10SDG3500034 및 UTMB-NCB SSM에 자금을 시작 :이 작품은 미국 심장 협회에서 국가 과학자 개발 교부금에 의해 지원됩니다. 저자는 실리 UTMB에서 구조 생물학 센터 (에 알아내는-EM과 과학 컴퓨팅 시설을 인정 <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> )뿐만 아니라 박사 부부. 2D 및 3D 나선형 재건 알고리즘에 대한 도움말 스티브 Ludtke 에드 Egelman.

1. 샘플 준비 <ol><li> 버퍼 교환 인간 FVIII-BDD (14)과 HBS-CA 버퍼에 돼지 FVIII-BDD 15 (20 mM의 HEPES, 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 염화칼슘, 산도 = 7.4)는 1.2 ㎎ / ㎖에 집중한다. -80 ° C에서 단백질 용액을 유지 </li><li> 1시 4분 W / 클로로포름의 비율 (W)에 갈 락토 (GC) 및 포스파티딜 세린 (PS)을 혼합하여 지질 나노 튜브 (LNT)을 준비합니다. 아르곤 하에서 클로로포름을 증발시키고, 1 ㎎ / ㎖로 HBS 완충액에서 지질을 용해. 4 ℃에서 LNT 솔루션을 유지 </li></ol> FVIII-LNT의 2. 극저온 전자 현미경 <ol><li> cryo 종 샘플 준비 <ol><li> (300)는 50 (W)에 10 초 동안 O 2, H 2 가스의 혼합물에 Quantifoil R2 / 2 구리 그리드 (탄소 사이드)를 메쉬 방전을 글로우 </li><li> 1시 1분 w / w 비율에 HBS-CA 버퍼의 FVIII 및 LNT 솔루션을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 2.5 ㎕의 한 방울을 적용합니다Vitrobot 마크 IV 가습 실 (100 % 습도)에서 친수성 ​​전자 현미경 눈금 FVIII-LNT 샘플. </li><li> 오와 플래시 액체 C 2 H 6 그리드 (3.5 초 동안 한 오점, 얼룩 힘 1) 동결, 비정질 얼음을 얻기 위해 액체 N 2로 냉각. </li><li> 액체 N 2 (LN2)에서 보관 상자에 보관 그리드. </li></ol></li><li> CRYO-EM 데이터 수집 NOTE : JEM2100-LaB6 (2010 년)는 전자 현미경, 진공 시스템, 조명 시스템, HT, 렌즈 전류 등 온 독서 창문 스크린 및이 연결된 컴퓨터 이루어진 TEMCON 운영체제 탑재 패널 : 왼쪽 및 오른쪽 열의 양쪽에 배치. 빔 이동 X, Y 노브 (SHIFT Y, SIFT Y)와 다기능 (DEF / STIG) 노브가 두 패널에 있습니다. 왼쪽 패널의 조명 (BRIGTHNESS) 노브입니다. 오른쪽 창에 다음과 같습니다 배율 (MAG / CAM 길이)와 포커스 (FOCUS) 노브와 세 걸 보면G (MAG1, MAG2, LOWMAG)과 회절 (DIFF) 모드 버튼. 우리는 알파 2에 MAG1에서 우리의 데이터를 수집. 알아내는-EM 데이터 수집에 필요한 최소량의 조명 조건 (MDS) 오른쪽 패널에 F6 버튼, 맨 윗줄을 통해 F1으로 설정됩니다. 이 프로토콜에서 일반 설정이 사용됩니다 : F1 - 인상 / 낮은 화면, F2 - 검색 모드, F3 - 포커스 모드, F4 - 사진 모드, F5 - MDS OFF / ON 및 F6 - BEAM BLANK, 방사선으로부터 시료를 보호하는 데 사용 빔을 편향에 의해 손상 될 수 있습니다. <ol><li> 크라이 역에 크라이 홀더를 놓고 홀더와 LN2와 크라이 역의 듀어를 입력합니다. 온도가 -192 ° C, 홀더의 끝에 열려있는 셔터에 도달하면, 장소 이전에 지정된 장소에 알아내는-EM 그리드를 동결 링 클램프로 고정. </li><li> 전자 현미경으로 극저온 홀더를 삽입합니다. 극저온 홀더 및 LN2와 반대로 contaminator 챔버의 듀어 리필. 홀더는 30 ~ 60 분 동안 안정화 될 때까지 기다립니다. 보도 자료에 F6과필라멘트 전원을 켭니다. 격자를 볼 수있는 홀더에 필라멘트가 포화, F6 키를 눌러 끄고 셔터 열기. </li><li> 보도 자료 저배율 / 알파 1 (200X의 잡지에서 설정) 및 그리드에 얇은 얼음으로 영역을 찾습니다. </li><li> 최소 용량 (MDS) 모드를 설정하고 표본을 손상시키지 않고, 낮은 전자 복용에 cryo 종 데이터를 수집하기 위해 MAG의 1/alpha 2로 전환합니다. <ol><li> F2 키를 눌러 검색 모드를 설정합니다. 40,000 X에 배율을 설정합니다. / 2 ·의 - 최소한의 전자 량에 BRIGTNESS 노브 ~ 0.04 전자와 빔을 확대합니다. 보도 자료 DIFF 회절 모드로 전환합니다. MAG / CAM의 길이 노브 120 cm에 카메라 길이를 설정합니다. 탄소막의 구멍의 지질 나노 튜브가 LOWMAG에서 미리 선택된 구역 내의 격자 영역을 찾아. </li><li> F4 키를 눌러 40,000 배 확대 한 사진 모드를 설정하고 16-25 E의 복용시 밝기 노브로 조명을 설정 - / 2 ·의. Z-높이를 조정하는 초점 조건을 설정하기 위해 눌러 기본 포커스 버튼Z UP / DOWN 버튼 (오른쪽 컨트롤 패널)와 시편의. -1.5와 -2.5 μm의 사이에 설정 디 포커스. </li><li> 사진 모드에서 이미지에 표시 할 영역에 해당하는 검색 모드에서 디지털 카메라 모니터에 라이브 뷰 창에서 사각형 그리기로 검색하여 사진 모드를 맞 춥니 다. </li><li> F3 키를 눌러 100,000 X 배율에서 초점 모드를 설정합니다. 사진 모드에서 이미지에 표시 할 영역을 조사하지 않도록 - (5 ㎝ 반경 ~ 4) 및 축 오프 CCD 칩을 충당하기 위해 조명을 초점을 맞 춥니 다. FOCUS 노브 및 DEF / STIG 노브와 이미지의 난시에 대한 올바른와 ~ -1.5과 -2.5 μm의 디 포커스를 조정합니다. </li></ol></li><li> 디지털 카메라 모니터에 라이브 뷰 창에서 라이브 영상을 획득하여 검색 모드에서 이미지에 표시 할 FVIII-LNT를 선택합니다. 라이브 뷰 창에 그려진 사각형 FVIII-LNT를 중앙에 배치합니다. </li><li> 사진 모드로 전환하고 ACQUIR을 클릭하여 52,000 X 효과 배율 0.5 초 노출에 CCD 카메라의 디지털 이미지를 기록디지털 현미경 카메라 모니터에서 E 버튼을 누릅니다. 화상 획득 조건은 그러한 화상 PHOTO 모드에서 획득 된 경우에만 개방 빔 블랭크 (셔터)로서 설정된다. </li><li> 고속 푸리에 변환 (FFT)을 구하는 CTRL-F를 눌러 취득 된 화상의 품질 및 디 포커스를 확인한다. </li></ol></li></ol> 3. 3D 재구성 참고 : 2D 및 3D 분석에 사용 된 이미지 분석 소프트웨어 : EMAN2 및 IHRSR 자유롭게 사용할 수 있습니다. EMAN2는 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install에서 다운로드 할 수 있습니다. egelman@virginia.edu : IHRSR 소프트웨어는 교수 Egelman에서 얻을 수 있습니다. 최종 IHRSR 세목이 텍사스에서 실행하는 센터 클러스터 컴퓨팅 고급 : http://www.tacc.utexas.edu/을 텍사스 대학 오스틴에서. 그림 1에 표시된 3 차원 복원 알고리즘은 두 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다 : 첫 번째 차원 참조 무료 alignme 나선 세그먼트 (입자)의 균일 한 세트를 선택NT (RFA) 알고리즘은 제 IHRSR에 통합 헬리컬 파라미터 및 확대 투영 알고리즘을 기반 3D 재구성을 달성 EMAN이 구현. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 : 첫 번째 단계는 단일 입자 SPA EMAN2이 특별히 개발 및 배포되고있는 (알고리즘)과 3D 재건을 위해 균일 한 입자의 집합을 선택하기 위해 개발 된 프로그램을 사용합니다. 이 단계는 극저온-EM 데이터에 적응되었다. 두 번째 단계는 특히 재조합 인자 VIII 형태로 수득 헬리컬 어셈블리의 분류를 위해 설계 IHRSR 알고리즘으로 이루어진다. 이 알고리즘은 과학 문학 (12)를 통해 광범위하게 설명되어 있습니다. <ol><li> 균일 한 입자 나선형 재건 (나선형 세그먼트) 세트를 선택 http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 : EMAN2 과학 이미지 프로세싱 제품군과 2D 이미지 분석을 수행합니다. <ol><li> 똑 바른과 극저온-EM의 현미경 사진을 선택HT 디지털 카메라 소프트웨어 및 시각화 도구를 나선형 튜브를 잘 조직. </li><li> 반전, 정상화하고 e2workflow.py GUI에서 X-선 픽셀, 단일 입자의 재구성 (SPR) 옵션을 필터링 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> e2helixboxer.py의 GUI에서, 역 정규화 및 X-선 픽셀이 필터링 된 이미지를 가져옵니다. 사용하여 90 % 정도 겹쳐 256 X 256 픽셀 (2.9 A / PIX)에 FVIII-LNT의 나선형 튜브와 세그먼트를 선택 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> 원래의 현미경 사진에서 디 포커스를 평가하고 e2workflow.py에 통합 e2ctf.py 옵션과 같은 현미경에서 나선형 세그먼트에 대비 전송 기능 (CTF) 보정 (만 위상 보정)를 적용 http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> 초기 입자 (나선형 세그먼트)를 생성 e2workflow.py GUI에서 설정 - SPR 옵션 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> ITER = 8 - &#39;e2refine2d.py : e2refine2d.py 알고리즘 스크립트 다음과 같은 직경의 LNT와 나선형의 주문도 (그림 2)와 균일 한 데이터 세트를 선택하는 기준 무료 K-평균 등급을 적용하기로 2D 수준의 평균을 계산 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - 경로 = r2d_001 - 입력 = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = 도트 - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = 도트 - classraligncmp = 상 - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = 평균 - normproj-classkeepsig &#39;, 그에 따라 ncls 값을 변경. <ol><li> 클래스 평균 80 % 이하의 유사성 입자가 주어진 클래스에서 제외되는 것을 의미한다 &#39;classkeep = 0.8&#39;8 반복을 통해 150 클래스 &#39;= 151 ncls&#39;에서 설정 한 초기 데이터를 분류. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> 클래스의 평균에서 입자를 병합중간 데이터 세트를 생성하는 e2display.py의 발음 나선 회절. </li><li> 순서의 동일한 직경과 정도 클래스를 구분하기 위해 50 클래스 &#39;= 51 ncls&#39;에서 설정 한 중간 데이터를 분류. </li><li> http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector : 입체 재건에 대한 최종 데이터 세트를 생성하는 e2display.py 주문의 동일한 직경과 정도 클래스에서 입자를 병합합니다. </li></ol></li></ol></li><li> Egelman (17, 18)에 설명 된대로 반복 나선형 실제 공간 재건 (IHRSR) 알고리즘으로 나선형 재건을 수행합니다. <ol><li> 상승을 추정 결합 푸리에에서 FVIII-LNT 나선 ΔZ (A)는 최종 데이터 세트에서 입자의 변형. </li><li> 5에서 ΔΦ 증가, 일정한 ΔZ와 병렬 IHRSR 세목을 실행하여 방위각 ΔΦ (º)를 정의76; 5 ° 씩 60 °에. </li><li> 초기 볼륨으로 특색이없는 실린더와 3.2.1에 정의 된 초기 나선 매개 변수 ΔZ 및 ΔΦ로 설정 한 각 최종 데이터 100 연속 IHRSR주기를 실행합니다. 3.2.2. </li><li> 클래스 최종 데이터 세트의 2 차원 분류에서 평균과 최종 IHRSR 재건의 돌기 사이의 나선형 매개 변수와 대응의 융합의 최종 볼륨을 검사합니다. </li><li> 최종 비대칭 3D 볼륨에서 관찰 된 비대칭 단위 분포에 해당하는 최종 3 차원 복원에 대칭을 부과 : 인간 FVIII-LNT 4 배와 돼지 FVIII-LNT에 대한 5 배. 최종 대칭 된 3D 재구성을 생성하는 또 다른 100 정제 사이클을 실행합니다. </li><li> &#39;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfil : 첫 번째 홀수 및 짝수에 해당 데이터 셋을 분리하여 두 볼륨에 대한 푸리에 쉘의 상관 관계 곡선을 계산전자&gt; - 분할 = 2 &#39;. 3.2.3에 설명 된대로 100 IHRSR 연속 분류 실행합니다. 홀수 및 짝수 데이터 세트에서 생성 된 3D 볼륨의 FSC를 계산 &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> UCSF 키메라의 FVIII-LNT 볼륨을 시각화하고 세그먼트. </li><li><ol><li> 단계 3.2.5에서 최종 볼륨을 엽니 다. UCSF 키메라와 도구&gt; 볼륨 데이터&gt; VOLUME 뷰어 옵션에서 0.005로 윤곽 레벨을 설정합니다. </li><li> 툴&gt; VOLUME 자료&gt; 세그먼트 MAP, 세그먼트 MAP 탭을 선택 볼륨 및 세그먼트 볼륨에 세그먼트를 클릭합니다. </li><li> 그룹 세그먼트는 CTRL +의 SHIFT 및 클릭기로 선택하여 하나의 단위 셀에 대응. </li><li> 단위 세포에 의해 세그먼트를 색상과 구조적 특징을 강조하기 위해 작업&gt; COLOR 옵션으로 나선. </li></ol></li></ol> 4. 전자 단층 촬영 <ol><li> 부정적인 스테인드 FVIII-LNT 샘플 준비 <ol> &lt;리&gt; cryo 종의 실험으로 FVIII-LNT 샘플을 준비합니다. </li><li> cryo 종의 실험로에서 서쪽으로 50에서 O 2, 10 초 동안 H 2 가스의 혼합물에 탄소 코팅 300 메쉬 구리 그리드 (탄소 사이드)를 배출 노을. </li><li> 그리드 6 나노 콜로이드 금 나노 입자와 2.5 ㎕의 FVIII-LNT 서스펜션의 드롭을 적용, 초과 액체를 얼룩 부정적인 2 분 5 ㎕의 1 % 우라 닐 아세테이트 용액을 적용하여 얼룩. 그리드를 건조 과잉 액체와 공기를 더 럽히. </li></ol></li><li> 전자 단층 촬영 데이터 수집 <ol><li> 하나의 경사 홀더에 격자를 전송합니다. </li><li> 전자 현미경에 홀더를 전송합니다. </li><li> 52,000 X 효과적인 배율 CCD 카메라와 +60 ° 및 이미지 촬영시 -60 °의 각도 범위에서 2 ° 씩의 SerialEM 소프트웨어 (19) 자동 기울기 시리즈를 수집, -6 -10 μm의 디 포커스 (150)의 전자 량에 - 170 ELEctrons / 2 ·의 단층 당. </li></ol></li><li> FVIII-LNT의 전자 단층 촬영 재건 참고 : 4.2에서 획득 한 pFVIII-LNT와 hFVIII-LNT 경 시리즈를 재구성. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html : 튜토리얼 다음 IMOD 소프트웨어의 ETomo 옵션 <ol><li> 터미널 창을 사용하여, 3DMOD의 단층 촬영을 엽니 다. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> 빈은 IMOD BINVOL 4에 의한 단층은 단층의 크기를 감소시키는 명령. </li><li> IMOD ROTATEVOL 명령을 사용 비닝 단층에서 Y 축을 따라 지질 나노 튜브를 회전 시키도록 적절한 각도를 선택한다. </li><li> IMOD ROTATEVOL 명령을 사용하여 전체 단층 촬영을 돌립니다. </li><li> IMOD CLIP 크기 변경 명령​​을 사용하여 Y 축을 따라 중심 선택한 지질 나노 튜브를 자릅니다. </li><li> 3DMOD로 자른 하위 단층 촬영을 엽니 다. </li><li> 따라서 인자 VIII 분자의 배열을 시각화하기 위해 단층 촬영을 클릭Z-축 및 부 단층 체적 Y-축을 따라 분할. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 금융 관심이 없다 그들이이 원고에 발표 된 절차에 대해 직접 연락 할 수 있다는 것을 선언합니다.

이 연구에서 방법론은 매우 상동 단백질의 두 개의 막 결합 조직을 구별하기 위해 제시된다 : 인간과 돼지 FVIII 자기 조립 인체에서 발생하는 조건에서 지질 나노 튜브. 설명 과정에서, 인간과 돼지 FVIII 성공적으로 가장 중요한 단계로, 지질 나노 튜브에 나선형으로 구성되어 있습니다. 다음 중요한 단계는 주변의 액체 N 2 온도에서 플래시 냉동으...

혈액 응고 인자 VIII (FVIII)는 여섯 도메인이 구성 2,332 아미노산의 많은 당 단백질이다 : A1-A2-B-A3-C1-C2 3. 트롬빈 활성화 FVIII는 막 결합 Tenase 단지 내 팩터 IXA에 보조 인자 역할을시. 막 따라 방식으로 FIXa에 활성화 FVIII (FVIIIa)의 바인딩 FIXa의 단백질 분해 효율에게 효율적인 혈액 응고 4 중요한 10 개 이상의 5 시간을, 강화한다. FVIII이 응고 Tenase 복합체 형성에서 수행하는 중요한 역할에도 불구하고, 기능 막 결합 FVIII 구조를 해결하기 위해 아직있다. 이 문제를 해결하기 위해 높은 친화력 8,9 FVIII과 결합하고 활성화 된 혈소판 표면 닮은 할 세린 (PS)에서 부유 단일 지질 이중층 나노 튜브 (LNT)을 10 개발되었다. LNT에 바인딩 FVIII의 연속 나선 조직은 effecti로 입증되었습니다극저온-EM (5)에 의해 FVIII 막 바인딩 된 상태의 구조 결정에 대한했습니다. 기능화 LNT는 cryo 종 (11, 12)에 의해 단백질 - 단백질 및 나선형으로 조직 막 관련 단백질의 단백질 막 상호 작용을 연구 할 수있는 이상적인 시스템입니다. 시편의 생리적 환경 (버퍼, 막, 산도)에 가장 가까운에서 보존으로 알아내는-EM은 첨가제 및 동위 원소없이, 이러한 X-선 결정학 및 NMR 등 기존의 구조 방법에 비해 장점이 있습니다. LNT의 크기, 형상 및 조성 Tenase 복합체가 생체 내에서 조립 활성화 된 혈소판의 pseudopodia에 의해 방불로 FVIII의 경우,이 기술을 막 결합 구조를 공부하는 것은, 더 많은 생리 학적으로 관련이 있습니다. 결함 및 FVIII 원인 혈우병 A, 인구 4, 6의 1 5,000 명의 남성에 영향을 미치는 심각한 출혈 장애의 결핍. 대부분의 전자혈우병에 대한 ffective 치료는 재조합 인간 FVIII (hFVIII)의 평생 관리입니다. 재조합 FVIII 혈우병 치료의 중요한 합병증은 혈우병 환자 (13)의 약 30 %에 영향을 미치는 인간의 모습을 억제 항체의 개발이다. 이 경우, 돼지 FVIII (pFVIII) 농축 인간 FVIII과 인간 FIXa 7 형태의 기능성 복합체에 대한 억제 항체 돼지 FVIII 표시 낮은 교차 반응으로 사용된다. 돼지와 인간 FVIII 양식 모두의 막 결합 조직을 설정하면 FVIII 공동 인자의 기능 및 혈액 지혈에 대한 의미의 구조적 기초를 이해하는 것이 중요합니다. 이 연구에서, 우리는 지질 나노 기술, 극저온-EM, 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 조직을 해결하기 위해 설계 구조 분석의 조합을 설명합니다. 나선형으로 조직 porci의 제공을 알아내는-EM 데이터와 3 차원 구조음으로 대전 된 LNT에 북동 인간 FVIII는 FVIII의 구조 결정 및 막 결합 응고 요인과 생리적 막 환경에서 단지 기초로 제안 된 나노 기술의 잠재력을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">JEM2100 with LaB6&#160;</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">JEM-2100</td>
			<td style="width:447px;">operated at 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">with TEMCON software</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan626 Cryo-holder</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">626.DH</td>
			<td style="width:447px;">cooled to -175 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">with temperature controler unit</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan 4K x 4K CCD camera</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">US4000</td>
			<td style="width:447px;">4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Solarus Model 950 plasma cleaner</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:205px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Materials</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">01821</td>
			<td style="width:447px;">plasma cleaned for 10 s on high power</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">Quantifoil R2/2 300 mesh</td>
			<td style="width:205px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Q225-CR2</td>
			<td style="width:447px;">Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">19481</td>
			<td style="width:447px;">1% solution, filtered</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:239px;">Galactosyl ceramide</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">860546</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840035</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Software</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">EM software Digital Micrograph</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">EM software EMAN</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">EM software Spider</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">EM software IHRSR</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;">Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (IMOD)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (SerialEM)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">UCSF-Chimera</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

helical organization of blood coagulation factor viii on lipid nanotubes

<html> 극저온 전자 현미경 (cryo 종) (1)는 수화 상태와 막 환경 2 단백질과 복합체의 기능 구조를 조사 할 수있는 강력한 방법입니다. 응고 인자 VIII (FVIII)은 세 다중 도메인 혈장 당 단백질이다. 심각한 출혈 장애 - 결함 또는 FVIII의 결핍은 혈우병 A 형의 원인이다. 단백질 분해 활성화되면, FVIII 정상적인 혈액 응고 4 중요한 부정 청구 혈소판 막에 세린 프로테아제 팩터 IXA에 바인딩합니다. FVIII이 응고에서 수행하는 중추적 인 역할에도 불구하고, 그것의 막 결합 상태에 대한 구조 정보가 불완전 5입니다. 재조합 FVIII 농축 혈우병 타입에 대해 가장 효과적인 약물이며 시판 FVIII는 인간이나 돼지, 인간 팩터 IXA 6,7 모두와 복합체 형성 기능과 같이 표현 될 수있다. &quot;&gt;이 연구에서 우리는 극저온 전자 현미경 (cryo 종)의 조합을 제시, 지질 나노 구조 분석은 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 구조를 해결하기 위해 적용 :. 인간과 돼지의 연구실에서 개발 된 방법론 나선형으로 마이너스로 충전 된 지질 나노 튜브 (LNT)에있는 두 개의 기능 재조합 FVIII의 형태를 구성하는 것이 설명되어 있습니다. 대표적인 결과는 우리의 접근 방식은 순서에 매우 상동 두 (86 % 서열 동일성 사이의 나선형 조직의 차이를 정의 할 수있을만큼 충분히 민감하다는 것을 보여 ) 단백질. 헬리컬 조직, 극저온-EM 및 전자 단층 촬영 (ET) 데이터 수집에 대한 상세한 프로토콜. 이차원 (2D 관련) 및 3 차원 (3D) 구조 분석은 인간 및 돼지의 3D 재구성을 구하는인가 FVIII-LNT가 논의된다.되게 인간 및 돼지 FVIII-LNT 구조가 제안 된 방법론의 전위 계산기 계산기하도록 보여높은 해상도에서 혈액 응고 인자 VIII의 전자 기능, 막 결합 조직.

재조합 인간과 돼지 FVIII은 성공적으로 부정적으로 활성화 된 혈소판 표면을 닮은, 단일 이중층 LNT 청구 나선형으로 조직되었다. 인간과 돼지 FVIII-LNT의 나선형 조직 (그림 2) 수집 된 디지털 현미경을 통해 일치했다. 제어 LNT와 인간과 돼지 FVIII-LNT 나선형 튜브를 선택 e2helixboxer.py의 GUI 및 e2workflow.py의 GUI, 단일 입자 옵션 (표 1)로 만든 초기 데이터 세트로 분할?...

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Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

인간과 돼지 : 우리는 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 구조를 해결하기 위해 적용 극저온 전자 현미경, 지질 나노 기술 및 구조 분석의 조합을 제시한다. 나선형으로 마이너스로 충전 된 지질 나노 튜브 (LNT)에있는 두 개의 기능 재조합 FVIII의 형태를 구성하는 우리의 실험실에서 개발 된 방법론을 설명한다.

지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 조직

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K 조회수.  University of Texas Medical Branch.  인간과 돼지 : 우리는 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 구조를 해결하기 위해 적용 극저온 전자 현미경, 지질 나노 기술 및 구조 분석의 조합을 제시한다. 나선형으로 마이너스로 충전 된 지질 나노 튜브 (LNT)에있는 두 개의 기능 재조합 FVIII의 형태를 구성하는 우리의 실험실에서 개발 된 방법론을 설명한다. 

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Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very promising application for molecular sensors, field effect transistor and super thin and flexible electronic devices1-4. Anodic arc discharge supported by the erosion of the anode material is one of the most practical and efficient methods, which can provide specific non-equilibrium processes and a high influx of carbon material to the developing structures at relatively higher temperature, and consequently the as-synthesized products have few structural defects and better crystallinity.
 To further improve the controllability and flexibility of the synthesis of carbon nanostructures in arc discharge, magnetic fields can be applied during the synthesis process according to the strong magnetic responses of arc plasmas. It was demonstrated that the magnetically-enhanced arc discharge can increase the average length of SWCNT 5, narrow the diameter distribution of metallic catalyst particles and carbon nanotubes 6, and change the ratio of metallic and semiconducting carbon nanotubes 7, as well as lead to graphene synthesis 8. 
 Furthermore, it is worthwhile to remark that when we introduce a non-uniform magnetic field with the component normal to the current in arc, the Lorentz force along the J&times;B direction can generate the plasmas jet and make effective delivery of carbon ion particles and heat flux to samples. As a result, large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes were simultaneously generated by such new magnetically-enhanced anodic arc method. Arc imaging, scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM) and Raman spectroscopy were employed to analyze the characterization of carbon nanostructures. These findings indicate a wide spectrum of opportunities to manipulate with the properties of nanostructures produced in plasmas by means of controlling the arc conditions.

Anodic arc discharge is one of the most practical and efficient methods to synthesize various carbon nanostructures. To increase the arc controllability and flexibility, a non-uniform magnetic field was introduced to process the one-step synthesis of large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes.

동시 단일 벽의 탄소 나노튜브의 합성과 자기 (磁 气) 향상된 아크 플라즈마에 Graphene

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

연구

생체공학

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

마이크로 RNA 전 사체 (Transcriptome)의 전사 인자 종속 규정을 설명

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

신경 성장 인자의 사업자로 서 다공성 실리콘 필름을 디자인

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...