושה אברונים, זה פשוט שלושה גנים. אבל למסלול מטבולים של שישה גנים, זה מתרחב ל18 גנים, מאמץ שיבוט משמעותי. שילוב של רצפי לוקליזציה מרובים לתוך סימן יחיד, לחלופין-איחה גןificantly מפחית את המאמץ הזה. לדוגמא, photorespiration הנדסה מחדש 7,8 וסינתזת isoprenoid 9,10 כרוך הן כלורופלסטים וperoxisomes. במקרה שלנו לקחנו את היתרון של אתרי אחוי כפי שנצפה במערכת thaliana ארבידופסיס טבעית שתואר לעיל 6. אנחנו באופן רציונלי מחדש את רצף ה-mRNA עוזב את אתרי אחו הטבעיים בלבד, אלא להציב רצפים שמקודדים הכלורופלסט או תגי מיקוד peroxisome בתוך אינטרונים לחלופין-איחו (איור 1). החלבון לידי ביטוי עשוי או לא עשוי להיות תג, תלוי אם מראש mRNA שמקודד אותו היה נכרת כאינטרון (1G דמויות ו1H). לקבלת מידע נוסף על העיצוב של המבנים שהוצגו בעבודה זו, עיין במאמר הנלווה 11. בגלל זה הוא עדיין מאמץ משמעותי שיבוט, הרכבה גיבסון, שיטה חדשה לשיבוט בונה DNA, הוא used בבנייה. שיטת גיבסון יכולה לשמש לכל רצף, ללא קשר לאתרי הגבלה (איור 2) 12-14. התערובת הספציפית של אנזימים מאפשרת לצעד אחד, הרכבה בידוד תרמית. בשיטה זו, מספר חלקי DNA ליניארי פעמיים תקועים הם תוכננו כך שיש להם רצפים חופפים של ~ 50 נ&quot;ב. תערובת אנזים ההרכבה גיבסון באופן חלקי מעכלת את חלקי DNA ליניארי, חושף גדילים בודדים של רצפים הומולוגיים. רצפים חד גדילים החלקיים אלה מחדש annealed בתערובת התגובה, וכתוצאה מצעד אחד,, תגובה מהירה, רצף עצמאי ללא קשירה subcloning. עבודה זו מתארת ​​1) מבני שחבור לחלופין תכנון רציונלים לביטוי בכלורופלסטים צמח, peroxisomes, וcytosols, 2) השיבוט שלהם תוך שימוש בשיטה ללא קשירה החדשה של ההרכבה גיבסון, 3) המשלוח שלהם לתאים עלה טבק עם אקדח הגן, ו 4) תוצאות מראים מיקוד אברון, כפי שנצפה עם ה-GFPומיקרוסקופיה confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

על מנת למקד את החלבון יחיד לאברונים subcellular מרובים, צמחים בדרך כלל לשכפל את הגנים הרלוונטיים, ולהביע את כל גן בנפרד באמצעות אסטרטגיות רגולציה מורכבות כולל יזמים ההפרש ו / או רצפי אות. מהנדסי חילוף חומרים וביולוגים סינטטיים מעוניינים במיקוד אנזימים לאברון בפרט מתמודדים עם אתגר: לחלבון שהוא להיות מקומי כדי אברון יותר מפעם אחת, המהנדס חייב לשכפל אותו הגן מספר פעמים. עבודה זו מציגה פתרון לאסטרטגיה זו: רתימת שחבור חלופי של mRNA. טכנולוגיה זו מנצלת הכלורופלסט הוקם ורצפי peroxisome מיקוד ומשלבת אותם לתוך mRNA יחיד שאיחה לחלופין. גרסאות אחוי חלקם נשלחו להכלורופלסט, כמה לperoxisome, וחלק לcytosol. הנה המערכת מיועדת למרובה אברון מיקוד עם שחבור חלופי. בעבודה זו, היה צפוי GFP להיות expressed בהכלורופלסט, cytosol, וperoxisome על ידי סדרה של 5 תגי mRNA &#39;נועדו באופן רציונלי. יש תגים אלה את הפוטנציאל להפחית את כמות הדרושה בעת שיבוט גנים Heterologous צריכים לבוא לידי ביטוי באברונים subcellular מרובים. המבנים עוצבו בעבודה קודמת 11, והיו משובטים באמצעות ההרכבה גיבסון, שיטת שיבוט עצמאית קשירה שאינו דורשת אנזימי הגבלה. פלסמידים התוצאה הוכנסו לתוך תאי עלה אפידרמיס ניקוטיאנה benthamiana עם פרוטוקול ג&#39;ין אקדח שונה. לבסוף, עלים הפכו נצפו עם מיקרוסקופיה confocal.

מאמץ העיצוב היה תוצאה של תכנון משמעותי. רומן לפרויקט זה הוא השימוש בשחבור חלופי כדי ליצור מראש mRNA שמתורגם לחלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. חלבונים אלה באים לידי ביטוי באברונים שונים, במקרה זה הכלורופלסט, peroxisome ו / או cytosol. מתאמנים גן ארבידופסיס טבעי שאיחה 6</...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun at JoVE.com

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג&#39;ין האקדח.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

20.5K Views.  Harvard University.  עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח. 

Video: Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

תמליל והמטבוליט Profiling להערכת של טבק ועץ צפצפה כחומר גלם לתעשייה המבוססת על ביו

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne illness. Ready-to-eat (RTE) processed foods such as deli meats, cheese, and in some cases fresh produce, have been involved in foodborne disease outbreaks due to contamination with pathogens such as Listeria monocytogenes. With respect to L. monocytogenes, deli slicers are often the main source of cross contamination. The goal of this study was to use a fluorescent compound to simulate bacterial contamination and track this contamination in a retail setting. A mock deli kitchen was designed to simulate the retail environment. Deli meat was inoculated with the fluorescent compound and volunteers were recruited to complete a set of tasks similar to those expected of a food retail employee. The volunteers were instructed to slice, package, and store the meat in a deli refrigerator. The potential cross contamination was tracked in the mock retail environment by swabbing specific areas and measuring the optical density of the swabbed area with a spectrophotometer. The results indicated that the refrigerator (i.e. deli case) grip and various areas on the slicer had the highest risk for cross contamination. The results of this study may be used to develop more focused training material for retail employees. In addition, similar methodologies could also be used to track microbial contamination in food production environments (e.g.&#160;small farms), hospitals, nursing homes, cruise ships, and hotels.

The overall goal of this study was to demonstrate the potential cross contamination mechanism of foodborne pathogen Listeria monocytogenes in a retail deli setting. This methodology may be applied to a variety of different environments to track pathogen contamination. &#160;

מעקב מיקרוביאלית זיהום בסביבות קמעונאיות באמצעות פלורסנט אבקה - קמעונאות מעדני סביבת דוגמא

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג&#39;ין קלטות

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים /<em&gt; אספרגילוס</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

זיפרגליים Balanus improvisus כמודל ימית - Culturing, ביטוי גנים

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

שערוך אינדקס אזור העלה באמצעות שלוש שיטות נפרדות בדוכנים נשירים טהור

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...