وأيد هذا العمل عن طريق تمويل البحوث من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا، ومعهد البحوث الطبية هنتر، وجامعة نيوكاسل.

يتم تنفيذ كافة الإجراءات بموافقة من جامعة نيوكاسل رعاية الحيوان وجنة الأخلاقيات، وكذلك وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة، بما في ذلك قانون نيو ساوث ويلز بحوث الحيوان، والحيوان اللائحة بحوث نيو ساوث ويلز، وقانون الأسترالي الممارسة ل رعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية. 1. تشريح أنسجة المخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران الذكور اثني عشر الاسبوع القديمة عن طريق قطع الرأس. الفئران يمكن أن تكون إما من خلال التضحية مذهلة وقطع الرأس، أو يمكن تخدير الأولى مع isoflurane و(5٪ الاستقراء، صيانة 1.5-2٪) في 70٪ N 2 و 30٪ O 2، ثم مقطوعة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدماغ من الجمجمة بأسرع وقت ممكن (من الناحية المثالية، ينبغي أن يؤديها في أقل من 2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القشرة باليد خالية من تشريح. يجب أن يتم تنفيذ تشريح في الدنيا وقت ممكن، مع أقل قدر الضرر في الدماغ ممكن وذلك إلى maintain سلامة الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إزالة أي الجلد المتبقية، والفراء، والدم، وما إلى ذلك، تزج الدماغ في كمية صغيرة (3-5 مل) من 37 درجة مئوية كريبس العازلة (118 ملي كلوريد الصوديوم، 4.7 ملي كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم 1.3 ملي، 1.2 ملي البوتاسيوم هيدروجين فوسفات، 1.2 ملي كبريتات المغنيسيوم وكربونات الصوديوم 25 ملي الهيدروجين، 11.7 ملي الجلوكوز، 0.03 ملي الصوديوم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، معايرتها مع 95٪ أكسجين / ثاني أكسيد الكربون 5٪ (كربوجين)، ودرجة الحموضة 7.4). </li></ol> 2. إعداد Microslices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الدماغ على مرحلة من مراحل المروحية McIlwain التي وضعت شريحتين من ورق الترشيح ومبلل مع العازلة كريبس الدافئة. الحفاظ على الدماغ ورقة الترشيح مبلل مع العازلة كريبس الحارة، ولكن ليس الرطب حتى لا يكون هناك السائل الحرة على سطح الورق التي يمكن أن تسبب الدماغ إلى الشريحة حولها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة الدماغ إلى 250 ميكرومتر المقاطع الاكليلية. والمواد الغذائية والأكسجين، ومواد النفايات الفي يتم تبادلها عادة يتم تبادلها مع وصول الدم مع السائل الذي يحيط الأنسجة في الأنسجة العصبية معزولة، ينبغي أن حجم شرائح لا يكون أكثر من 400 ميكرون في سمك للسماح كافية الأوكسجين والمغذيات الصرف تحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المرحلة McIlwain 90 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة العقول إلى 250 ميكرومتر شرائح السهمي. هنا، هذه أقسام الدماغ (250 ميكرومتر X 250 ميكرون شرائح من طول متغير تبعا لسماكة الأنسجة) ويشار إليها باسم microslices. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع microslices في أنبوب أسفل مستديرة مع 10-15 مل 37 ° C العازلة كريبس (كمية العازلة كريبس استخدامها سوف يعتمد على كمية الأنسجة). </li></ol> 3. موازنة من Microslices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم بلطف حتى يتم تعليق microslices الفردية، ومن ثم تسمح لهم لتسوية في إطار الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف، والتي ستكون غائم مع وقف التنفيذ بسبب الحطام الخلية، وإضافة 10 مل الطازجة 37 ° Cكريبس العازلة للأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا الإجراء غسل أربع مرات، الأمر الذي سيؤدي في إزالة معظم الأنقاض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي أعقاب ذلك، تتوازن microslices عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف / انقلاب وتغيير كريبس العازلة كل 15 دقيقة لمدة 1 ساعة في المجموع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذا الوقت، إضافة 2 مل الطازجة العازلة 37 ° C كريبس، ونقل 15-20 microslices (150 ميكرولتر من تعليق microslice) لالبوليسترين مسطحة القاع 5 مل أنابيب باستخدام اضافية واسعة تحمل ماصة مع حواف ممهدة (والتي يمكن إنشاؤها من قبل قطع ~ 2 ملم من نهاية تلميح P1000). نشر microslices بالتساوي على قاعدة الأنبوب في طبقة واحدة، بحيث يكون لكل microslice ليس أبعد من بضعة ملليمترات من الغلاف الجوي الاوكسيجين. </li></ol> 4. تحفيز excitotoxic المواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان microslices عند 37 درجة مئوية، وتمرير باستمرار كربوجين على سطح تعليق 150 ميكرولتر microslice، وذلك باستخدام خط الغاز الذي هو موقفإد فقط فوق سطح التعليق microslice (لتجنب انقطاع الميكانيكية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج microslices مع 150 ميكرولتر إما 5 ملي الغلوتامات + 100 ميكرومتر الجلايسين في المخزن كريبس (التحفيز excitotoxic المواد: تركيز النهائي 2.5 ملم الغلوتامات + 50 ميكرومتر الجلايسين) أو 150 ميكرولتر العازلة كريبس وحده (التحكم nonstimulated). مجموعة متنوعة من المحفزات يمكن استخدامها في هذه الخطوة (بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، أمبا، NMDA + الجلايسين، بوكل الاستقطاب، والحرمان الأوكسجين / الجلوكوز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل الحضانة في أوقات مختلفة بعد التحفيز (0، 30، 60، 90، 120، و 300 ثانية)، واستبدالها 300 ميكرولتر من الجليد الباردة التجانس العازلة (30 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 1 ملم جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic، 4 ملي EDTA، و 100 ميكرومتر كربونات الأمونيوم، 5 ملي بيروفوسفات الصوديوم، 25 ملي فلوريد الصوديوم، 1 ملم orthovanadate الصوديوم، 1 ملم phenylmethanesulfonylfluoride، كاملة كوكتيل مثبط البروتياز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس microslices على الجليد، وذلك باستخدام الزجاج تفلون الخالط Dounce(20 السكتات الدماغية؛ 700 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر الخليط في -80 درجة مئوية، ومختلف الجزيئات يشير الى جزيئات الموت، وما يمكن أن تقاس طخة غربية. </li></ol>

<ol>
	<li>Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+challenges+and+opportunities+in+stroke.">Mechanisms, challenges and opportunities in stroke.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).</li><li>Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+excitotoxic+neuronal+death.">Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death.</a> Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).</li><li>Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cAMP/PKA+and+MAPK+signaling+in+neuronal+cells+is+dependent+on+developmental+stage.">Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage.</a> Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).</li><li>Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+effect+of+protein+synthesis+inhibitors+on+potassium+deficiency-induced+apoptotic+cell+death+in+immature+and+mature+neuronal+cultures.">Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures.</a> J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).</li><li>Kristensen, B. W., Noraberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+excitotoxic+profiles+of+ATPA,+AMPA,+KA+and+NMDA+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).</li><li>Lecrux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneously+hypertensive+rats+are+highly+vulnerable+to+AMPA-induced+brain+lesions.">Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions.</a> Stroke. 38, 3007-3015 (2007).</li><li>Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+influx+pathways,+not+calcium+load,+determine+neuronal+vulnerability+to+calcium+neurotoxicity.">Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity.</a> J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).</li><li>Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+central+nervous+system+models+of+mechanically+induced+trauma:+a+review.">In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).</li><li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Neurochemistry.">Practical Neurochemistry.</a> , (1975).</li><li>Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha+CaMKII+is+differentially+regulated+in+brain+regions+that+exhibit+differing+sensitivities+to+ischemia+and+excitotoxicity.">alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).</li><li>Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3H]MK-801+binding+in+immature+and+mature+chicken+forebrain.">3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).</li><li>Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+glutamate+receptor+stimulated+inositol+phospholipid+metabolism+and+45Ca(2+)-accumulation+in+posthatch+chicken+forebrain.">Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).</li><li>Sharps, E. S., McCarl, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatographic+method+to+measure+32P+incorporation+into+phosphorylated+metabolites+in+cultured+cells.">A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells.</a> Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).</li><li>Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurment+of+the+ADP:ATP+ratio+in+human+leukaemic+cell+lines+can+be+used+as+an+indicator+of+cell+viability,+necrosis+and+apoptosis.">Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis.</a> J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).</li><li>Rodnight, R., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+tissue+metabolism:+3.+Study+of+tissue+fragments+with+little+or+no+added+aqueous+phase,+and+in+oils.">Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils.</a> Biochem. J. 57, 649-661 (1954).</li><li>Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly+in+the+absence+of+added+nucleotides.">Microtubule assembly in the absence of added nucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).</li></ol>

يعلن الكتاب أن لديهم أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بأي من الأعمال التي تجري داخل هذه المخطوطة.

هنا، يوصف في المختبر تقنية لتوليد microslices التي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في التحفيز الزائدة وموت الخلايا بوساطة نقص التروية في أنسجة المخ سليمة ناضجة. هذه التقنية تنتج أنسجة قابلة للحياة (أرقام 1-3)، مشابهة لعملية الأيض شرائح عضوي ا...

الشكل الأكثر شيوعا من السكتة الدماغية هي السكتة الدماغية، والذي يحدث عندما تصبح الأوعية الدموية الدماغية المغطي. ونقص تروية الأنسجة التي تنتج عن توقف تدفق الدم يسبب الاستقطاب على نطاق واسع من الأغشية، والإفراج عن الناقلات العصبية مثير، والارتفاع المطرد من الكالسيوم داخل الخلايا، مما يؤدي إلى تفعيل مسارات موت الخلايا 1. وقد أطلق على هذه العملية &quot;التحفيز الزائدة &#39;، وهو الطريق الشائع متورطة في قتل الخلايا العصبية التي تنتجها مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك السكتة الدماغية 2. تثبيط مسارات الإشارات المشاركة في التحفيز الزائدة وغيرها من أجهزة الطرد المركزي موت الخلايا العصبية هو نهج جذابة للحد من الأضرار العصبية التالية السكتة الدماغية. يمكن تحديد الآليات الجزيئية الدقيقة التي تدخل في التحفيز الزائدة والسكتة الدماغية يكون من الصعب عند استخدام أنظمة الحيوان كله. على هذا النحو، الجنينية الأولية و&#39;مثل العصبية&#39; (على سبيل المثال neuroblastoأماه وغدية خطوط خلد) وغالبا ما تستخدم أنظمة خلية ثقافة. المزايا الرئيسية لهذه النماذج هي أنها سهلة للتلاعب، نسبيا فعالة من حيث التكلفة، وموت الخلايا يمكن قياسه بسهولة وquantitated. ومع ذلك، مسارات إشارات يمكن تغييرها بسبب الظروف زراعة المستخدمة 3،4، والخلايا العصبية غير ناضجة وخلد يمكن التعبير عن مستقبلات خطوط مختلفة والجزيئات مما يشير إلى أن تنضج عند مقارنة الدماغ 5-8. علاوة على ذلك، تسمح فقط الخلايا العصبية مثقف دراسة نوع خلية واحدة (أو اثنين، إذا تم استخدام نظام coculture)، في حين أن أنسجة المخ سليمة غير المتجانسة، التي تحتوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا التي تتفاعل مع بعضها البعض. كما تستخدم نظم عضوي النمط ثقافة شريحة (إإكسبلنتس رقيقة من أنسجة المخ)، وهذه النماذج تسمح دراسة السكان غير متجانسة من الخلايا كما وجدوا في الجسم الحي. ومع ذلك، فقط كمية محدودة من الأنسجة يمكن الحصول عليها من كل حيوان عند استخدام هذه التقنية، يمكن أن شرائحلا يمكن تربيتها لطالما خطوط الخلايا خلد، والمتوسطة لثقافة على المدى الطويل يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في مسارات الإشارات والمستقبلات في شرائح. في حين الدماغ ناضجة يمكن استخدامها لتوليد شرائح عضوي النمط، وشرائح من الدماغ غير ناضجة هي أكثر استعدادا للثقافة، وتستخدم أكثر شيوعا. وبالتالي هناك حاجة لتطوير نماذج التي تحاكي أو تمثل الدماغ ناضجة سليمة، والتي هي سهلة الاستخدام، والتي مسارات الإشارات العصبية يمكن فحصها. هنا، يوصف في المختبر تقنية تنطوي على الأنسجة العصبية سليمة والتي يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية المشاركة في موت الخلايا التالية إهانة excitotoxic المواد أو الدماغية. هذا الأسلوب يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لإجراء التجربة، هو استنساخه، ويولد أنسجة قابلة للحياة أن يتصرف بطريقة مماثلة لعملية الأيض شرائح عضوي النمط أكبر. بالإضافة إلى ذلك، فإن الدوائر العصبية والتفاعلات الخلوية، وشارك بعد المشبكييبقى mpartment سليمة جزئيا. المخزن المؤقت الفسيولوجية تستخدم يسمح أغشية الخلايا إلى &#39;إعادة الختم &quot;، وتمكن خلايا للتعافي الأصلية مقاومة الغشاء 9. هذا النموذج شريحة الدماغ قادر على تقليد بأمانة الردود احظ التالية التحفيز الزائدة بوساطة إصابات الدماغ 10، ويمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في السكتة الدماغية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Guillotine</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used to decapitate animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain chopper</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to generate 100-400 &#956;m brain sections.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Round bottom plastic tubes</td>
			<td style="width:71px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For keeping tissue at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aerating apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flat bottomed polystyrene tubes</td>
			<td style="width:71px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dounce Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitotoxic stimulation of brain microslices as an in vitro model of stroke

دراسة الآليات الجزيئية المشاركة في ظروف نيوروباثولوغيكال، مثل السكتة الدماغية، ويمكن أن يكون من الصعب عند استخدام أنظمة الحيوان كله. على هذا النحو، أو الأولية &#39;مثل العصبية&#39; نظم زراعة الخلايا تستخدم عادة. في حين أن هذه النظم هي سهلة نسبيا للعمل مع، وتكون نموذجا مفيدا في نظم فيه مختلف النتائج الفنية (مثل موت الخلايا) يمكن أن يكون كميا بسهولة، ونتائج فحص والممرات في الخلايا العصبية غير ناضج مثقف (مثل مسارات موت الخلايا بوساطة التحفيز الزائدة) ليست بالضرورة هي نفس تلك التي لوحظت في الدماغ ناضجة، أو في أنسجة سليمة. وبالتالي، هناك حاجة لتطوير نماذج التي الآليات الخلوية في الأنسجة العصبية الناضجة يمكن فحصها. قمنا بتطوير تقنية في المختبر والتي يمكن استخدامها لتحقيق مجموعة متنوعة من المسارات الجزيئية في النسيج العصبي سليمة. تقنية الموضحة في هذه الوثيقة تستخدم الأنسجة القشرية الفئران، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها لاستخدام الأنسجةمن مجموعة متنوعة من الأنواع (مثل الماوس، الأرنب، خنزير غينيا، والدجاج) أو مناطق الدماغ (على سبيل المثال، الحصين، المخطط، الخ). بالإضافة إلى ذلك، مجموعة متنوعة من التحفيز / العلاجات يمكن استخدامها (على سبيل المثال، excitotoxic المواد، وإدارة مثبطات، الخ). في الختام، ونموذج شريحة الدماغ الموصوفة هنا يمكن استخدامها لدراسة مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية المشاركة في إصابات الدماغ بوساطة التحفيز الزائدة.

Microslices إنشاؤها باستخدام هذا الإجراء هي قابلة للحياة، ومجموعة متنوعة من الأنواع (على سبيل المثال، الفئران، والماوس، والدجاج) يمكن استخدامها لإنتاج microslices. وقد تم استخدام ثلاثة تدابير مستقلة عن جدوى: معدل التنفس (الشكل 1)، ونسب الأدينين النوكليوتيدات (الش?...

Watch this Scientific Journal Video about Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke at JoVE.com

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

قمنا بتطوير نموذج شريحة الدماغ والتي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في إصابات الدماغ بوساطة التحفيز الزائدة. هذا الأسلوب يولد أنسجة المخ ناضجة قابلة للحياة، ويقلل من أعداد الحيوانات المطلوبة لإجراء التجارب، في حين الحفاظ على الدوائر العصبية، والتفاعلات الخلوية، ومقصورات بعد المشبكي سليمة جزئيا.

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

excitotoxic-stimulation-brain-microslices-as-an-vitro-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

8.4K Views.  The University of Newcastle.  قمنا بتطوير نموذج شريحة الدماغ والتي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في إصابات الدماغ بوساطة التحفيز الزائدة. هذا الأسلوب يولد أنسجة المخ ناضجة قابلة للحياة، ويقلل من أعداد الحيوانات المطلوبة لإجراء التجارب، في حين الحف?...

Video: Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

الثنائية انسداد الشريان السباتي المشترك باعتباره المحفز شروط مسبقة كافية للحث على التسامح الدماغية المبكرة إلى نقص التروية الدماغية البؤري

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

A نموذج من الفئران تحت العنكبوتية نزف

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه<em&gt; في المختبر</em&gt; صدمة إصابات الدماغ نموذج من حاجز الدم في الدماغ

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

وضع ما يصل إلى<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الفئران حاجز الدم في الدماغ (BBB): التركيز على BBB عدم النفاذ والنقل مستقبلات بوساطة

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

الأوكسجين الجلوكوز الحرمان وعودة التأكسج باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; الإسكيمية-ضخه من الإصابات نموذج لدراسة الدم في الدماغ الحاجز الجنسي لدى الرجال

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations over time in the blood-oxygenation level dependent signal. rs-fcMRI has been applied extensively to identify abnormalities in brain connectivity in different neurologic and psychiatric diseases. However, the relationship among rs-fcMRI connectivity abnormalities, brain electrophysiology and disease state is unknown, in part because the causal significance of alterations in functional connectivity in disease pathophysiology has not been established. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a technique that uses electromagnetic induction to noninvasively produce focal changes in cortical activity. When combined with electroencephalography (EEG), TMS can be used to assess the brain's response to external perturbations. Here we provide a protocol for combining rs-fcMRI, TMS and EEG to assess the physiologic significance of alterations in functional connectivity in patients with neuropsychiatric disease. We provide representative results from a previously published study in which rs-fcMRI was used to identify regions with abnormal connectivity in patients with epilepsy due to a malformation of cortical development, periventricular nodular heterotopia (PNH). Stimulation in patients with epilepsy resulted in abnormal TMS-evoked EEG activity relative to stimulation of the same sites in matched healthy control patients, with an abnormal increase in the late component of the TMS-evoked potential, consistent with cortical hyperexcitability. This abnormality was specific to regions with abnormal resting-state functional connectivity. Electrical source analysis in a subject with previously recorded seizures demonstrated that the origin of the abnormal TMS-evoked activity co-localized with the seizure-onset zone, suggesting the presence of an epileptogenic circuit. These results demonstrate how rs-fcMRI, TMS and EEG can be utilized together to identify and understand the physiological significance of abnormal brain connectivity in human diseases.

Resting-state functional-connectivity MRI has identified abnormalities in patients with a wide range of neuropsychiatric disorders, including epilepsy due to malformations of cortical development. Transcranial Magnetic Stimulation in combination with EEG can demonstrate that patients with epilepsy have cortical hyperexcitability in regions with abnormal connectivity.

والمتعدد الوسائط Imaging- والقائم على تحفيز أسلوب تقييم الربط المتعلقة الدماغ استثارة في المرضى الذين يعانون من الصرع

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

حديثي الولادة الفئران كوكلار تقنية إكسبلانت باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; أداة الفحص في أبحاث السمع

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression (TRD). VNS exhibits antidepressive and stabilizing effects. This method is particularly useful as a long-term treatment, in which up to two-thirds of patients respond. The vagus nerve stimulator is positioned on the left vagus nerve during a surgical procedure and is activated telemetrically by a wand connected to a handheld computerized device. The treating physician can perform various adjustments of the vagus nerve stimulator during in-office visits (e.g., by modifying stimulation intensity or stimulation frequency) to achieve maximum therapeutic effects with low side effects. Set-up of the device usually takes several months. Typical side effects include wound infection, temporary salivation, coughing, paralysis of the vocal cords, bradycardia, or even asystole. The patient can stop the VNS by placing a magnet over the generator. The current protocol describes delivery of the specific stimulation tool and methods for adjusting the tuning parameters to achieve the best remission rates in patients with TRD.

Vagus nerve stimulation (VNS) has been shown to be effective as an adjunct treatment for treatment-resistant depression (TRD). VNS leads to antidepressive and antisuicidal effects and quality of life improvements. This protocol offers a step-by-step guide to managing and adjusting a vagus nerve stimulator for efficient treatment of TRD.

تحفيز العصب المبهم كأداة نيوروستيموليشن مرافقة في الاكتئاب المقاوم للعلاج

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of brain stimulation presents several potential advantages compared to other techniques, as it is noninvasive, cost-effective, broadly deployable, and well-tolerated provided proper equipment and protocols are administered. Even though tDCS is apparently simple to perform, correct administration of the tDCS session, especially the electrode positioning and preparation, is vital for ensuring reproducibility and tolerability. The electrode positioning and preparation steps are traditionally also the most time consuming and error-prone. To address these challenges, modern tDCS techniques, using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes, reduce complexity and setup time while also ensuring that the electrodes are consistently placed as intended. These modern tDCS methods present advantages for research, clinic, and remote-supervised (at home) settings. This article provides a comprehensive step-by-step guide for administering a tDCS session using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes. This guide demonstrates tDCS using commonly applied montages intended for motor cortex and dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) stimulation. As described, selection of the head size and montage-specific headgear automates electrode positioning. Fully assembled pre-saturated snap-electrodes are simply affixed to the set position snap-connectors on the headgear. The modern tDCS method is shown to reduce setup time and reduce errors for both novice and expert operators. The methods outlined in this article can be adapted to different applications of tDCS as well as other forms of transcranial electrical stimulation (tES) such as transcranial alternating current stimulation (tACS) and transcranial random noise stimulation (tRNS). However, since tES is application specific, as appropriate, any methods recipe is customized to accommodate subject, indication, environment, and outcome specific features.

When administering transcranial direct current stimulation (tDCS), reproducible electrode preparation and placement are vital for a tolerated and effective session. The purpose of this article is to demonstrate updated modern setup procedures for the administration of tDCS and related transcranial electrical stimulation techniques, such as transcranial alternating current stimulation (tACS).

تحديث تقنيه لتحفيز الكهربائية موثوقه وسهله والتسامح جمجمة بما في ذلك جمجمة التحفيز الحالي المباشر

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...