עבודה זו נתמכה על ידי מענק לאומי למדען לפיתוח מאיגוד הלב האמריקאי: 10SDG3500034 וUTMB-NCB להתחיל את הכספים לSSM. המחברים מודים מתקני Cryo-EM ומדעי מחשוב במרכז Sealy לביולוגיה מבנית בUTMB <a href="http://www.scsb.utmb.edu">(www.scsb.utmb.edu),</a> כמו גם בני הזוג. סטיב Ludtke ואד Egelman לעזרה עם אלגוריתמי שיקום סליל 2D and 3D.

<ol>
	<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy.">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).</li><li>Fujiyoshi, Y., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+proteins+in+membranes.">Electron crystallography of proteins in membranes.</a> Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).</li><li>Toole, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+cDNA+encoding+human+antihaemophilic+factor.">Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor.</a> Nature. 312, 342-347 (1984).</li><li>Fay, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+structure+and+function.">Factor VIII structure and function.</a> International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).</li><li>Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+membrane-bound+factor+VIII.">Domain organization of membrane-bound factor VIII.</a> Biopolymers. , (2013).</li><li>Pipe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophilia:+new+protein+therapeutics.">Hemophilia: new protein therapeutics.</a> Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).</li><li>Gatti, L., Mannucci, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+porcine+factor+VIII+in+the+management+of+seventeen+patients+with+factor+VIII+antibodies.">Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies.</a> Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).</li><li>Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+coagulation+Factor+VIII+bound+to+lipid+nanotubes.">Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes.</a> Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).</li><li>Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+recombinant+human+coagulation+factor+VIII+to+lipid+nanotubes.">Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes.</a> FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).</li><li>Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+urease+activates+blood+platelets+through+a+lipoxygenase-mediated+pathway.">Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).</li><li>Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+crystallization+of+soluble+and+membrane+binding+proteins.">Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins.</a> Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+helical+filaments+and+tubes.">Reconstruction of helical filaments and tubes.</a> Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).</li><li>Lusher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+introduction+of+recombinant+factor+VIII--a+clinician's+experience.">Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience.</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).</li><li>Thim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+new+recombinant+factor+VIII+(N8).">Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8).</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).</li><li>Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+recombinant+porcine+coagulation+factor+VIII.">High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods.">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+structure+of+membrane-bound+coagulation+factor+VIII:+modeling+of+the+factor+VIII+heterodimer+within+a+3-dimensional+density+map+derived+by+electron+crystallography.">3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography.</a> Blood. 99, 1215-1223 (2002).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה, והם יכולים להיות קשר ישיר לגבי כל הנהלים שפורסמו בכתב היד הזה.

בעבודה זו המתודולוגיה מוצגת להבחין בין שני ארגוני קרום הנכנס של חלבונים הומולוגיים מאוד: FVIII האנושי והחזירי בצינורות שומנים בדם בתנאים נתקלו בגוף האדם התאספו עצמי. בהליך המתואר, אנושי וחזירי FVIII מאורגן בהצלחה helically על צינורות שומנים בדם, המהווים את השלב הקריטי ביותר. השלב הקריטי הבא הוא לשמר את הדגימה בקרח אמורפי דק על ידי הבזק הקפאה בנוזל N ליד 2 טמפרטורה. שימור הדגימה בטמפרטורת קרח וLN2 אמורפי שומר על צינורות סליל התייבשות ומכלולי macromolecular חלבון שומנים פעילים מבחינה פיזיולוגית. השלב הקריטי הסופי רכישת נתונים Cryo-EM בכמות ובאיכות מספיקות למבנה 3D ברזולוציה גבוהה בטמפרטורת LN2 קרובה. איסוף נתונים בטמפרטורת LN2 קרוב עוד יותר מונע התייבשות של המדגם בגבוה vacuum נזק מיקרוסקופ וקרינה מקרן האלקטרונים. כדי לחשב את מבנה הקרום הנכנס של FVIII הצעד הקריטי הראשון הוא להשיג חלקיקים הומוגני (מגזרי סליל) סטים ידי החלת סיווג בחינם התייחסות 2D ולשלב חלקיקים מכיתות עם אותו הקוטר ומידה של סדר. השלב הקריטי השני הוא להטיל את אמצעי האחסון ראשוני ופרמטרי סליל (עלייה וזווית azimuthal) לשיקום הסליל. השלב הקריטי השלישי והאחרון הוא לאמת את מבנה הסליל על ידי השוואת מפות 3D מתקבלות על ידי טומוגרפיה הסליל ואלקטרונים (ללא סימטריה שהוטלה) שחזורים של אותה הדגימה. המתודולוגיה שהוצגה היא ייחודית ביכולתה לפתור את המבנה התפקודי של חלבוני קרום הקשורים בתנאים פיסיולוגיים קרובים. LNT שפותחה במעבדה שלנו יכולה להיותשימש בהצלחה כפלטפורמה לארגון סליל של גורמי קרישת דם קרום הנכנס פונקציונליים ולהשיג רזולוציה טובה יותר מאשר לFVIII המאורגן בגבישים 2D קרום הנכנס וכמו חלקיקים בודדים. המטרה שלנו היא להגדיל עוד יותר את הרזולוציה של שחזורי הסליל שלנו על ידי שיפור האחידות והאיכות של קבוצות החלקיקים הסופיות. איסוף יותר micrographs Cryo-EM בתנאים טובים יותר Cryo-EM (אקדח פליטת שדה, מסנן אנרגיה, גלאי מצלמה DE) של חוטי סליל FVIII-LNT ולכן כוללים ערכות חלקיקים ראשוניות גדולות יותר לשיקום 2D יהיה להשיג זאת. שיפור ההרכבה סליל FVIII-LNT ואלגוריתמי שחזור 3D יאפשר לנו להשיג תת ננומטר וליד רזולוציה אטומית, אשר באופן חד משמעי להגדיר את ארגון הקרום הנכנס של זה קריטי לחלבון קרישת דם. גם ארגון צורות FVIII helically הומולוגיות נותן לנו את opportunity לאפיין איך הבדל ברצף יכול לתאם להבדלים במבנה ותפקוד. פתרון מבני קרום הנכנס האנושיים וחזיריים FVIII ידי השיטות מתוארות במאמר זה יכול לעזור לזהות את הרצפים, שכאשר הותאמו ישפר את תפקוד FVIII רקומביננטי. ידע זה יהיה השלכות קליניות משמעותיות לגילוי סמים בשני השדות פקקת וhemostasis.

קרישת דם פקטור VIII (FVIII) הוא גליקופרוטאין גדול של 2,332 חומצות אמינו מאורגן בשישה תחומים: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. על טרומבין הפעלת FVIII פועל כcofactor לפקטור IXA במתחם Tenase הקרום הנכנס. עקידת FVIII הופעל (FVIIIa) לFIXa באופן תלויי קרום משפרת את יעילות פרוטאוליטי FIXa יותר מ -10 5 פעמים, שהוא קריטי לקרישת דם יעילה 4. למרות התפקיד החשוב FVIII משחק בקרישה וההיווצרות המורכבת Tenase, מבנה FVIII קרום הנכנס הפונקציונלי הוא עדיין לא נפתר. לכתובת זו, צינורות בודדים bilayer שומנים (LNT) עשירים בphosphatidylserine (PS), מסוגלים מחייב FVIII עם זיקה גבוהה 8, 9 ומזכיר את משטח טסיות הדם מופעל פותחו 10. ארגון סליל רצוף של FVIII חייב LNT הוכח להיות effectiיש לקביעת מבנה של מדינת קרום הנכנס FVIII ידי Cryo-EM 5. פונקציונליות LNT הן מערכת אידיאלית ללמוד חלבונים וחלבונים אינטראקציות קרום של חלבוני קרום הקשורים מאורגנים helically ידי 11 Cryo-EM, 12. יש Cryo-EM היתרון על פני שיטות מבניות מסורתיות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן ותמ&quot;ג, כפי שהדגימה נשמרה בקרוב ביותר לסביבה הפיזיולוגית (חיץ, קרום, pH), ללא תוספים ואיזוטופים. במקרה של FVIII, לומד את מבנה הקרום הנכנס עם טכניקה זו היא אפילו יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, כמו LNT דומה בגודל, צורה והקומפוזיציה pseudopodia של טסיות הדם מופעל בו מתחמי Tenase להרכיב in vivo. פגמים וחסרים של סיבת FVIII המופיליה, הפרעת דימום חמורה המשפיעה על 1 ב 5,000 זכרים של האוכלוסייה האנושית 4, 6. רוב הדוארטיפול ffective להמופיליה הוא מנהל לכל חיים של FVIII רקומביננטי אדם (hFVIII). סיבוך משמעותי של טיפול FVIII המופיליה רקומביננטי הוא הפיתוח של נוגדנים מעכבים לצורה האנושית המשפיעה על כ 30% מחולי המופיליה 13. במקרה זה, משמש להתרכז FVIII חזירי (pFVIII), כפי שמציג FVIII חזירי תגובתיות צולבת נמוכה עם נוגדנים מעכבים כנגד FVIII וצורות מתחמים פונקציונליים עם FIXa אדם 7 בני אדם. הקמת ארגון הקרום הנכנס של שניהם חזיריים וצורות FVIII אדם חשובה להבין את הבסיס המבני של פונקצית cofactor FVIII והשלכות לעצירת דימום דם. במחקר זה, אנו מתארים שילוב של ננוטכנולוגיה שומנים בדם, Cryo-EM, וניתוח מבנה שנועד לפתור את ארגון הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד. הנתונים שהוצגו Cryo-EM ומבני 3D עבור porci המאורגן helicallyFVIII ne והאנושי על LNT הטעונה שלילי להראות את הפוטנציאל של ננוטכנולוגיה הוצעה כבסיס לקביעת מבנה של FVIII וגורמי קרישת קרום הנכנס ומתחמים בסביבת קרום פיזיולוגית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">JEM2100 with LaB6&#160;</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">JEM-2100</td>
			<td style="width:447px;">operated at 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">with TEMCON software</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan626 Cryo-holder</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">626.DH</td>
			<td style="width:447px;">cooled to -175 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">with temperature controler unit</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan 4K x 4K CCD camera</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">US4000</td>
			<td style="width:447px;">4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Solarus Model 950 plasma cleaner</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:205px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Materials</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">01821</td>
			<td style="width:447px;">plasma cleaned for 10 s on high power</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">Quantifoil R2/2 300 mesh</td>
			<td style="width:205px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Q225-CR2</td>
			<td style="width:447px;">Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">19481</td>
			<td style="width:447px;">1% solution, filtered</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:239px;">Galactosyl ceramide</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">860546</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840035</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Software</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">EM software Digital Micrograph</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">EM software EMAN</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">EM software Spider</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">EM software IHRSR</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;">Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (IMOD)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (SerialEM)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">UCSF-Chimera</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

helical organization of blood coagulation factor viii on lipid nanotubes

<html> מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים (Cryo-EM) 1 היא גישה רבת עוצמה כדי לחקור את המבנה התפקודי של חלבונים ומתחמים בסביבת מדינה וקרום התייבשות 2. קרישת פקטור VIII (FVIII) 3 הוא גליקופרוטאין פלזמה דם מרובה תחומים. פגם או חסר של FVIII הוא הגורם לסוג המופיליה - הפרעת דימום חמורה. עם הפעלת מפרקי חלבונים, FVIII נקשר לפרוטאז סרין פקטור IXA על הממברנה של טסיות הדם הטעונה השלילי, שהוא קריטי לקרישת דם נורמלית 4. למרות התפקיד המרכזי FVIII משחק בקרישה, מידע מבני למצב הקרום הנכנס שלה הוא 5 לא שלמים. תרכיז FVIII רקומביננטי הוא התרופה היעילה ביותר נגד סוג המופיליה וFVIII זמין מסחרי יכול לבוא לידי ביטוי כאנושי או חזירי, שני מתחמים פונקציונליים להרכיב עם אדם פקטור IXA 6,7. &quot;&gt; במחקר זה אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים (Cryo-EM), ניתוח ננוטכנולוגיה שומנים בדם והמבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד:. אנושי וחזירי המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) מתואר. תוצאות הנציג להוכיח כי הגישה שלנו היא רגישה מספיק כדי להגדיר את ההבדלים בארגון הסליל בין שני מאוד הומולוגי ברצף (זהות רצף 86% חלבונים). פרוטוקולים מפורטים לארגון הסליל, Cryo-EM וטומוגרפיה אלקטרון (רכישת נתונים) ET מקבלים. דו ממדי (2D) וניתוח מבנה התל ממדים (3D) מיושם כדי להשיג שחזורי 3D של אדם וחזירי FVIII-LNT נדונה. מבני FVIII-LNT הציגו אנושיים וחזיריים להראות את הפוטנציאל של המתודולוגיה המוצעת לcalculatדואר הארגון הפונקציונלי, הקרום הנכנס של פקטור VIII קרישת דם ברזולוציה גבוהה.

אנושי רקומביננטי וFVIII חזירי אורגנו בהצלחה על helically טעון שלילי LNT bilayer יחידה, שמזכירים את משטח טסיות הדם מופעל. ארגון הסליל של האדם והחזירי FVIII-LNT היה עקבי דרך micrographs הדיגיטלי שנאסף (איור 2). LNT השליטה והאנושית וצינורות סליל FVIII-LNT חזיריות נבחרו ומפולח עם GUI e2helixboxer.py וערכות נתונים ראשוניים שנוצרו עם GUI e2workflow.py, אפשרות חלקיקים בודדת (טבלת 1). כדי הסליל של אדם הקרום הנכנס וFVIII-LNT חזירית הוערך מההתמרה של ממוצעי הכיתה עם GUI e2display.py (EMAN2) (איור 3). Bilayer השומנים בממוצעי כיתת 2D LNT השליטה הטובים ביותר מוגדר היטב. העלון הפנימי וחיצוני והצפיפות נמוכה יותר של הליבה הידרופובי הקרום נראה בבירור ( <strong&gt; איור 3 א). הצפיפות הצפויה של המולקולות האנושיות והחזירי FVIII הקרום הנכנס המכוונות ולניצב לפני השטח הקרום מוגדר היטב ומראה בבירור את השינויים בארגון הסליל בין שני החלבונים (3B דמויות ו3 ג). התפנית בולטת יותר לצינורות סליל FVIII-LNT אדם מצביעה על כך שחלבוני האינטראקציות בין מולקולות FVIII קרום הנכנס הסמוכות שונות באופן עקבי לצורות שני FVIII (3B דמויות ו3 ג). חלקיקים מממוצעים בכיתה מראה ארגון טוב סליל (דפוס עקיפה סליל) מוזגו בGUI e2display.py כדי ליצור קבוצת ביניים חלקיקים (טבלת 1). חלקיקים מקבוצות חלקיקי ביניים סווגו שוב ב50 כיתות עם אותו האילוצים. חלקיקים מממוצעים בכיתה עם אותו הקוטר מוזגו בנתונים הסופייםסטים (טבלה 1). שחזורי 3D ראשוניים לFVIII-LNT האנושית והחזירית בוצעו עם 1,000 חלקיקי נציג האנושי הסופיות וערכות נתונים FVIII-LNT חזיריות. מאה חזרות IHRSR רצופות היו לרוץ לכל שחזור 3D עם צילינדר ייחוד (160 Å פנימי ו500 קוטר חיצוני א), כנפח ראשוני. העלייה צירית (Δz) מחושבת משילוב פורייה להפוך ממגזרי הסליל (חלקיקים מוגדרים) שווה ל41 לFVIII-LNT אדם ו36 Å לFVIII-LNT חזירית (4A ומספרים 4 ב). הזווית הראשונית azimuthal (ΔΦ) המוגדרת מחיפוש איטרטיבי מוערכת ב40.0 ° לFVIII-LNT אדם וב35.0 ° לFVIII-LNT החזיריות. הכרכים הסופיים נבדקים להתכנסות של הפרמטרים סליל והתכתבות בין ממוצעי כיתה ותחזיות מreconstr הסופיuction, גם בעקבות הקריטריונים שמתוארים ב 5. 3D השחזורים שנבחרו ומתאים פרמטרים סליל מוטלים כאמצעי אחסון ראשוני ופרמטרי סליל ראשוניים לעידון IHRSR שני של 100 מחזורים שהתכנסו לארגון סליל ארבעה להתחיל לFVIII-LNT האנושית עם Δz = 41.1 Å וΔΦ = 42.0 ° וארגון סליל חמש להתחיל לFVIII-LNT החזיריות עם Δz = 35.5 Å וΔΦ = 34.8 °. סופיות 100 IHRSR חזרות הטלת פי 4 וסימטרית סליל פי 5 לאדם ושחזורי FVIII-LNT חזיריות בהתאמה מתבצעות עם אמצעי אחסון ראשוני ופרמטרי סליל מתאימים מחידודי IHRSR סימטריים האחרונים (4C דמויות ו4D). הכרכים הסופיים מראים 8 FVIII אדם ו10 מולקולות קרום הנכנס חזיריות FVIII המאורגן סביב ציר הסליל (איור 5 א). כל אדםמולקולת FVIII מתורגמת 41.2 Å ומסובב 42.0 ° מהקודם וכל מולקולת FVIII חזירית מתורגמת 35.9 Å ומסובב 35.2 º מקודמו, המקביל לפרמטרי הסליל של השחזורים הסופיים 3D (איור 5). Tomograms האלקטרונים המשוחזר לאשר את ההבדל בארגון הסליל בין FVIII-LNT האנושית והחזירית שהושגה באותם תנאי הניסוי. השוואה בין ההשקפות העליונה מtomograms שוחזר וכרכי 3D משיקום הסליל שנצפו בכיוון ניצבת לציר הסליל, נוסף מאמתת את נכונותו של 3D השחזורים מעודנים עם הפרמטרים סליל IHRSR (איור 6). ממדי התא היחידה 2D סימטרי לשיקום FVIII-LNT 3D האדם הם: = 17.8 ננומטר, ב = 8.2, γ = 84 ° ולשיקום FVIII-LNT 3D חזירי: =18.4, b = 7.2 וγ = 70 ° (איור 6). ממדי התא היחידה של FVIII האנושי מאורגן בגבישים 2D קרום הנכנס הם: = 8.1, b = 7.0 וγ = 67 º, אשר תואם את השטח המכוסה על ידי מולקולת FVIII אחד שנצפו לכיוון קרום הקרקע 20. השוואת ממדי התא היחידה בין FVIII המאורגן ב2D וגבישי סליל מצביעה על כך שגם אדם ומולקולות FVIII חזיריים יוצרים הדימרים כאשר מאורגן helically על פני השטח LNT. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51254/51254fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. תרשים זרימת ניתוח מבנה. הצעדים אחריו לניתוח סיווג 2D המבוסס על אלגוריתמי יישור התייחסות חופשית מיושמים בEMAN2 16 הם הקיפו בכחול. הצעדים אחריו לניתוח 3D שבוצע עם אמיתי סליל איטרטיבי<html> אלגוריתמי שיקום החלל (IHRSR) הם מוקפים בעיגול אדום. מחזורי IHRSR איטרטיבי מסומנים עם חצים מקווקוים. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51254/51254fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. Micrographs Cryo-EM הדיגיטלי. (4,096 x 4,096 פיקסלים, 2.9 A / Pix) של צינורות שומנים (LNT) עם ובלי FVIII המאוגד. א הבקרה LNT. B. האדם FVIII-LNT. ג בשר חזירים FVIII-LNT . קצו של החור בסרט פחמן שבFVIII-LNT מושעה בקרח אמורפי מצויינים עם כוכב לבן. צפיפות החלבון ושומנים בדם הן בצבע שחור. הנופים מוגדלים (ריבועי) של 512 x 512 קצוצים אזורים (לבן מקווקו מרובע) להמחיש את ההבדל בארגון הסליל של האדם וFVIII חזירי, בהתאמה. סרגל קנה המידה הוא 100 ננומטר.ig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51254/51254fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. ממוצעי הנציג 2D כיתה (שורה העליונה) והתמרות מקבילות פורייה (בשורה תחתונה) מסטי חלקיקי ביניים (טבלת 1) סווגו ב50 כיתות. א בקרת LNT B. האדם FVIII-LNT ג בשר חזירים FVIII-LNT. מספר הכיתה ומספר החלקיקים הכלולים בכל כיתה מצוין. ההבדל במטרה סליל בין FVIII האנושי והחזירי נראה בבירור בתמונות ואושר על ידי דפוסי התאבכות המתקבלים מהפורה הופך לתמונות האלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51254/51254fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51254/51254fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. שחזורי סליל 3D של אדם והחזירי FVIII-LNT. א המשולב התמרת מ1,000 מגזרי סליל. שורת השכבה הראשונה ושנייה מרוכזות ב1/82 Å -1 ו1/41 Å -1 לאדם FVIII-LNT, וב1/72 Å -1 ו1/36 Å -1 לחזירית FVIII-LNT (לבן חיצים). הייצוג ב Surface של אדם בורוד (Δz = 41.1 Å, ΔΦ = 42.0 מעלות) וחזירי בכחול (Δz = 35.9 Å, ΔΦ = 35.2 º) שחזורי סליל FVIII-LNT 3D. שני הכרכים מוצגים ברמת מתאר 0.005 (צפיפות מינימאלית היא 0 וצפיפות מקסימלית 0.02, כפי שמחושבת בקליפורניה בסן פרנסיסקו פעמוןra, אפשרות הצופה נפח 21). אורכו של צינור FVIII-LNT הוא 256 פיקסלים ב2.9 A / pix. מתאם ג פורייה מעטה (FSC) מגרשים לאנושיים והחזירית FVIII-LNT מראה רזולוציה של 20.5 Å בFSC = 0.5. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51254/51254fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. ארגון סליל של FVIII-LNT. ייצוג פני השטח מקוטע אנושי וחזירי של שחזורים אנושיים וחזיריים FVIII-LNT סליל, המוצגים באיור 4. הכרכים מפולחים לאחר הטלת סימטריה של פי 4 לFVIII-LNT האדם והסימטריה פי 5 לFVIII-LNT החזיריות. היחידות סימטריות בצבע מקודדות צהובה אדומה לFVIII-LNT האדם וכחול ירוק לצפיות FVIII-LNT. א החזיריים לאורך ציר הסליל מצויינים עם ריבוע לאדם וכמומחומש לFVIII-LNT החזיריות. מבנה FVIII-LNT האדם מציג 8 מולקולות מאורגנות סביב קרום LNT החיצוני ומבנה FVIII חזירי תערוכות 10 מולקולות מאורגנות סביב קרום LNT החיצוני, שמסומנות במספרים. צפיות ב &#39;בניצב לציר הסליל. FVIII-LNT האנושית היא מבנה סליל 4 הזנק וFVIII-LNT החזיריות היא מבנה סליל 5-להתחיל. סלילים מתחילים אדם אחד מסומנים במספרים ובמקודדים בצבע. יש לנו הדגשתי אחד מהסלילים מכל מבנה עם (*) וקווים ירוקים. סרגל קנה המידה הוא 20 ננומטר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51254/51254fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. השוואה בין שחזורי הסליל וטומוגרפיה 3D. האדם FVIII-LNT () ושחזורי 3D סליל FVIII-LNT (C) חזיריים מוצגות perpendicular על ציר הסליל. כל תא יחידה וסלילים בודדים כמו באיור בצבעים 5. ב &#39;. ו-D. הם ייצוגי צפיפות של שחזורי טומוגרפיה 3D, שנצפו בניצב לציר הסליל. סריג 2D המשקף את הסדר הסליל של מולקולות FVIII מוצג עם קווים ירוקים. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="height:25px;"> דוגמאות </td><td style="height:25px;"> cLNT </td><td style="height:25px;"> hFVIII-LNT </td><td style="height:25px;"> pFVIII-LNT </td></tr><tr><td style="height:25px;"> Micrographs הראשוני </td><td style="height:25px;"> 61 </td><td style="height:25px;"> 474 </td><td style="height:25px;"> 542 </td></tr><tr><td style="height:25px;"> ערכות חלקיקים ראשוניות </td><td style="height:25px;"> 29,113 </td><td style="height:25px;"> 60395 </td><td style="height:25px;"> 64,665 </td></tr><tr><td style="height:25px;"> Defocus (ננומטר) </td><td style="height:25px;"> -4051 ± 502 </td><td style="height:25px;"> -3643 ± 737 </td><td style="height:25px;"> -3443 ± 1,086 </td></tr><tr><td style="height:25px;"> ערכות חלקיקים ביניים </td><td style="height:25px;"> 25,907 </td><td style="height:25px;"> 27,305 </td><td style="height:25px;"> 22,773 </td></tr><tr><td style="height:25px;"> ערכות חלקיקים סופיות </td><td style="height:25px;"> 25,907 </td><td style="height:25px;"> 10,455 </td><td style="height:25px;"> 10,430 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. סטטיסטיקת ניתוח 2D הבאה האלגוריתם שהוצג בתרשים הזרימה באיור 3.

Watch this Scientific Journal Video about Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes at JoVE.com

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים, ננוטכנולוגיה שומנים בדם, וניתוח מבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד: אדם וחזירי. המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו כדי לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) הוא תאר.

ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Views.  University of Texas Medical Branch.  אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים, ננוטכנולוגיה שומנים בדם, וניתוח מבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד: אדם וחזירי. המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו כדי לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פ...

Video: Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very promising application for molecular sensors, field effect transistor and super thin and flexible electronic devices1-4. Anodic arc discharge supported by the erosion of the anode material is one of the most practical and efficient methods, which can provide specific non-equilibrium processes and a high influx of carbon material to the developing structures at relatively higher temperature, and consequently the as-synthesized products have few structural defects and better crystallinity.
 To further improve the controllability and flexibility of the synthesis of carbon nanostructures in arc discharge, magnetic fields can be applied during the synthesis process according to the strong magnetic responses of arc plasmas. It was demonstrated that the magnetically-enhanced arc discharge can increase the average length of SWCNT 5, narrow the diameter distribution of metallic catalyst particles and carbon nanotubes 6, and change the ratio of metallic and semiconducting carbon nanotubes 7, as well as lead to graphene synthesis 8. 
 Furthermore, it is worthwhile to remark that when we introduce a non-uniform magnetic field with the component normal to the current in arc, the Lorentz force along the J&times;B direction can generate the plasmas jet and make effective delivery of carbon ion particles and heat flux to samples. As a result, large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes were simultaneously generated by such new magnetically-enhanced anodic arc method. Arc imaging, scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM) and Raman spectroscopy were employed to analyze the characterization of carbon nanostructures. These findings indicate a wide spectrum of opportunities to manipulate with the properties of nanostructures produced in plasmas by means of controlling the arc conditions.

Anodic arc discharge is one of the most practical and efficient methods to synthesize various carbon nanostructures. To increase the arc controllability and flexibility, a non-uniform magnetic field was introduced to process the one-step synthesis of large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes.

סינתזה סימולטני של יחיד חומה פחמן ו גרפן פלזמה ארק מגנטית מוגברת

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

לוקליזציה וכימות יחסית של פחמן בתאים עם Multispectral הדמיה תזרים cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

סינתזה של צינורות פחמן עם קירות רב שופרת סילבר חלקיקים והערכה של פעילות אנטיבקטריאליות שלהם ומאפיינים ציטוטוקסיות

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&amp;#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...