Yazarlar Nicotiana benthamiana fidan cömert bağış için Massachusetts Genel Hastanesi Jen Sheen teşekkür etmek istiyorum. Jen Bush bitkilerin büyüyen ve büyüme odası alanı kurma tavsiyesi bize büyük ölçüde yardımcı oldu. Wyss Enstitüsü&#39;nden Tom Ferrante konfokal mikroskobu ile çok önemli yardım teklif etti. Yazarlar, özellikle Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Don Ingber ve Gen Tabancası ve ilgili malzemeleri cömert bağış için Wyss Enstitüsü&#39;ne teşekkür etmek istiyorum. Bu proje için finansman PAS, JCW, ve MDM Enerji İleri Araştırma Projeleri Ajansı Başkanlığı (ARPA-E Ödül # DE-000079) ile bir işbirliği anlaşması ile sağlanan ve Chimerion Biyoteknoloji, Inc aracılığıyla MJV için yapıldı.

Hedefleme Çoklu organel için alternatif olarak eklenmiş diziler-1. Design <ol><li> Nihai protein ifadesi için siteler belirler. Bu iş için, faiz kloroplast, peroksisom ve sitosola hedefleme olduğunu. </li><li> Ilgi organellere proteinleri hedef bilinen protein ve DNA dizilerini tanımlamak için literatür kullanın. Bu durumda, bir kloroplast Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferaz 6,15 ikinci hedef sekansı ve Arabidopsis thaliana transtiretin gibi S-allantoin sentez 16,17 ikinci hedef sekansı, bir peroksizom belirlenmiştir. </li><li> Doğru organellere ilgi proteinleri hedef gereken bir alternatiftir-dilindiğinde rejimini belirlemek. Doğal Arabidopsis sistemde 6 gözlendiği gibi, bu iş için, siteleri splice. MRNA sekansı, doğal bırakarak yeniden birleştirme bölgelerini, ama diziler kodlayan bir kloroplast ya da peroksizomlarda yerleştirildialternatif dilinmemiş intronlarda içinde etiketler (Şekil 1) ome-hedefleme. </li></ol> DNA Parçaların 2.. Gibson Meclisi Şekil 2 &#39;de bakınız. Gibson montaj yöntemi: 1) için bir ön-karışım yapılmıştır çeşitli enzimlerin harekete bağlıdır, kısmen tek kollu DNA parçaları ve komşu 2) tavlama ücretsiz baz çifti olmak üzere iki iplikçikli DNA&#39;nın uçlarını sindirimi. Bu kısıtlama sitelerinin sınırlamalar olmadan DNA fragmanlarının klonlanması için izin verir. <ol><li> DNA plazmid yapısı içinde elemanları için bir düzeni seçin. A) bir plasmid bitkiler, bir kanamisin direnç işaretleyici çalışmak için bilinen bir GFP yapısını içeren bir vektör (gözenek, ve E. coli ve Agrobacterium tumefaciens ana), b) a için bir replikasyon kökeni: Bir örnek olarak TriTag-1 elemanları vardır promoter dizisi, (P ENTCUP2, bitkilerde yapıcı olduğu gösterilmiştir), C) sekansı (CTS) ve bir kloroplast hedefleyen, c) a peroxisome), daha önce tarif edildiği gibi, 6, ek yeri siteleri, bir dizi dizisi (PTS) ve d hedefleme. </li><li> Yapı tabanı-için-baz ile siliko tasarım yazılımı tasarlayın. APE, bu iş için kullanışlı bir açık kaynak kodlu ücretsiz paketidir. Not: TriTag-1, sırası var plazmid vektörü, promoter, ATG, bağlayıcı verici alan, kloroplast hedef sekans, bağlayıcı verici alan, nötr yer, bağlayıcı alıcı alan, peroksizom hedef sekans, bağlayıcı alıcı alan, GFP plazmid vektörü içinde ihtiva gibi . <ol><li> PCR için primerler sipariş ederken her bir birim arasında bir 50 bp üst üste binme olduğu şekilde, in silico DNA yapısı tasarımı. 25 bp her bir yönü: Bu primerler olarak 50 bp üst üste kullanmak mümkündür. <ol><li> Dizisi parçaların her birinin kökeni takip emin olun. Bu gibidir: yetiştirilen ve miniprep için bir plazmid; , bir PCR şablonu olarak kullanılabilen bir doğrusal dizi; ya da olması gereken bir diziTicari olarak sentezlenmiş? Bazı şirketler fragmanları &lt;500 bp için düşük maliyetli DNA sentezi hizmetleri sunuyoruz. Ticari olarak sipariş için avantajlı oldu bu nedenle bu durumda, TriTag kendisi 437 bp. </li><li> Tüm PCR büyütülmüş parçalar ve model DNA saflaştırılan ise en iyi sonuçlar gelecektir. Direnç marker daha kolay PCR büyütülmüş iki küçük şablonlar içine bu büyük DNA bölmek için iyi bir noktadır. </li><li> Kısıtlama Kısıtlama enzim DPNI metilatlı DNA&#39;yı keser. PCR şablonu E bir miniprep olsaydı coli, DPNI tedavi kirlenmesine şablon DNA kaldıracaktır. </li></ol></li></ol></li><li> Ayrı ayrı tüm DNA dizileri arındırın ve su ya da TE Tamponu EB elute. <ol><li> Gözenek vektör part 1, ~ 3.000 bp (yeşil oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi. </li><li> Gözenek vektör part 2, ~ 3,000 bp (siyah oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi. </li><li> TriTag insert, 437 bp (mavi oklar). Ticari emretti. Resuspend GKD 2 O. içinde </li><li> P ENTCUP organizatörü ~ 750 bp (turuncu oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi. </li></ol></li><li> DNA parçalarının her biri konsantrasyonlarını ölçün. Vektör adet 150 ng / ul hedefliyoruz. </li><li> Dondurucu üzerinden Gibson montaj karışımı bir kısım alın ve buz üzerinde eritin. Bu laboratuarda 12-14 yapmak için ticari olarak mevcut, ama aynı zamanda basit. <ol><li> Viskoz 5x master miks ve 15 ul reaksiyon boyutu 1.33x tümbölenleri: Bu tarifi için iki adım vardır. 5x ana karışım içerir: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5, 300 ul 1 M MgCI2, her dNTP, 600 ul 10 mM, 300 ul 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD ve GKD 2 6 ml O. 320 ul hacimde (18) hazırlayın ve -20 ° C&#39;de biri ancak tüm dondurmak Çözelti, oldukça viskoz olacaktır. Bu &quot;5X izoterm tampon&quot; Label </li><li> (320 ul) kalan bir için, 1.2 ul T5 ekzonükleaz, 20 ul Phusion High-FID eklemekelity DNA Polimeraz, 160 ul Taq DNA Ligaz ve 700 ul GKD 2 O. 15 ul hacimde (~ 80) -20 ° C&#39;de PCR tüpleri ve mağaza buz üzerinde ° hazırlayın C. </li></ol></li><li> Parçalarının her biri için eşit molar miktarlarda hacimleri belirler. Gibthon.org dahil olmak üzere birkaç online hesap makineleri vardır. Bütün DNA parçalarının 5 ul toplam olmalıdır. Gibson alikonun mix 15 ul ekleyebilirsiniz. Bu pipet için çok küçük hacimli gerektiriyorsa, DNA fragmanları seyreltmek ve / veya birden fazla kısım kullanın. <ol><li> Yalnız vektör DNA&#39;nın bir denetim hazırlamak (antibiyotik direnç işaretleyici içeren, örneğin DNA parçası) ve su ile hacmini telafi etmek için unutmayın. </li></ol></li><li> 30-60 dakika, 50-55 ° C&#39;de bir termal döngüleyici içinde inkübe. Buz üzerinde değiştirin ve E. dönüşümü ısı-şok kimyasal yetkin hücreler yoluyla coli. Elektrokompenant hücreleri kullanmayın. Yüksek tuz konsantrasyonu, ve nispeten düşük DNA konsantrasyonuhücreler ark neden olabilir. <ol><li> 200 ul kalsiyum-klorür, ticari hazırlanması, yeterli E. için her 20 ul uygulayın coli. 42 ° C&#39;de 30 dakika buz ve ısı şok 60 saniye inkübe </li><li> , Buz 2 dakika geri dön 750 ul SOC veya LB ortamı uygulanır ve 37 ° C sıcaklıkta bir mikro santrifüj tüpü içinde 30 dakika geri çalkalama LB + Kan (veya uygun başka bir antibiyotik) ile ilgili en karışımı ve uygun dilüsyonları Plate. Bu geleneksel ligasyon esaslı klonlama daha yüksek bir arka plan (ve hedef olmayan rekombinasyon olayları daha yüksek bir sayı) neden olabilir ama yaklaşık 10 koloniler taranması için faydalıdır. </li></ol></li><li> Sırası ile klon olduktan sonra, -80 ° C&#39;de bir kısım depolamak </li></ol> Gen tabancası ile Tütün 3. Biolistik Transfeksiyonu Bu vallahi 18,19 kurulmuş olan bir tekniktir. Anahtar adımlar ve farklar aşağıda tarif edilmiştir. <ol><li> 50-100 ml E. büyütün coli ya da 200 ml Agrobacterium. Maxi-hazırlık kültürü. Yaklaşık 1500 ng / ul &#39;lik bir konsantrasyon devam etmek için gereklidir. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi, gen tabancası mermi hazırlayın. Gen Tabancası içine yükleyin. </li><li> Nicotiana benthamiana tütün yaprak epidermal doku transfeksiyonu için, 3 aylık bir bitkinin tabanına yakın büyük bir yaprak seçin. Özenle kesilmiş ve 15 cm Petri kabındaki ıslak kağıt havlu üzerine alt tarafı yukarıya yerleştirin. </li><li> 200-250 psi Gene Gun O basıncını ayarlar. </li><li> Dikkatle yaklaşık 3-5 cm yukarıda, bir yaprağın alt tarafındaki kaburgaların arasındaki Gen Tabancası hedefliyoruz. Güvenlik bırakın ve yaprak parçacıkları sağlar. Her mermi, yaprak üzerinde aynı yerde iki kez kullanılabilir. Yaprak patlar, atmak ve başlangıç, yeni bir yaprak-orada yaprak tokluk bazı farklılıklar nedeniyle böyle bir 12-cm yaprak için, yaklaşık 6 çekim sığdırmak için beklemek vs yaş, nem gibi büyüme koşullarına etmektir. </li><li> Bir üst kaplı yaprak, saklayınBankta düşük ışıkta 2-3 gün boyunca petri. </li><li> UV floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskop yaprak inceleyin ve GFP&#39;yi tek tek hücreler için arayın. Yaprağın 5-10 mm bölümleri ayır. </li><li> ~ 200 ul% 0.1 Triton X-100 altında bir derin kuyu mikroskop slayt yaprak daldırın. Deterjan yüzeyinde oluşan hava kabarcıklarını önlemeye yardımcı olur ve derin kuyu mikroskop slayt daha büyük bir doku görüntüleme alanı sağlar. </li></ol> Geçiştirilmiş Doku 4. Konfokal Mikroskopi Bu talimatlar her enstrüman için değişir, bu yüzden düzgün eğitim almak esastır. <ol><li> Floresans saptama deneyleri için, 489 nm uyarım lazer ayarlamak ve GFP floresans ve klorofil oto-floresan için 630-700 nm için 500-569 nm photomultiplier dedektörleri ayarlayın. 40x su daldırma objektif kullanarak Görüntü hücreler. </li></ol>

<ol>
	<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait+stacking+in+transgenic+crops:+challenges+and+opportunities.">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li><li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+plant+splicing+code:+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements.">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li><li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon.">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li><li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age.">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li><li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5'-+and+3'-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments.">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li><li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana.">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li><li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement.">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts.">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li><li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes.">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li><li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5'+mRNA+tags.">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle:+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes.">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li><li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides,+metabolic+pathways,+and+defense+mechanisms.">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışmada, basit yöntemler bitkilerde çok sayıda hücresel bölümlerin, tek bir transgenik proteini lokalize için tarif edilmiştir. Amaç, Nicotiana benthamiana birden fazla organelde tek bir gen ifade edecek bir yapı tasarlamaktı. Rasyonel stratejiler GFP bazlı DNA konstruktlarının tasarımı, Gibson montaj, Gene Gun yaprak hücrelere plasmidlerin teslimat ve konfokal mikroskobu ile sonuçların gözlenmesi bulunur. Üç farklı kısa, N-terminal etiketler 11<...

Bu çalışma, bitki hücrelerinin çok organellerde bir raportör proteini ifade etmek için, ancak yalnızca tek bir DNA yapısı ile, burada bir metabolik mühendislik / sentetik biyoloji projedir. Birden fazla konuma proteinleri hedef için bir yaklaşım, çok sayıda klonlama genetik kopya, farklı bir lokalizasyon peptit içeren her içerir. Her kopya tek dönüşümleri 1 çaprazlanması ile, alternatif olarak ardışık yeniden dönüştürülmesinin tarafından tanıtılan, ya da olmalıdır. Bu ek klonlama içerir ve terminaline başına bir lokalizasyon etiketi ile sınırlıdır. Birden fazla yere lokalize protein için başka bir alternatif birleştirme 2-5 geçer. RNA, tek bir genden transkribe edilen, ancak transkriptinin farklı numaralar hücre başına birden fazla şekilde genellikle, farklı işlenir. Bu, tek bir genden transkribe hücreye birden fazla haberci RNA neden olabilir. Bu farklı Messenger RNA, aynı proteinin farklı izoformları için kodlayan, ya da bir çerçeve kayması, tamamen farklı bir protein halinde olabilir. Alternatif yapıştırma yıllardır literatürde tarif edilmiş olmasına rağmen, etki ve korunmuş verici ve alıcı ekleme sitelerinin mekanizmaları sadece daha yakın 6 açıklanacaktır edilmektedir. Bu siteleri daha iyi tarif ediliyor, onlar mühendislik için fırsatlar açmak. Birden organellerde bir proteini ifade ederken bitki metabolik mühendisleri bir meydan okuma ile karşı karşıyayız. Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis ilgi organele yönlendirerek, ayrı bir sinyal sekansı ile aynı gen, her birden çok kez klonlanması gerekir. Üç organellerde tek bir gen için, bu sadece üç genlerdir. Ancak altı gen metabolik yolu için, bu 18 gen, önemli bir çaba klonlama için genişler. Tek alternatif dilinmemiş gen işareti içine birden yerelleştirme dizileri birleştirerekificantly bu çaba azaltır. Örneğin, yeniden mühendislik fotorespirasyon 7,8 ve izoprenoid sentez 9,10 kloroplast ve peroksizomları hem de içerir. Doğal Arabidopsis thaliana sisteminde görüldüğü gibi bizim durumumuzda biz daha önce 6 tarif ekleme sitelerin yararlandı. Bu rasyonel tek başına doğal ek yeri siteleri ayrılan mRNA sekansı yeniden, ancak alternatif olarak eklenmiş-intron (Şekil 1) içinde ya da kloroplast-hedefleme peroksizom etiketler kodlayan dizileri yerleştirilmiş olur. Ifade edilen protein ya da kodlanan pre-mRNA, bir intron (Şekil 1G ve 1 H) olarak eksize edildi bağlı olarak, bir etiket olabilir veya olmayabilir. Bu çalışmada sunulan yapıların tasarımı hakkında daha fazla bilgi için, arkadaşı makale 11 bakın lütfen. Bu hala önemli bir klonlama çaba, Gibson montaj, DNA yapıları klonlama için yeni bir yöntem olduğundan, uinşaat sed. Gibson yöntem ne olursa olsun, kısıtlama siteleri (Şekil 2), 12-14 arasında, herhangi bir sıra için kullanılabilmektedir. Enzimlerin spesifik karışımı, tek aşamalı, izotermal montaj sağlar. Bu yöntemde, çok sayıda çift kollu lineer DNA parçaları, 50 bp ~ örtüşen dizilerine sahip olacak şekilde tasarlanmıştır. Gibson düzeneği enzim karışımı kısmen homolog dizilerin tek kollu maruz bırakılması, lineer DNA parçaları sindirir. Bu kısmi tek sarmallı diziler, hızlı, tek aşamalı, dizi-bağımsız, ligasyon içermeyen alt klonlama reaksiyonu ile sonuçlanan reaksiyon karışımı içinde yeniden tavlanır. Bu çalışma bitki kloroplast, peroksisomlara ve sitosollerde ifade için 1) rasyonel tasarım, alternatif olarak eklenmiş yapıları açıklar, 2) kendi klonlama Gibson meclisin yeni ligasyonu-free yöntemi kullanılarak, 3) Gen Tabancası ile tütün yaprak hücrelerinin içine teslimat ve GFP ile gözlemlendiği üzere, organel hedefleme arası 4) Sonuçve konfokal mikroskopi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

Birden fazla alt-hücresel organellere tek bir hedef protein için, bitkiler tipik olarak, ilgili genleri çoğaltmak ve diferansiyel promoterler ve / veya sinyal sekansları da dahil olmak üzere karmaşık bir düzenleyici stratejiler kullanılarak ayrı ayrı her bir geni ifade eder. Metabolik mühendisleri ve belirli bir organele hedef enzimlerin ilgilenen sentetik biyologlar bir meydan okuma ile karşı karşıyayız: Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis aynı gen birden çok kez klonlamak gerekir. Bu çalışma bu strateji için bir çözüm sunar: mRNA alternatif kırpılmayı sokmak. Bu teknoloji kurulmuş ve peroksizom kloroplast hedefleme dizilerinin yararlanır ve alternatif olarak eklenmiş bir tek mRNA halinde birleştirir. Bazı ek yeri varyantları sitoplazmada peroksisom bazı ve bazı, kloroplast gönderilir. Burada sistem çoklu-organel alternatif eklenmeye hedefleme için tasarlanmıştır. Bu çalışmada, GFP ifade olması bekleniyordurasyonel şekilde tasarlanan 5 &#39;mRNA etiketleri bir dizi kloroplast, sitosol ve peroksisom olarak işlenene. Bu etiketler, heterolog genler, birden çok alt-hücresel organellerde ifade edilmesi gerektiğinde gerekli klonlama miktarını azaltma potansiyeline sahiptir. Bu yapılar önceki çalışmada 11 olarak tasarlanmıştır ve Gibson montaj, kısıtlama enzimleri gerektirmeyen bir ligasyon bağımsız klonlama yöntemiyle klonlanmıştır. Elde edilen plazmidler, bir modifiye protokol ile Gen Tabancası Nicotiana benthamiana yaprak epidermal hücrelere dahil edilmiştir. Son olarak, transforme edilmiş yapraklar konfokal mikroskopi ile gözlemlenmiştir.

Tasarım çaba önemli bir planlama sonucudur. Bu proje için yeni diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin çevrilmiş bir ön-mRNA&#39;nın alternatif uç uca eklenmesi oluşturmak için kullanılmasıdır. Bu proteinler, bu durumda, farklı organeller olarak ifade edilmiştir kloroplast, peroksizom ve / veya Sitosol. Bu alternatif olarak 6 eklenmiş doğal Arabidopsis geni uyarlanmış ve (TriTag-1 ve TriTag-2) alternatif olarak ekson dizileri hedef kloroplast 6 ve peroksizom ...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun at JoVE.com

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

20.4K Görüntüleme.  Harvard University.  Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder. 