המחברים מבקשים להודות על התרומה הטכנית של גלוריה נאווידס. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), סיבוכי NIDDK סוכרתיים Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 מענק (VDU subaward), וDK079337 אובריאן מרכז P30 (VDU).

כל הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה לאיסוף דם, בידוד וניתוח כבר נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון סקירה המוסדי באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם. 1. בידוד תא (השתנה מHistopaque סיגמא אולדריץ פרוטוקול מס 1119 וMiltenyi יוטכנולוגיים microbead חיובי ופרוטוקולי סלקציה שליליים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם צנטריפוגה כולו (שנאסף בACD או צינורות EDTA) בשעה XG 500 במשך 15 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור מתנדנד דלי (תאוצה = 5-6, ולא בלם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את השכבה העליונה המכילה פלזמה העשירה טסיות (PRP) עם טפטפת העברה עד 1 סנטימטר נשאר מעל שכבת התאים (מעיל כדורית אדומה / באפי). מניח בצד PRP בטמפרטורת חדר לעיבוד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המעיל באפי לצינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי, לדלל ל24 מיליליטר עם RPMI הבסיסי או לפחות 4x מתחיל באפי מעיל הנפח. הערה: חיצו העליון של שכבת RBC עשוי have להיכלל אם כי זה יגרום להגדלת נפח RPMI באופן יחסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שיפוע הצפיפות באמצעות צפיפות נמוכה Ficoll עם משקל סגולי של 1.077 (1077) לשכבה העליונה וFicoll צפיפות הגבוהה עם משקל סגולי של 1.119 (1119) לשכבה התחתונה בשלושה צינורות 15 מיליליטר חרוטי (3 מיליליטר כל אחד). כדי לבצע שלב זה, להוסיף ראשון 1077 לצינור אחד. בעזרת פיפטה צרה 5 מיליליטר להוסיף 1119 לחלק התחתון של הצינור על ידי הצבת קצה פיפטה מתחת 1077 ולאט לאט לשחרר מגיב ללא ערבוב עם השיפוע העליון. סכום כולל של 6 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות צריך להיות נוכח בשלב זה עם שלב גלוי של הפרדה בסימן מיליליטר 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה אוטומטית, להוסיף 8 מיליליטר של דם מדולל (משלב 1.3) בעדינות על צינור אחד שיפוע באמצעות הגדרת צריכת החשמל הנמוך כדי למנוע מלהפריע לשכבות הצבע. הנפח הכולל צריך להיות 14 מיליליטר בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה ב XG 700 ל30 דקות בטמפרטורת חדר (acceleמנה 6, לא בלם). הערה: בשלב זה, שלוש להקות תא נפרדות צריכים להיות (איור 1 א) מאליו. הלהקות העליונות (בין 1077 ופלזמה) מכילה תאים חד גרעיניים (MNC) וטסיות דם, והלהקה באמצע (בין 1007 ו1119) מכיל תאי polymorphonuclear (PMNs) ורצועה תחתונה (מתחת 1119) מכיל תאי דם אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את MNC וPMN בנפרד באמצעות טפטפות זכוכית סטרילית מבלי להפריע להקות תא האחרות. לשלב את אוכלוסיית MNC מצינור לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי. חזור על פעולה זו עבור אוכלוסיית PMN גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 כרכים של RPMI על צינור אחד המכיל את השברים MNC וPMN בהתאמה לדלל את שיפוע הצפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה ב XG 700 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה resuspend MNC תא ותא גלולה PMN בRPMI 1 מיליליטר מכיל 0.5% אולטרה טהור שומן נטול חומצת BSA (RPMI-BSA) ולהעביר לסטרילי 1.5 צינורות מיליליטר. גלולה התאים באמצעות picofuge המעבדתיים ל30שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend כל גלולה תא ב80 μl RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של נוגדן שכותרת antiCD14 חרוז המגנטי לצינור המכיל את חלק MNC לסלקציה חיובית של מונוציטים. לצינור המכיל את החלק היחסי של תאי PMN, להוסיף 20 μl של נוגדן שכותרת antiCD15 חרוז המגנטי לסלקציה חיובית של נויטרופילים. דגירה כל השעיה תא ל15 דקות ב 4 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל השעיה תא עם 1 מיליליטר תקשורת RPMI-BSA וגלולה כמו קודם וresuspend כל גלולה ב500 μl RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי שכותרתו מופרדים בשדה המגנטי של תא מגנטי מיון הפעיל מפריד (MACS). הכן את עמודות LS MACS (אחד לכל השעיה תא) על ידי הצבת הטור על מפריד MACS וכביסה עם 3 מיליליטר של RPMI-BSA לפני הוספת ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החלת השעיות תא, לשטוף כל עמודה 3x עם 3 מיליליטר של תקשורת RPMI-BSA (לוודא לתת דראי התקשורתn בין שוטף לחלוטין). אסוף את ההשעיה תא זרימה דרך שטיפות עמודה לתוך צינור סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד מונוציטים ונויטרופילים, להסיר את העמודה מהשדה המגנטי לאחר לשטוף הסופי וelute התאים חיובי שנבחרו לתוך צינור סטרילי עם 5 מיליליטר של RPMI-BSA באמצעות בוכנת העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד ימפוציטים גלולה שבריר זרימה דרך השטיפה של MNCs מצעד 1.15 XG 300 10 דקות. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 80 RPMI-BSA. הוסף 20 μl של נוגדני CD61 וCD235a דגירה תא השעיה ל15 דקות ב 4 º C. חזור על הפרדת MACS כמו קודם ולאסוף את הזרימה למרות שמכיל לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי גלולה מונוציטים, נויטרופילים, ושברים לימפוציטים, צנטריפוגות כמו קודם (שלב 1.9) וזורקים supernatants. כדורי תא צריכים להיות מושעים ב 1 מיליליטר תאי שטף תקשורת (XF-DMEM) לספירה. &lt;br /&gt; הערה: 8 מיליליטר של דם מלא צריך לגרום 1-5 x 10 6 מיליליטר מונוציטים / ו5-20 x 10 ימפוציטים 6 ונויטרופילים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד טסיות דם, PRP צנטריפוגה (שלב 1.2) עבור 8-10 דקות ב 1,500 XG בטמפרטורת חדר. הסר את הפלזמה ולשטוף תא גלולה פעם אחת עם 5 מיליליטר סטרילי PBS בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מיליליטר PGI 2, repellet ולהשעות גלולה סופית ב 1 מיליליטר של PBS-PGI חיץ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ספירת הטסיות על ידי turbidimetry פעם טסיות מושעות ב-PBS-PGI חיץ 2 על ידי ספקטרופוטומטר כפי שתוארו על ידי Walkowiak אח&#39; באמצעות המשוואה הבאה: [6.23 / (2.016 - אבס 800)] - 3.09 גורם לדילול x = # x 10 8. טסיות דם / מיליליטר 12. </li></ol> 2. ציפוי של התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Cell-Tak (דבק תא): הוסף דבק תא 90 μl 180 μl diH 2 0, 540 μl של 0.1 N דו נתרןקרבונט (pH 8.0), ולהתאים את ה-pH ל 7.2-7.8 באמצעות 1 N NaOH. הכן את צלחות XF (24 גם, V7 microplates) על ידי ציפוי היטב עם כל 30 μl של דבק תא מוכן. הערה: דבק התא צריך להיות מוכן טרי לכל שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת על 37 º C ל20-30 אז דבק תא לשאוב דקות ולשטוף בארות עם PBS פעמיים (1 מיליליטר / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים במונוציטים המבודדים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם ומביא לנפח מתאים באמצעות XF-DMEM כדי לאפשר צפיפות זריעה של 250k תאים / גם למונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים ו, ו25 x 10 6 / גם לטסיות דם. לחלופין, כדי למדוד את תגובת פרץ חמצוני, ניתן זורעים הנויטרופילים ב125k תאים / היטב. זריעת הנפח הסופי עבור כל השעיה תא צריך להיות 200 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 ל1 שניות ללא בלם. סובב את הצלחת 180 ˚ ו צנטריפוגות שוב עם בלם לא ב300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא כרך גם סופיUme ל660 μl עם XF-DMEM ולדגור על 37 º C למשך 30 דקות לפני assay XF. הערה: Photomicrographs של תאים מצופים לפני ואחרי assay יכול לשמש כדי להבטיח ציפוי הולם ולשלול ניתוק תא. </li></ol> 3. הכנת 24 גם פלייט התאי השטף Assay (XF24) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה XF בדיקות עם פתרון calibrant למינימום של 2 שעות לפני assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10x מניות של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר oligomycin, 0.6 מיקרומטר FCCP, ו10 מיקרומטר antimycin בXF-DMEM ועומס 75 μl של פתרונות מניות ליציאות הזרקת דיו בצו הנ&quot;ל. אם מדידות פרץ חמצוני הן שיתקבל, הזרקה של 10x המניה של 100 PMA מיליליטר / ng ניתן להזריק אחרי antimycin-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את מחסנית התייבשות וטעונה ולבצע את assay XF. השיטות מפורטות לניתוח ופרשנות של שינויים הן את צריכת החמצן וחומציות תוארו בפרסומים קודמים 9,13,14 ואינם דiscussed בפירוט כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay XF, לשאוב את כל אבל 50 μl האחרון של XF-DMEM אחרי assay כדי למנוע אובדן של תאים מהצלחת ולהוסיף 50 מאגר תמוגה תא μl הריף ולבצע assay חלבון לנורמליזציה. </li></ol>

<ol>
	<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cognitive+impairment,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).</li><li>Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+mitochondrial+quality+control,+and+oncogenesis.">Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis.</a> Autophagy. 2, 80-84 (2006).</li><li>Cordero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients:+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease.">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).</li><li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5'-triphosphate+synthase+activity.">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li><li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+membrane+potential,+mass,+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes.">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ageing+and+Alzheimer's+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets.">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li><li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins.">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li><li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy.">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li><li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autoimmunity,+arthritis,+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene.">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li><li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections:+case+report.">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li><li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation.">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).</li></ol>

VDU הוא חבר של סוסון ים Bioscience המדעי המייעץ.

פרוטוקול זה מייצג את האוסף של כמה טכניקות מנוצלים בדרך כלל לבידוד תאי דם באופן מתאים לניתוח bioenergetics. הטכניקות רציפות שהוצגו הן יתרון לשיטות אחרות בידוד (כלומר ניתוח FACS) ליכולת שלהם לבודד מספר גדול של תאים בתנאי תקשורת מבוקרים עם לחצים מינימאליים מונחים על התאים המבודדים. יש לו את החסרון של בידודים ממושכים גם עם הפרעות מינימליות. פרוטוקול זה משמש כבסיס לבידוד של תאי דם עיקריים מבני אדם, שניתן להסיק להגדרות קליניות ומחקר translational. הפרדת MACS היא טכניקת בידוד תא אמינה שמציעה את האפשרות של בידוד תאים ישירות מדם כולו, עם זאת, שיטה זו דורשת כמויות גדולות יותר של נוגדנים ואינה אופטימלי לבידוד של כל ארבעת סוגי התאים שונים כפי שמתוארים בשיטה זו. שם יש בeen אין ראיות כדי להראות שהסלקציה החיובית של לויקוציטים ידי תוצאות הפרדת MACS בהפעלה באמצעות פרוטוקול הבידוד שלנו. עמודות MACS לפעול באמצעות קיבוע של תאים שכותרתו בשדה מגנטי באמצעות נוגדנים מצומדות כדי 50 חלקיקי פאראמגנטי ננומטר. לאחר מכן תאים שכותרתו eluted את הטור. בחירות חיוביות ושליליות מיושמות בפרוטוקול זה כדי להבטיח בידוד וטוהר מהירים. אם מספרי תא לקויים מתקבלים מבידוד או טוהר הוא בשאלה, ניתן להוסיף יותר נוגדנים למדגם לפי ההוראה של הספק והמעבר שני דרך עמודת LS עלול לגרום לטוהר גבוה יותר (טבלה 2). המעבדה שלנו מצאה טוהר גבוה ויעילות ציפוי באמצעות הפרוטוקול הקיים על ידי ניתוח השעיות תא סופיים על ידי ניתוח FACS 8. יש מנתחי שטף תאיים היכולת לפקח גם צריכת חמצן והחמצת תקשורת בזמן אמת מעל זה של otאלקטרודות. צריכת החמצן כפי שנצפה על ידי תגובת פרץ חמצוני במונוציטים ונויטרופילים היא מונואמין NADPH תלוי כפי שמוצג על ידי עיכוב עם DPI 8. שראינו בהפסד תלוי בזמן בקיבולת פרץ חמצוני עם בידודים ממושכים או מבחני XF מורחבים. פרוטוקול זה תוכנן ופותחו לשימוש בXF24 אבל גם תואם עם XF96 כבשליש עד חצי מהתא XF24 זריעת צפיפות (איור 3). בעיצוב של פרוטוקול זה, היצמדות לפרוטוקולים קיימים עבור כל טכניקה הנדרשת לביצועים אופטימליים עם שינויים שנעשו אך ורק כדי לשלוט בתנאי תקשורת לניתוח bioenergetic. לאחר שליטה בטכניקות, פרוטוקול כזה יכול לשמש במגוון רחב של יישומי translational ומחקר כדי למדוד את הרעילות או יעילות של אסטרטגיות טיפול, לחקור מאפיינים המטבולי של מחלה, וייצור חמצון על ידי מונוציטים וneutrophils במצבים דלקתיים.

ניטור בריאות bioenergetic של תאים חיסוניים (מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים) וטסיות דם מהוכר במשך זמן מה ככלי אבחון שעשוי להיות שימושיים כדי להעריך את בריאות bioenergetic הכללית של אדם. יש גוף מתעוררים של ספרות מייחס מספר המחלות כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם ומחלות ניווניות ל1,2 תפקוד המיטוכונדריה. זה חשוב מבחינה קלינית מאז תפקוד המיטוכונדריה יכול ליזום סדרה של אירועים הסלולר שיקדמו מסלולי איתות הפרו דלקתיים או להוביל למוות של תאים. מספר מחקרים מאופיינים תפקוד המיטוכונדריה של תאים היקפיים mononuclear הדם וטסיות דם במצבים כגון פיברומיאלגיה, סוכרת, הלם ספטי, והמחלה 3-7 אלצהיימר. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה העריך את bioenergetics של טסיות דם כסמן לתפקוד המיטוכונדריה ומצא כי טסיות דם מסוג 2 Diabetחולי ic פחתו 7,8 צריכת החמצן במיטוכונדריה. מממצאים אלה ואחרים, ברור שמונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם יכולים לשמש כסמנים פונדקאיות כשינויים בbioenergetics תחת מצבים פתולוגיים שכן הם יסקור את מחזור הדם המערכתי ועשויים לשקף שינויים מטבוליים מקומיים והעולמיים. כדי לקבוע אם גישה זו יש ערך פרוגנוסטי או אבחון בשיטת תפוקה גבוהה של ניתוח ושיטה עקבית להכנת תא נדרשת. השיטות כדי למדוד את התפקוד המיטוכונדריה בלויקוציטים וטסיות דם שמעורבים בעבר בידוד של המיטוכונדריה או הערכה של bioenergetics הסלולר בתאים שלמים 4,9. היתרון של הערכת bioenergetic הסלולרית באמצעות שטף תאי מנתח (XF) הוא שהפונקציה של המיטוכונדריה בתאים ניתן להקים עם מצעי אנדוגני ופרמטרי נשימה כגון דליפת פרוטון ונשימה מקסימליקיבולת ניתן לקבוע. אנו ואחרים השתמשו בטכנולוגיה זו כדי להראות שפרופילי bioenergetic בטסיות דם, ניתן להקים מונוציטים ולימפוציטים מבודדים מהדם של בני אדם והשוואה בין סוגי תאים 8. בנוסף, שניהם נויטרופילים ומונוציטים בעלי קיבולת פרץ חמצוני בי oxidases NAPDH מופעלים וצורכים חמצן ליצירת superoxide. חשוב מכך, מסלול זה הוא מרכיב מרכזי של חסינות מולדת, והוא מווסת על ידי דלקת מערכתית. לדוגמא, זה כבר הראה כי שינויים בקיבולת פרץ חמצוני קשורים עם מחלות אוטואימוניות שונות, כגון טרשת נפוצה, דלקת פרקים, וזיהומים חוזרים ונשנים 10,11. כרגע אין מבחני כמותיים תפוקה גבוהה זמינים כדי למדוד את פרץ חמצוני בדגימות קליניות. זה חשוב מכיוון שמאפיין את קיבולת פרץ חמצוני של נויטרופילים ומונוציטים יכולים גם לשמש ככלי אבחונים חשובים מכמה patholoחיס. האתגרים הטכניים המפתח היו רגישות נמוכה למדידה של צריכת חמצן תוך שימוש בטכניקות polarographic קונבנציונליות ואת הצורך להשתמש בתאים מצורפים בעת שימוש בטכניקות fluorometric microplate רגישות יותר. בסרטון מעשי זה, אנו מתארים את הפתרון הטכני לבעיות אלו. אנחנו פירוט השיטות לבידוד, ציפוי והמדידה של bioenergetics של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם ופרץ חמצוני של מונוציטים ונויטרופילים מהדם אנושי. שיטה זו מתאימה להערכה קלינית של bioenergetics ופרץ חמצוני לחוקרים שיש להם גישה לאוכלוסייה מטופלת ואת היכולת להשיג דגימות דם טריות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-094-833</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"><a name="RANGE!A3">CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</a></td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-501</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD61 MicroBeads, human&#160; for platelets</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-051-101</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD14 MicroBeads, human&#160; for monocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-201</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD15 MicroBeads, human&#160; for granulocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-046-601</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">LS Columns</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-042-401</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">02-684-26</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">11835-030</td>
			<td style="width:215px;">with L-glutamine and without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Prostaglandin I2, sodium salt</td>
			<td style="width:215px;">Cayman</td>
			<td style="width:215px;">18220</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">1.5 ml semi-micro cuvettes</td>
			<td style="width:215px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:215px;">SC-2410</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">10771</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">11191</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:215px;">Roche</td>
			<td style="width:215px;">3117405001</td>
			<td style="width:215px;">fatty-acid ultra-free</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8139</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">100850-001</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">MT90113PB</td>
			<td style="width:215px;">w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">L-Glutamine, 200mM (100x)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">G7528</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8574</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Cell-Tak (cell adhesive)</td>
			<td style="width:215px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">CB-40242</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">O4876</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A8674</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C-2920</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent A</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0113</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent S</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0015</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent B</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0114</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Vendor</td>
			<td style="width:215px;">Product #</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Seahorse</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-090-976 and 24039</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

תפקוד המיטוכונדריה ידוע לשחק תפקיד משמעותי במספר מצבים פתולוגיים כגון טרשת עורקים, סוכרת, הלם ספטי, ומחלות ניווניות אך הערכת שינויים בתפקוד bioenergetic בחולים מאתגרת. למרות שמחלות כמו סוכרת או טרשת עורקים הנוכחית קליניות עם ליקוי איבר מסוים, רכיבים מערכתיים של פתולוגיה, כגון היפרגליקמיה או דלקת, יכולים לשנות את תפקוד bioenergetic במחזור לויקוציטים או טסיות דם. תפיסה זו זכתה להכרה לכמה זמן, אבל היישום הנרחב שלה כבר מוגבל על ידי המספר הגדול של תאים ראשוניים הנדרשים לניתוח bioenergetic. מגבלה טכנית זו כבר להתגבר על ידי שילוב ספציפי של הטכניקות מגנטי בידוד חרוז, טכניקות הידבקות תא, המאפשרות לתאים שיצורפו ללא הפעלה לmicroplates, והרגישות של טכנולוגיות חדשות המיועדות למיקרופון תפוקה גבוההrespirometry roplate. דוגמא לציוד זה היא מנתח השטף תאי. מכשור כזה משתמש בדרך כלל בדיקות רגישות חמצן וה-pH למדידת שיעורי השינוי בפרמטרים האלה בתאים חסיד, אז מה שיכול להיות קשור לחילוף חומרים. כאן אנו מפרטים את השיטות לבידוד והציפוי של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם, ללא הפעלה, מהדם של בני אדם והניתוח של תפקוד bioenergetic המיטוכונדריה בתאים אלה. בנוסף, אנו מדגימים כיצד חמצוני פרצו במונוציטים ונויטרופילים יכולים גם להימדד בדגימות אותו. מאז שיטות אלה להשתמש רק 8-20 מיליליטר דם אדם שיש להם פוטנציאל לניטור דור חמצן מגיב מינים וbioenergetics בסביבה קלינית.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets at JoVE.com

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

bioenergetics-oxidative-burst-protocols-for-isolation-evaluation

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.9K Views.  University of Alabama at Birmingham.  כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה. 

Video: Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect of breast milk (BM). Unless access to clean water and appropriate infant formula is reliable, the WHO does not recommend cessation of breastfeeding for HIV-infected mothers. Numerous factors likely work in tandem to reduce BM transmission. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though what remains largely unclear is the contribution of these cells to the antiviral qualities of BM. Presently we aimed to isolate cells from human BM in order to measure antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), one of the most essential and pervasive innate immune responses, by BM phagocytes against HIV targets. Cells were isolated from 5 human BM samples obtained at various stages of lactation. Isolation was carried out via gentle centrifugation followed by careful removal of milk fat and repeated washing of the cell pellet. Fluorescent beads coated with HIV envelope (Env) epitope were used as targets for analysis of ADCP. Cells were stained with the CD45 surface marker to identify leukocytes. It was found that ADCP activity was significant above control experiments and reproducibly measurable using an HIV-specific antibody 830A.

Breast milk transmits human immunodeficiency virus (HIV), though only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though these cells are understudied. Here we describe the isolation of breast milk leukocytes and an analysis of their phagocytic capacity.

בידוד של לוקיולוציטים מחלב השד האנושי לשימוש בנוגדן-מותנה תאית הסלולר שיטת מטרות HIV

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...