עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מחקר מהמועצה הלאומית לבריאות והמחקר הרפואי של אוסטרליה, האנטר מכון המחקר הרפואי, ואוניברסיטת ניוקאסל.

כל ההליכים מתבצעים באישור מאוניברסיטת ניוקאסל טיפול בבעלי חיים ובועדת אתיקה, וכן בהתאם להנחיות ותקנות הרלוונטיות, ובכלל זה NSW מחקר בבעלי חיים החוק, NSW בעלי החיים תקנה המחקר, והקוד האוסטרלי של תרגול עבור טיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. 1. Dissection של רקמת המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את חולדות זכרי שנים עשר בן שבוע על ידי עריפת ראש. יכולות להיות שהקריבו את חולדות על ידי מדהים ועריפת ראש, או יכולות להיות מורדמת ראשון עם isoflurane (אינדוקציה 5%, תחזוקת 1.5-2%) ב70% N 2 ו30% O 2, ולאחר מכן ערפו את הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח מהגולגולת במהירות אפשרית (באופן אידיאלי, זה צריך להתבצע בפחות מ -2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קליפת המוח על ידי ביד חופשית לנתיחה. הנתיחה צריכה להתבצע במינימום הזמן האפשרי, עם נזק מועט כלמוח ככל האפשר כדי Maintain היושרה של הפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר את כל עור שיורית, פרווה, דם, וכו &#39;, לטבול את המוח בכמות קטנה (3-5 מיליליטר) של 37 ° C חיץ קרבס (118 כלוריד מ&quot;מ נתרן, אשלגן כלורי 4.7 מ&quot;מ, סידן כלורי 1.3 מ&quot;מ, פוספט 1.2 מ&quot;מ אשלגן dihydrogen, מגנזיום סולפט 1.2 מ&quot;מ, פחמה נתרן מימן 25 מ&quot;מ, 11.7 גלוקוז מ&quot;מ, 0.03 חומצת disodium מ&quot;מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), מתאזן עם חמצן 95% / 5% פחמן דו חמצני (carbogen), pH 7.4). </li></ol> 2. הכנת Microslices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח על הבמה של מסוק McIlwain שבשני פרוסות של נייר סינון הוצבו והרטיבו עם חיץ קרבס חם. שמור על המוח ונייר סינון טבול בחיץ קרבס חם, אבל לא כל כך רטוב שיש נוזל חופשי על פני השטח של הנייר שיכול לגרום למוח כדי להחליק בסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את המוח ל250 מיקרומטר סעיפי העטרה. כמו חומרים מזינים, חמצן וחומרי פסולת הבדרך כלל החליף עם אספקת הדם הם החליפו עם נוזל המקיף את הרקמה ברקמה עצבית מבודדת, בגודל של פרוסות לא צריך להיות יותר מ -400 מיקרומטר בעובי כדי לאפשר חילופי חמצון וחומרים מזינים מספיק כדי להתעורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הבמה McIlwain 90 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את המוח לפרוסות 250 מיקרומטר sagittal. בזאת, חלקים במוח אלה (250 מיקרומטר x 250 מיקרומטר פרוסות באורך משתנה בהתאם לעובי של הרקמה) מכונים microslices. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את microslices לתוך צינור תחתון עגול עם 10-15 מיליליטר 37 ° C חיץ קרבס (הסכום של חיץ קרבס שימוש יהיה תלוי בכמות הרקמה). </li></ol> 3. איזון של Microslices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתסיס עד microslices הבודד מושעים, ולאחר מכן לאפשר להם להתיישב תחת כובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant, אשר יהיה מעונן בשל פסולת תא מושעה, ולהוסיף 10 מיליליטר הטרי 37 מעלות צלזיוסקרבס חיץ לצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך שטיפה זו ארבע פעמים, מה שיגרום להסרה של רוב הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זאת, לאזן microslices על 37 מעלות צלזיוס עם רעד / היפוך עדין, ולשנות את קרבס חיץ כל 15 דקות לשעה 1 בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, להוסיף 2 מיליליטר חיץ 37 מעלות צלזיוס קרבס טרי, ולהעביר 15-20 microslices (150 μl של ההשעיה microslice) לקלקר תחתית שטוח 5 מיליליטר צינורות באמצעות פיפטה קצה נוסף רחב לשעמם עם קצוות מוחלקים (שניתן ליצור על ידי חיתוך ~ 2 מ&quot;מ מהקצה של קצה P1000). מורחים את microslices באופן שווה על הבסיס של הצינור בשכבה אחת, כך שכל microslice הוא לא יותר מאשר כמה מילימטרים מהאווירה מחומצן. </li></ol> 4. גירוי יתר רעיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה microslices על 37 מעלות צלזיוס, ועובר ללא הרף carbogen על פני השטח של ההשעיה 150 microslice μl, תוך שימוש בקו גז שהוא עמדהאד רק מעל פני השטח של ההשעיה microslice (כדי למנוע הפרעה מכאנית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק microslices עם או 150 μl 5 גלוטמט מ&quot;מ + 100 מיקרומטר גליצין בחיץ קרבס (גירוי יתר רעיל: ריכוז סופי גלוטמט + 50 מיקרומטר גליצין 2.5 מ&quot;מ) או 150 חיץ קרבס μl לבד (לשלוט nonstimulated). מגוון רחב של גירויים יכול לשמש בשלב זה (לרבות, אך לא רק, AMPA, NMDA + גליצין, שלילת קוטביות KCl, ומחסור בחמצן / גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הדגירה בזמנים שונים לאחר הגירוי (0, 30, 60, 90, 120, ו300 שניות), ולהחליף אותו עם 300 μl של חיץ המגון קר כקרח (30 מ&quot;מ טריס, 7.4, אתילן גליקול 1 מ&quot;מ pH חומצת tetraacetic, 4 mM EDTA, 100 molybdate מיקרומטר אמוניום, pyrophosphate נתרן 5 מ&quot;מ, פלואוריד הנתרן 25 מ&quot;מ, orthovanadate נתרן 1 מ&quot;מ, phenylmethanesulfonylfluoride 1 מ&quot;מ, מעכבי פרוטאז קוקטייל מלא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize microslices על קרח, תוך שימוש בזכוכית טפלון Dounce Homogenizer(20 משיכות; 700 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> homogenates החנות ב -80 מעלות צלזיוס, ומולקולות איתות שונות, מולקולות מוות, וכו &#39;ניתן למדוד על ידי כתם מערבי. </li></ol>

<ol>
	<li>Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+challenges+and+opportunities+in+stroke.">Mechanisms, challenges and opportunities in stroke.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).</li><li>Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+excitotoxic+neuronal+death.">Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death.</a> Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).</li><li>Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cAMP/PKA+and+MAPK+signaling+in+neuronal+cells+is+dependent+on+developmental+stage.">Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage.</a> Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).</li><li>Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+effect+of+protein+synthesis+inhibitors+on+potassium+deficiency-induced+apoptotic+cell+death+in+immature+and+mature+neuronal+cultures.">Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures.</a> J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).</li><li>Kristensen, B. W., Noraberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+excitotoxic+profiles+of+ATPA,+AMPA,+KA+and+NMDA+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).</li><li>Lecrux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneously+hypertensive+rats+are+highly+vulnerable+to+AMPA-induced+brain+lesions.">Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions.</a> Stroke. 38, 3007-3015 (2007).</li><li>Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+influx+pathways,+not+calcium+load,+determine+neuronal+vulnerability+to+calcium+neurotoxicity.">Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity.</a> J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).</li><li>Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+central+nervous+system+models+of+mechanically+induced+trauma:+a+review.">In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).</li><li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Neurochemistry.">Practical Neurochemistry.</a> , (1975).</li><li>Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha+CaMKII+is+differentially+regulated+in+brain+regions+that+exhibit+differing+sensitivities+to+ischemia+and+excitotoxicity.">alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).</li><li>Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3H]MK-801+binding+in+immature+and+mature+chicken+forebrain.">3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).</li><li>Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+glutamate+receptor+stimulated+inositol+phospholipid+metabolism+and+45Ca(2+)-accumulation+in+posthatch+chicken+forebrain.">Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).</li><li>Sharps, E. S., McCarl, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatographic+method+to+measure+32P+incorporation+into+phosphorylated+metabolites+in+cultured+cells.">A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells.</a> Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).</li><li>Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurment+of+the+ADP:ATP+ratio+in+human+leukaemic+cell+lines+can+be+used+as+an+indicator+of+cell+viability,+necrosis+and+apoptosis.">Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis.</a> J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).</li><li>Rodnight, R., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+tissue+metabolism:+3.+Study+of+tissue+fragments+with+little+or+no+added+aqueous+phase,+and+in+oils.">Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils.</a> Biochem. J. 57, 649-661 (1954).</li><li>Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly+in+the+absence+of+added+nucleotides.">Microtubule assembly in the absence of added nucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם ניגוד העניינים לגבי כל העבודה שנערכה בכתב היד הזה.

בזאת, טכניקה חוץ גופית בעבור הדור של microslices שיכול לשמש כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומוות של תאים בתיווך איסכמיה ברקמת מוח בוגרת בשלמותה הוא תאר. טכניקה זו מייצרת רקמת קיימא (איורים 1-3), שהיא מטבולית דומה לפרוסות organotypic גדו?...

הצורה הנפוצה ביותר של שבץ היא שבץ איסכמי, אשר מתרחש כאשר כלי דם במוח הופך להיות חסומים. איסכמיה הרקמות שתוצאה מהפסקת זרימת דם גורמת לשלילת קוטביות נרחבת של ממברנות, שחרור שליחים עצביים מעוררים, והעלאה מתמשכת של סידן תוך תאי, מה שמוביל להפעלה של מוות של תאי מסלולי 1. תהליך זה זכה לכינוי &#39;הפעלת יתר רעילה&#39;, והוא מסלול משותף מעורב במוות עצבי המיוצר על ידי מגוון רחב של פתולוגיות, כולל שבץ 2. עיכוב של מסלולי האיתות מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומפלי מוות של תאים עצביים אחרים הוא גישה מושכת להגביל את הנזק עצבי בעקבות שבץ מוחי. זיהוי המנגנונים המולקולריים המדויקים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ושבץ איסכמי יכול להיות קשה בעת שימוש במערכות של בעלי חיים כולה. ככזה עוברית ראשונית, ו( למשל neuroblasto &#39;כמו עצבי-&#39;קווים הונצחו ma ואדנוקרצינומה) מערכות תרבית תאים משמשים לעתים קרובות. היתרונות העיקריים של הדגמים האלה הם שהם קלים לתפעול, יחסית חסכוני, ומוות של תאים ניתן למדוד בקלות ונרשמת. עם זאת, ניתן לשנות מסלולי איתות על ידי תנאי culturing משמשים 3,4, ונוירונים בוגרים והנציחו קווים יכולים לבטא קולטנים שונים ומולקולות איתות בהשוואה להבשיל מוח 5-8. יתר על כן, נוירונים בתרבית רק לאפשר הבדיקה של סוג תא אחד (או שתיים, אם נעשה שימוש במערכת coculture), ואילו רקמות מוח שלמות היא הטרוגנית, המכילות מגוון של סוגי תאים הפועלים באינטראקציה אחד עם השני. מערכות פורסים תרבות Organotypic (explants הדק של רקמת המוח) משמשות גם, ומודלים אלה מאפשרים מחקר של אוכלוסיות הטרוגניות של תאים כפי שהם נמצאים בגוף חי. עם זאת, ניתן להשיג רק כמות מוגבלת של רקמות מכל בעל חיים בעת שימוש בטכניקה זו, פרוסות יכולותלא להיות מתורבת במשך זמן רב ככל שורות תאים הונצחו, ובינוני לתרבות לטווח הארוך יכול לגרום לשינויים במסלולי איתות וקולטנים בפרוסות. בעוד מוח בוגר יכול לשמש כדי ליצור פרוסות organotypic, פרוסות מהמוח בוגר הן נוחות יותר לתרבות, ויותר מנוצלים בדרך כלל. אין אפוא הצורך לפתח מודלים אשר לחקות או לייצג את המוח שלם בוגר, שהם קלים לשימוש, שבו ניתן לבחון את מסלולי איתות עצביים. בזאת, חוץ גופית בטכניקה מעורבת ברקמת עצבים בשלמותה, שניתן להשתמש על מנת להבהיר את המנגנונים מולקולריים המעורבים במותם של תאים הבאים עלבון הפעלת יתר רעיל או איסכמי מתוארת. טכניקה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים הנדרשים לביצוע ניסוי, הוא לשחזור, ויוצרת רקמת קיימא שמתנהגת בצורה מטבולית דומה לפרוסות organotypic גדולות יותר. בנוסף, המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ושיתוף postsynapticmpartment נותר בשלמותה בחלקו. החיץ הפיזיולוגי המשמש מאפשר קרום התא ל&#39;reseal &#39;, ומאפשר לתאים להתאושש התנגדות הקרום המקורית שלהם 9. מודל פרוסת מוח זה מסוגל לחקות בנאמנות תגובות שנצפו בעקבות ניזק מוחי הפעלת יתר רעילה בתיווך 10, וניתן להשתמש בם כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים מעורבים בשבץ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Guillotine</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used to decapitate animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain chopper</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to generate 100-400 &#956;m brain sections.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Round bottom plastic tubes</td>
			<td style="width:71px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For keeping tissue at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aerating apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flat bottomed polystyrene tubes</td>
			<td style="width:71px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dounce Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitotoxic stimulation of brain microslices as an in vitro model of stroke

בחינת מנגנונים מולקולריים מעורבים בתנאי נוירו, כגון שבץ איסכמי, יכול להיות קשה בעת שימוש במערכות של בעלי חיים כולה. ככזה, ראשוני או מערכות &#39;דמויות עצביות &quot;תא התרבות נמצאת בשימוש נרחב. בעוד שמערכות אלה קלות יחסית לעבוד איתו, ומערכות שימושיות מודל שבו תוצאות שונות תפקודיות (כגון מוות של תאים) ניתן לכמת בקלות, את התוצאות הנבחנות ומסלולים בנוירונים בוגרים בתרבית (כגון מסלולי מוות של תאים בתיווך הפעלת יתר רעילה) אינם בהכרח זהים לאלו שנצפו במוח בוגר, או ברקמה שלמה. לכן, יש הצורך לפתח מודלים שבו ניתן לבחון את המנגנונים תאיים ברקמה עצבית בוגרת. פיתחנו טכניקה במבחנה שיכול לשמש כדי לחקור מגוון רחב של מסלולים מולקולריים ברקמת עצבים בשלמותה. הטכניקה המתוארת במסמך זה מנצלת רקמת קליפת המוח חולדה, אך טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לשימוש רקמהממגוון רחב של מינים (כגון עכבר, ארנב, שפן ניסיונות, ועוף) או אזורים במוח (למשל, ההיפוקמפוס, סטריאטום, וכו &#39;). בנוסף, מגוון רחב של גירויים / טיפולים יכול לשמש (לדוגמא, הפעלת יתר רעיל, ממשל של מעכבים, וכו &#39;). לסיכום, מודל פרוסת המוח שתואר במסמך זה יכול לשמש כדי לבחון מגוון של מנגנונים מולקולריים המעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה.

Microslices שנוצר באמצעות הליך זה הוא בר קיימא, ומגוון רחב של מינים (לדוגמא, חולדה, עכבר, ועוף) יכולים לשמש לייצור microslices. שלושה צעדים עצמאיים של כדאיות כבר נוצלו: קצב נשימה (איור 1), יחסי נוקלאוטיד אדנין (איור 2), ותוכן אשלגן רקמות (איור 3). שימוש באמצע...

Watch this Scientific Journal Video about Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke at JoVE.com

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

פיתחנו מודל פרוסת מוח שבו ניתן להשתמש כדי לבחון מנגנונים מולקולריים מעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה. טכניקה זו יוצרת רקמת מוח בוגרת קיימא ומפחיתה את המספרים של בעלי חיים הנדרשים לניסויים, תוך שמירה על המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ותאי postsynaptic שלמים בחלקו.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

excitotoxic-stimulation-brain-microslices-as-an-vitro-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

8.4K Views.  The University of Newcastle.  פיתחנו מודל פרוסת מוח שבו ניתן להשתמש כדי לבחון מנגנונים מולקולריים מעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה. טכניקה זו יוצרת רקמת מוח בוגרת קיימא ומפחיתה את המספרים של בעלי חיים הנדרשים לניסויים, תוך שמירה על המעגלים עצביים, אינטראקציו...

Video: Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

ספיגה דו צדדי משותף עורק תרדמה כגירוי נפשית מראש מספיק כדי לגרום סובלנות איסכמי מוקדמת לאיסכמיה מוחית מיקוד

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

מודל Murine של תת עכבישי דימום

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations over time in the blood-oxygenation level dependent signal. rs-fcMRI has been applied extensively to identify abnormalities in brain connectivity in different neurologic and psychiatric diseases. However, the relationship among rs-fcMRI connectivity abnormalities, brain electrophysiology and disease state is unknown, in part because the causal significance of alterations in functional connectivity in disease pathophysiology has not been established. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a technique that uses electromagnetic induction to noninvasively produce focal changes in cortical activity. When combined with electroencephalography (EEG), TMS can be used to assess the brain's response to external perturbations. Here we provide a protocol for combining rs-fcMRI, TMS and EEG to assess the physiologic significance of alterations in functional connectivity in patients with neuropsychiatric disease. We provide representative results from a previously published study in which rs-fcMRI was used to identify regions with abnormal connectivity in patients with epilepsy due to a malformation of cortical development, periventricular nodular heterotopia (PNH). Stimulation in patients with epilepsy resulted in abnormal TMS-evoked EEG activity relative to stimulation of the same sites in matched healthy control patients, with an abnormal increase in the late component of the TMS-evoked potential, consistent with cortical hyperexcitability. This abnormality was specific to regions with abnormal resting-state functional connectivity. Electrical source analysis in a subject with previously recorded seizures demonstrated that the origin of the abnormal TMS-evoked activity co-localized with the seizure-onset zone, suggesting the presence of an epileptogenic circuit. These results demonstrate how rs-fcMRI, TMS and EEG can be utilized together to identify and understand the physiological significance of abnormal brain connectivity in human diseases.

Resting-state functional-connectivity MRI has identified abnormalities in patients with a wide range of neuropsychiatric disorders, including epilepsy due to malformations of cortical development. Transcranial Magnetic Stimulation in combination with EEG can demonstrate that patients with epilepsy have cortical hyperexcitability in regions with abnormal connectivity.

מולטימודליות Imaging- מבוסס גירוי אופן הערכת קישוריות הקשורות מוח רגיש בחולים עם אפילפסיה

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression (TRD). VNS exhibits antidepressive and stabilizing effects. This method is particularly useful as a long-term treatment, in which up to two-thirds of patients respond. The vagus nerve stimulator is positioned on the left vagus nerve during a surgical procedure and is activated telemetrically by a wand connected to a handheld computerized device. The treating physician can perform various adjustments of the vagus nerve stimulator during in-office visits (e.g., by modifying stimulation intensity or stimulation frequency) to achieve maximum therapeutic effects with low side effects. Set-up of the device usually takes several months. Typical side effects include wound infection, temporary salivation, coughing, paralysis of the vocal cords, bradycardia, or even asystole. The patient can stop the VNS by placing a magnet over the generator. The current protocol describes delivery of the specific stimulation tool and methods for adjusting the tuning parameters to achieve the best remission rates in patients with TRD.

Vagus nerve stimulation (VNS) has been shown to be effective as an adjunct treatment for treatment-resistant depression (TRD). VNS leads to antidepressive and antisuicidal effects and quality of life improvements. This protocol offers a step-by-step guide to managing and adjusting a vagus nerve stimulator for efficient treatment of TRD.

קוצב וגאלי ככלי בגירוי ניהולה עמיד לטיפול בדיכאון

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of brain stimulation presents several potential advantages compared to other techniques, as it is noninvasive, cost-effective, broadly deployable, and well-tolerated provided proper equipment and protocols are administered. Even though tDCS is apparently simple to perform, correct administration of the tDCS session, especially the electrode positioning and preparation, is vital for ensuring reproducibility and tolerability. The electrode positioning and preparation steps are traditionally also the most time consuming and error-prone. To address these challenges, modern tDCS techniques, using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes, reduce complexity and setup time while also ensuring that the electrodes are consistently placed as intended. These modern tDCS methods present advantages for research, clinic, and remote-supervised (at home) settings. This article provides a comprehensive step-by-step guide for administering a tDCS session using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes. This guide demonstrates tDCS using commonly applied montages intended for motor cortex and dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) stimulation. As described, selection of the head size and montage-specific headgear automates electrode positioning. Fully assembled pre-saturated snap-electrodes are simply affixed to the set position snap-connectors on the headgear. The modern tDCS method is shown to reduce setup time and reduce errors for both novice and expert operators. The methods outlined in this article can be adapted to different applications of tDCS as well as other forms of transcranial electrical stimulation (tES) such as transcranial alternating current stimulation (tACS) and transcranial random noise stimulation (tRNS). However, since tES is application specific, as appropriate, any methods recipe is customized to accommodate subject, indication, environment, and outcome specific features.

When administering transcranial direct current stimulation (tDCS), reproducible electrode preparation and placement are vital for a tolerated and effective session. The purpose of this article is to demonstrate updated modern setup procedures for the administration of tDCS and related transcranial electrical stimulation techniques, such as transcranial alternating current stimulation (tACS).

טכניקה מעודכנת עבור אמין, קל, ונסבל גירוי חשמלי Transcranial כולל Transcranial גירוי נוכחי ישיר

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...